Appunti Biologia molecolare

Lezione 1: Introduzione e macromolecole

Studio a livello molecolare dei sistemi viventi

Capire i fenomeni biologici in termini molecolari. È una disciplina diretta alla comprensione del fenomeno "vita" attraverso lo studio delle macromolecole biologiche (soprattutto acidi nucleici e proteine), dei meccanismi che ne regolano il funzionamento e ne causano le disfunzioni, e delle interazioni che avvengono entro e tra le cellule che le contengono. Biochimica, genetica, fisiologia, biologia dello sviluppo, virologia, immunologia, microbiologia si sovrappongono alla biologia molecolare (BM).

Tecniche di biologia molecolare

Ingegneria genetica, biotecnologia o tecnologia del DNA ricombinante. Eventi storici significativi:

• 1886: studio di Mendel dei caratteri
• 1953: Watson e Crick pubblicano la struttura del DNA
• 1983: PCR scoperta da Kary Mullis
• 1998: Fire e Mello scoprono RNAi/miRNA
• 2012: sistemi di editing genomico CRISPR/Cas Doudna e Charpentier
• 1985: albero genealogico della tecnologia del DNA ricombinante

La cellula è costituita per il 30% da macromolecole. Le macromolecole sono molecole di grandi dimensioni ed elevato peso molecolare costituite da unità strutturali semplici legate covalentemente, uguali o simili, ripetute molte volte, lineari o ramificate. I lipidi non sono vere e proprie macromolecole perché si legano grazie a forze idrofobiche.

Acidi nucleici

Gli acidi nucleici sono catene poli-nucleotidiche con basi azotate unite ad uno scheletro costituito da zucchero-fosfato. Un nucleoside consiste di una base azotata che può essere una purina (A, G) o pirimidina (U, T, C) legata al carbonio 1' di uno zucchero pentoso. Il DNA contiene desossiribosio (2'-H) mentre RNA ribosio (2'-OH). Un nucleotide consiste di un nucleoside legato a un gruppo fosfato al C 5' o 3' dello zucchero. Un'estremità della catena ha un 5' end (con il gruppo fosfato) e l'altra ha il 3' end (gruppo idrossilico OH). Legame 5'-3' fosfodiestereo.

Le regole di Chargaff: il contenuto dei nucleotidi pirimidinici è sempre uguale a quello purinico; T=A (doppio legame H) e C=G (legame triplo); A+T non è necessariamente uguale a C+G. Con la diffrazione dei raggi X di fibre orientate di DNA è stata ottenuta la forma B (0.34 nm per curvatura, 2 nm larghezza) e ha permesso di identificare la struttura a doppia elica destrorsa con solco maggiore e minore. Interazioni (π-π) idrofobiche tra le basi impilate; forze repulsive tra i fosfati (perché troppo vicini 2nm) dello scheletro.

Il DNA in acqua non è più in forma B ma denatura in due filamenti separati. La denaturazione del DNA può essere "misurata". Il DNA assorbe la luce alla lunghezza d'onda di 260nm (shift ipercromico). Possiamo denaturarlo con il calore (Tm temperatura di melting, 50% della molecola denaturata, è in relazione con il numero di legami H). La struttura del DNA è stabilizzata da alte concentrazioni saline. Basse concentrazioni saline favoriscono la denaturazione perché vengono smascherate le cariche negative dei fosfati. Il pH basico (OH-) rompe i legami H tra le basi mentre solventi organici (trifluro acetato di Na, DMSO) rompono le interazioni idrofobiche.

Gli appaiamenti nell'RNA sono i canonici Watson e Crick ma possono essere anche non canonici (G-U, I-U, I-A) come nel caso dei tRNA. L'RNA ha solco maggiore stretto e profondo, solco minore più ampio. L'ossidrile in 2' rende la molecola reattiva. Può assumere conformazioni diverse a formare tRNA, rRNA e ribozimi.

Proteine

Le proteine sono costituite da aa (PM medio 100-110 Da) idrofilici o idrofobici. Struttura primaria: sequenza aa. Struttura secondaria: conformazione alfa-elica o foglietto-beta. Struttura secondaria può essere disordinata; proteine molto dinamiche. Struttura terziaria: spesso globulare; corrisponde alla conformazione nativa (energia libera bassa, proteina molto stabile). Struttura quaternaria: forma un complesso multiproteico con se stessa o con altre proteine.

