Appunti Biologia molecolare

LEZIONE 7: TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI

Caso clinico 1: mutazione autosomiche dominante GOF: atassia spino-cerebellare tipo 17. TBP contiene un tratto di poli-glutammine (CAG) tende a ricombinare e se si espande produce un tratto troppo lungo di Glu. I neuroni del cervelletto sembrano particolarmente sensibili a questa mutazione.

Caso clinico 2: Malattia autosomica recessiva LOF: Xeroderma pigmentosum e Cockayne syndrome. Mutazioni in geni codificanti per le subunità di TFIIH. Mutazioni in ERCC6 generano conto di 70% dei casi. Se ERCC6 o ERCC8 sono alterati i danni al DNA che vengono incontrati durante la Trascrizione non vengono riparati, causando lo stallo della RNA polimerasi in quei punti e di conseguenza una interferenza con l'espressione genica.

La possibilità di trascrivere un gene dipende da: accessibilità alle sequenze regolatorie prossimali e distali dei geni (rimodellamento della CROMATINA); disponibilità di sequenze regolatorie prossimali al promotore (entro)

200bp) e distali (enhancers); disponibilità di opportune ricombinazioni di proteine regolatrici che in modo combinatoriale e cooperativo promuovono il reclutamento dell'RNA pol al promotore minimo; capacità di assemblare il complesso basale di Txsu promotore minimo. RNA polimerasi eucariotiche: estratti nucleari (riccio marino) con 3 frazioni con attività RNA pol che presentano diversa preferenza per forza ionica e metalli divalenti. Diversa sensibilità al veleno del fungo A. phalloides (RNA pol I mai inibita, II la più sensibile, III inibita a concentrazioni 10000 volte superiori). RNA pol I: si trova nel nucleolo, trascrive per grandi precursori di rRNA (80% degli RNA totali; 28S, 18S, 5.8S rRNAs). RNA pol II: localizzata nel nucleo; trascrive per hrRNAs (mRNAs), snRNA (no U6), snoRNAs, miRNAs, lncRNAs. RNA pol III: si trova nel nucleo; trascrive per 5S rRNA precursor (5S rRNA), tRNA precursors, U6 snRNA. Mediante gel elettroforesi le RNA pol dilievito vengono denaturate e sono formate da almeno 12 subunità arrivando a pesare no a 500 kDa. Invece in una RNA pol batterica le subunità sono molte meno. La pol II presenta un dominio C-terminale molto lungo con una serie di eptapeptidi (7aa, YS PTS PS, ripetuta 26x nel lievito, 40x in droso la, 52x in mammifero) molto importanti per diverse fasi della Tx. Questa coda è altamente fosforilata nel complesso di elongazione, non fosforilata durante il riconoscimento e il legame al promotore. -INIZIO della Tx: regioni di controllo dei geni trascritti dalle tre RNA pol sono ampie e costituite da numerosi elementi (POSIZIONATORI=promotore minimo: pol I tra -45 +20; pol II TATA box, downstream promoter element, enhancer silencer; pol III sequenze downstream box A e box B/C). Le RNA pol eucariotiche da sole non sono in grado di riconoscere il promotore e legarsi al DNA. Hanno bisogno di fattori di trascrizione (TF) generali per permettere l'aggancio della RNA pol. I fattori di

regolazione servono invece per regolare il processo (espressione alta o bassa). Fattori di trascrizione generali/basali: necessari per il riconoscimento e posizionamento delle RNApol in prossimità di start point. Si legano al promotore minimo, sono diversi per le tre RNA pol(TFI, TFII e TFIII). Classi I: UBF (upstream binding factor), SL1 (con TBP); classe II: TFIID (conTBP), TFIIA, B, F, E, H; classe III: TFIIIA, TFIIIB (con TBP) e TIIIC. I TF generali svolgono il ruolo delfattore sigma.

-RNA pol I: core promoter (-45 to +20) GC-rich ma corta sequenza AT-rich attorno nt +1. Sufficiente per garantire Tx basale. Upstream promotor element (UPE, -180 to -107) GC-rich, essenziale per garantire una efficiente Tx (stesso significato elemento UP nel promotore batterico). UPE (o UCE upstream promoter element) viene ricostituito da UBF1 (upstream binding factor) che induce una curvatura sul DNA di circa 360 gradi per avvicinare questo complesso a SL1 (contiene TBP) che si lega al promotore.

complesso UBF-SL1 recluta la RNA pol I e la posiziona correttamente. -RNA pol III: elementi cis attivi sono all'interno della regione trascritta (internal promoters). Possono essere A e C e l'elemento intermedio oppure A e B. -RNA pol II: il complesso di pre-inizio riconosce delle sequenze in prossimità del sito di inizio. Sito iniziatore con due tipi di sequenze: 1) TATAbox (-10 to -25) presente nel 30% dei promotori; 2) DPE (downstream promoter element, +28 to +32); sono tutti elementi cis attivi. 1) Promotore TATAbox: I fattori basali e la polimerasi sono reclutati ai promotori secondo una precisa sequenza: TFIID contiene TBP e TAFs (TBP associated factors, circa 10 nell'uomo), TFIIA-TFIIB, RNA pol II+TFIIF, TFIIE, TFIIH. Il complesso viene definito apparato basale di trascrizione o COMPLESSO DI PRE-INIZIO. TFIID: è un complesso multiproteico. È il primo fattore che lega il promotore. I TAFs sono importanti per l'interazione di TFIID con altri fattori generali, con fattorispeci fi cato come TSS. TFIIA stabilizza il legame di TBP al DNA e facilita l'assemblaggio del complesso di pre-inizio della trascrizione. TFIIB si lega al DNA a monte di TBP e interagisce con la subunità RAP74 di TFIIF, che a sua volta interagisce con la polimerasi RNA. TFIIB è essenziale per l'orientamento corretto della polimerasi RNA sul promotore. TFIIF: si lega al complesso di pre-inizio della trascrizione e interagisce con la polimerasi RNA. TFIIF aiuta a stabilizzare il complesso di pre-inizio e facilita l'ingresso della polimerasi RNA nel complesso. TFIIE: si lega al complesso di pre-inizio della trascrizione e interagisce con TFIIF e la polimerasi RNA. TFIIE aiuta a stabilizzare il complesso di pre-inizio e facilita l'apertura dell'elica del DNA. TFIIH: è un complesso multienzimatico che svolge diverse funzioni durante la trascrizione. TFIIH ha attività elicasica, che aiuta ad aprire l'elica del DNA, e attività chinasi, che fosforila la polimerasi RNA e altri fattori di trascrizione. TFIIH è anche coinvolto nella riparazione del DNA e nella regolazione dell'espressione genica. Insieme, questi fattori di trascrizione lavorano in modo coordinato per avviare e regolare la trascrizione del DNA in RNA.

detto start point. Serve da linker tra TFIID e la RNA pol e stabilisce la direzione in cui si legherà la polimerasi.

RNA pol II + TFIIF: TFIIF è un tetramero che lega la RNA pol prima del suo reclutamento al complesso di pre-inizio. TFIIF riduce le interazioni non specifiche tra pol e DNA, quindi ha funzione simile a sigma70 dei batteri. Però a differenza di sigma non lega il DNA ma i fattori proteici già presenti sul promotore. La pol viene posizionata a valle dei fattori generali di Tx, a cavallo del sito di inizio della Tx.

TFIIE e TFIIH: TFIIE entra per primo permettendo l'ingresso di TFIIH (multisubunità). L'ultimo ha varie funzioni: ELICASI ATP-dipendente: idrolizza ATP e svolge il DNA nella bolla di Tx, esponendo il lamento stampo. È essenziale per permettere l'inizio della Tx; CHINASI: fosforila la coda C-terminale della RNA pol II; interviene nella RIPARAZIONE del DNA reclutando proteine.

essenziali nell'azione del taglio, escissione e riparazione del DNA.

2) I promotori privi di TATAbox si dividono in due classi: classe I presenti nei geni housekeeping, cioè geni espressi in tutte le cellule che controllano vie metaboliche comuni e forniscono le funzioni basilari per sostenere tutti i tipi cellulari; classe II presenti in geni regolati nello sviluppo (OMEOCITI) attivi durante la fase embrionale. In ogni caso è indispensabile la presenza di TBP perché la Tx possa iniziare anche se la TBP in questi casi non interagisce direttamente con il DNA.