Motivi delle proteine: particolari combinazioni di struttura secondaria deputate allo svolgimento di funzioni specifiche. Esempio:

• Helix turn helix sembrerebbe perfetta per prendere contatto con il DNA a livello del solco maggiore
• Motivo dito di zinco costituito da due segmenti beta antiparalleli, interazioni tra aa e un atomo di zinco. Alfa elica prende contatto con il DNA

Dominio: unità compatta (regione) di una regione con specifica struttura III in grado di ripiegarsi stabilmente (quasi entità indipendente); possiede specifiche proprietà strutturali o funzionali; domini diversi connessi da regioni linker (non strutturale). Esempio: monomero repressore lac (operone lattosio) costituito da motivo hth, struttura a cerniera, due domini centrali e infine un dominio per l'oligomerizzazione. Questa proteina è funzionale come tetramero.

Molte proteine sono modulari: domini diversi si sono fusi assieme nell'evoluzione (selezione positiva; non è una convergenza evolutiva). Esempio: Ras (GTP binding protein); EF-Tu (GTP binding protein, parte molto simile alla proteina Ras, è un fattore d'inizio traduzione); proteine che legano il DNA (motivo HTH molto simile); proteine che legano nucleotidi ciclici (dominio di legame); proteasi seriniche (dominio catalitico).

Allosteria: modifica della struttura della proteina che cambia conformazione come conseguenza del legame di una molecola (ligando). Il sito di legame non è in un sito catalitico, ma in un punto diverso della molecola. Esempio: adenilato chinasi; operone lac dove il ligando è il lattosio.

Interazioni DNA-proteine: specifiche (legami H, forze di Van der Waals). Avviene il riconoscimento dei motivi da parte del DNA; sono favorite nel solco maggiore; nel solco maggiore le configurazioni possiedono un significato univoco mentre nel solco minore hanno significati ripetitivi. Sono necessari numerosi siti di contatto: ciascuno possiede debole forza per sé, ma poiché sono molti (almeno 20), la forza di legame globale assicura una specifica e stabile interazione. Le proteine che legano il DNA in siti specifici come i fattori di trascrizione, molto spesso agiscono come dimeri, tetrameri e così via. Raramente agiscono come singola molecola.

È una questione di simmetria della struttura quaternaria ed in particolare dei domini di legame al DNA. I siti di legame sul DNA sono allo stesso modo simmetrici; questo è un modo per aumentare la stabilità di legame senza incrementare troppo la complessità della struttura della proteina. Esempio: repressore lac; recettore per estrogeno legato a Hormone Response Element. Nella TBP (legata alla TATAbox) è coinvolto il solco minore. Questa proteina è formata da una singola subunità, struttura a foglietti beta, l'interazione causa una torsione dell'elica del DNA essenziale per la funzione stessa. Mutazioni di questa proteina causano malattia neurodegenerativa.

Aspecifiche: interazioni tra aa positivi e carica negativa del DNA (esempio: istoni che formano i nucleosomi).

Lezione 2: Geni, mutazioni e polimorfismo

Gene

Unità di funzione molecolare: il concetto più di uso fa riferimento ad una funzione molecolare e non ad una specifica sequenza, e questo è probabilmente dovuto al fatto che può essere difficile stabilire quali elementi fanno parte esattamente di un gene (introni, esoni, elementi ancheggianti, sequenze trascritte ma non tradotte...).

Unità strutturale: si intende un segmento di DNA univocamente identificabile nel genoma che codifica una proteina o un RNA e che può esistere sotto forma di sequenze leggermente diverse (gli alleli).

La struttura di un gene deve: rimanere costante per trasmettere "invariata" l'informazione alla progenie (replicazione semiconservativa); contenere le istruzioni per produrre (trascrizione) in modo regolato RNA (espressione); evolvere (mutazioni e selezione): singole sostituzioni nucleotidiche (mutazioni missense, null), delezioni, inserzioni, traslocazioni, ricombinazioni di tratti.

Organizzazione strutturale di geni

Procariotici: spesso i geni che codificano enzimi coinvolti nella medesima via metabolica sono organizzati in operoni. Un operone è costituito da:

• Start point dove inizia la trascrizione
• Regione trascritta (a valle)
• Regione di controllo (a monte: promotore+operatore; possono essere presenti enhancer) e infine terminatore

Viene prodotto un unico mRNA policistronico. 5' e 3' non sono modificate. Trascrizione e traduzione avvengono contemporaneamente nel citoplasma.

Eucarioti: i geni sono unici, nella maggioranza dei casi sono "interrotti" dagli introni. Sono costituiti da:

• Regione di controllo (a valle o a monte) molto ampia con promotore e enhancer prossimali e distali
• Start point
• Regione trascritta (introni+esoni)

Viene prodotto un trascritto primario successivamente maturato con capping, tailing e splicing.

Locus genico

Una qualsiasi porzione del genoma che include una sequenza codificante.