Alcuni TAFs all'interno di TFIID legano lnR e DPE. In questo caso TBP non lega il DNA direttamente, ma resta essenziale per il successivo reclutamento della RNA pol II. L'assemblaggio di TFIID è medato da TF specifici anche in questo caso TBP entra mediante un'interazione indiretta con i TAF. Inizi diversi perché il posizionamento non è perfetto. CpG island sono ricche di CG, sono sito di legame di

alcuni fattori specifici, possono essere metilate. Riconoscimento minimo RNA pol II TATA-less: Il legame di TBP è mediato da TAFs (siti iniziatore eDPE TAFIID 250 e 150) o TF specifici (elementi prossimali Sp1 TAFII 110, 150, 250). -TBP: si riscontra nei complessi di pre-inizio di tutti i promotori anche i TATA-less e quelli dei genitrascritti da RNA pol I e RNA pol III. Agisce legandosi direttamente al DNA solo sui promotori che contengono la TATAbox (interazioni DNA-proteina); su tutti gli altri promotori non si lega direttamente al DNA ma viene portato sul posto da altre proteine (TF generali) che interagiscono con il DNA (interazioni proteina-proteina). -TERMINAZIONE (semplici per pol I e pol III): la terminazione con pol I avviene a più di 1000bp downstream al 3' maturo che quindi è generato da un taglio operato da un endonucleasi (Rnt1). Richiede una sequenza sul DNA di 18bp e una DNA-binding protein (terminatore, non come rut). Gli rRNAs maturano grazie a eventidi essere adeguatamente processato e maturato. La terminazione della trascrizione dell'mRNA avviene attraverso un complesso meccanismo che coinvolge la RNA polimerasi II e diversi fattori proteici. Durante la trascrizione, la RNA polimerasi II sintetizza l'mRNA fino a raggiungere una sequenza di terminazione specifica. Questa sequenza di terminazione è composta da un segnale di poliadenilazione seguito da una serie di nucleotidi ricchi in adenina (AAUAAA). Questo segnale di poliadenilazione è riconosciuto da complessi proteici chiamati fattori di terminazione. Una volta che il segnale di poliadenilazione è riconosciuto, i fattori di terminazione interagiscono con la RNA polimerasi II e con l'mRNA in via di sintesi. Questa interazione porta alla cessazione della sintesi dell'mRNA e al rilascio della RNA polimerasi II dal DNA. Successivamente, l'mRNA viene processato e maturato. Questo processo include la cappatura dell'estremità 5' dell'mRNA, lo splicing degli introni e l'aggiunta di una coda di poliadenilazione all'estremità 3' dell'mRNA. Questi processi sono fondamentali per la stabilità e la funzionalità dell'mRNA. Infine, l'mRNA maturo viene trasportato dal nucleo al citoplasma, dove può essere tradotto in proteine. Questo avviene grazie a complessi proteici chiamati complessi di esportazione dell'mRNA, che mediano il trasporto dell'mRNA attraverso i pori nucleari. In conclusione, la terminazione della trascrizione dell'mRNA è un processo complesso e altamente regolato che coinvolge diversi fattori proteici e che è strettamente interconnesso con la maturazione dell'mRNA. Questo processo è fondamentale per garantire la produzione di mRNAs funzionali e per permettere la traduzione delle informazioni genetiche in proteine.

Essere maturato. Il trascritto primario viene maturato mediante CAPPING (5'), SPLICING (rimozione introni) e POLIADENILAZIONE (o tailing in 3'). I tre processi sono regolati e strettamente interconnessi con il processo di trascrizione. CAP e POLI-A svolgono fondamentali ruoli di: protezione dalla degradazione, facilitazione splicing primo e ultimo introne, segnali per il trasporto nel citoplasma, inizio della traduzione. Modi cazioni post-traduzionali del CTD (C-terminal domain con l'eptapeptide serina 2 e 5) regolano l'attività della pol durante la Tx. Queste modi cazioni sono reversibili (defosforilazioni). Il CTD modi cato serve da sca old per molte proteine, permettendo di accoppiare la Tx con le modi cazioni del trascritto primario. La RNA pol II che entra nel complesso di pre-inizio non è fosforilata. La fosforilazione (Ser5 e Ser2) è importante per permettere alla pol di passare dalla fase di inizio alla fase di allungamento della Tx.

Ladefosforilazione della Ser5 è importante per la terminazione.

Promoter clearance=transition from initiation to elongation: pol II CT