Locus ipervariabile: un segmento per il quale sono presenti nella popolazione un grande numero di alleli.

Mutazioni

(Frequenza inferiore all’1% nella popolazione; sono recenti e rare) sono la principale causa della variabilità genetica che è una delle proprietà fondamentali del materiale genetico. Le mutazioni costituiscono il substrato su cui opera la selezione naturale. Mutazioni/selezione sono elementi fondamentali per l’evoluzione. La “vita” per come la conosciamo non sarebbe possibile senza delle varianti. Alleli diversi sono responsabili della variabilità fenotipica degli individui. Ma variante rispetto a chi? Il punto di riferimento è un fenotipo selvatico (WT) ma è tutto relativo...il WT di oggi era un mutante di ieri.

Consideriamo un singolo tratto di DNA (un migliaio di bp) preso a caso dal genoma di una popolazione selvatica. Campione non eccessivamente grande di individui (500 fra maschi e femmine: 1000 tratti omologhi indipendenti). Si distinguono vari casi:

• Tutte le sequenze sono identiche: il locus è monomorfico
• In un piccolo numero (da 1 a 10) dei cromosomi campionati si identifica una sequenza diversa: variazione rara (mutazione, albinismo)
• Una variante è presente in più di 10 cromosomi del campione: polimorfismo genetico (frequenza >1%)
• Nel campione sono presenti due diverse sequenze a frequenza apprezzabile: locus biallelico (fiore viola/bianco, sistema Rh sangue)
• Nel campione sono presenti più di due diverse sequenze a frequenza apprezzabile: locus multiallelico (AB0)

Mutazioni cromosomiche: variazioni della struttura come delezioni, duplicazioni, inversioni, traslocazioni. Questi riarrangiamenti avvengono mediante rottura e riunione o tra crossing-over tra segmenti ripetivi di DNA. Variazioni del numero (monosomie, trisomie).

Mutazioni puntiformi (possono avvenire in regioni codificanti o di controllo): sostituzione può essere non conservativa o conservativa con conseguenze più o meno gravi. La missenso codifica per un aa differente, la nonsenso per un codone di stop prematuro, la silente codifica per lo stesso aa; inserzioni e delezioni causano cambiamento del frame di lettura. Nel 90% dei casi si formano codoni di stop prematuri che danno origine a proteine tronche che possono creare gravi problemi alla cellulare tra cui agire da dominanti negativi. Il sistema di non sense mediated decay elimina le proteine tronche.

Sostituzioni/inserzioni/delezioni in regioni non codificanti possono avere effetto sulla trascrizione, splicing ed espressione. Possono essere silenti se avvengono in regioni introniche non coinvolte nello splicing e/o regolazione. Esempio: gene wild-type: mutazione nel promotore causa perdita di espressione del gene (fenotipo nullo); mutazione nella regione codificante provoca mancata produzione della proteina o una proteina diversa; mutazione nella regione non codificante può avere conseguenza neutra o non grave.

Tipi di mutazioni classificate in base al pattern di eredità:

• Autosomiche dominanti
• Autosomiche recessive
• X-linked

Mutazioni classificate in base all’effetto funzionale:

• Morfo logiche danno luogo ad una forma diversa
• Letali non compatibili con la vita
• Condizionali originano un fenotipo mutante in condizioni restrittive (ambientali), il fenotipo è wild type (normale) in condizioni permissive
• Biochimiche bloccano una specifica pathway biochimica, impediscono di portare a termine una specifica pathway biochimica (errore congenito metabolico)

Mutazioni classificate in base al meccanismo:

• Loss of function (null/LOF) causano la perdita del prodotto del gene, ci possono essere parziali perdite di funzione/mutazioni leaky (ipomorfe) sono di solito recessive anche se esistono eccezioni (1. Per alcuni prodotti genici il 50% del livello non è sufficiente per la funzione normale: l’aploinsufficienza produce un fenotipo anomalo che viene ereditato in maniera dominante. È tipica di proteine molto espresse, di proteine funzionali o che fanno parte di complessi multiproteici per le quali è importante la stechiometria del complesso; 2. In un soggetto eterozigote, il polipeptide mutato non funzionante interferisce con la funzione dell’allele wild type producendo un effetto dominante negativo (allele antimorfo) che causa effetti più gravi sul fenotipo delle delezioni o delle mutazioni non senso nello stesso gene. Le proteine strutturali che contribuiscono alla formazione di strutture multimeriche o enzimi costituiti da multimeri (struttura quaternaria) sono più vulnerabili agli effetti negativi);
• Gain of function (GOF) il risultato è la presenza di una funzione del gene alterata che agisce come dominante e produce un nuovo fenotipo (neomorfica) o una quantità/funzione maggiore (ipermorfica).

Alcune mutazioni ricadono in più di una categoria, per esempio alcune GOF possono essere anche mutazioni condizionali e morfologiche, altre possono essere LOF e letali.

Polimorfismo

Variazioni nella sequenza di DNA (sostituzioni, delezioni, inserzioni..) presenti con una frequenza superiore all’1% nella popolazione. Hanno effetto debole o nessun effetto sul fenotipo. Antiche (evolutivamente) e comuni. Nell’uomo il 99.9% delle basi del DNA sono le stesse. Il rimanente 0.1% rende una persona unica (genotipo): differenti attributi/caratteristiche/tratti/come una persona appare, le malattie che sviluppa. Queste variazioni possono essere: innocue (cambiamento nel fenotipo: colore occhi, altezza, peso...), patologiche (diabete, cancro, malattie cardiache, Huntington’s, emofilia..), latenti (variazioni trovate in regioni codificanti o di regolazione, non sono patologiche e il cambiamento in ciascun gene diventa apparente solo in certe condizioni. Esempio: suscettibilità al cancro al polmone, risposta a certi farmaci..).

Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) si definisce con il cambiamento di una singola base in una sequenza di DNA che avviene in una significativa proporzione (più dell’1%) di un’ampia popolazione. SNPs si trovano in coding e principalmente noncoding proteins. Si trovano con frequenza molto alta circa 1 ogni 1000 basi fino a 1 ogni 100-300 basi. L’abbondanza di SNPs e la facilità con la quale possono essere identificati e misurati li rende delle varianti genetiche significative. SNPs vicini a particolari geni possono agire come marker per quel determinato gene. SNPs nelle regioni codificanti possono alterare (o no) la struttura della proteina codificata da quella regione. Sequenziamento dei genomi di un largo numero di persone. Comparare le sequenze per identificare SNPs. Generare una mappa del genoma umano contenente tutti i possibili SNPs—>SNP maps/profilo (utile per capire l’efficacia di un trattamento farmacologico come quello per l’epatite C: farmacogenomica; silenziamento del prodotto dell’allele mutato).

Lezione 3: Trascrizione procarioti

Inizio, allungamento e terminazione

Nei batteri: 800nt/sec nella replicazione; 40-50 nt/sec trascrizione; 15 aa/sec nella traduzione. Classi di RNA: universali/costitutivi: mRNA, tRNA, rRNA; RNA regolatori: snRNA (assistono durante lo splicing), snoRNA (modificano gli rRNA), smallRNA (microRNA, piwiRNA, siRNA hanno funzione regolatoria, non codificanti), lncRNA (Xist), CrisprRNA (tracrRNA, crRNA).

Nucleotide +1 del DNA (filamento codificante): corrisponde al primo ribonucleotide presente nel trascritto (start point); porzione a monte (upstream) contiene, quasi sempre, il promotore (numerazione negativa); nella porzione a valle (downstream) si trova la regione codificante (in eucarioti introni ed esoni) ed il terminatore (numerazione positiva).

Filamento codificante: orientamento 5’-3’, stessa sequenza nel trascritto di RNA (U al posto di T).

Filamento stampo o template: costituisce lo stampo, è complementare al trascritto.

La trascrizione è operata dalla RNA polimerasi. Stessa funzione dai batteri all’uomo: caratteristiche e logica comune; tipicamente proteine multisubunità. Alcune RNA pol. fagiche (T7, T3 e SP6) e mitocondriali sono a singola subunità. Batteri: singola RNA pol; RNA è instabile (mRNA degradato rapidamente, rRNA, tRNA processati; accoppiamento tra trascrizione e traduzione). Eucarioti: 3 RNA polimerasi pol. I, II e III; RNA viene modificato al 5’ e al 3’, complessato a proteine, sottoposto a taglio (rRNA, tRNA e splicing), esportato dal nucleo; separazione tra trascrizione e traduzione. La trascrizione è unidirezionale (da 5’ a 3’). Il 3’-OH del primo nucleotide reagisce con il successivo nt (entrante) 5’ trifosfato, nella reazione di formazione del legame fosfodiestereo, vengono persi i gruppi fosfato beta e gamma (pirofosfato) che viene successivamente idrolizzato. RNA polimerasi inizia da 0 unendo due singoli nt (non ha bisogno di innesco).

RNA polimerasi batterica è un enzima dotato di struttura quaternaria (multisubunità): core alfa2betabeta’omega; fattore sigma si aggiunge al core e abbiamo l’enzima olografo.