Biologia Molecolare dell'RNA

Biologia molecolare dell'RNA 2017-2018

Prof. Carlo Prunetti

Pol II e ruolo nella maturazione dell'mRNA

RNA pol II ha varie subunità con domini di legame al DNA, scorrimento e polimerizzazione. Presenta anche domini di interazione con fattori eucariotici di trascrizione e/o elaborazione. NB. RNA pol riconoscono il DNA senza bisogno di fattori di trascrizione.

Negli eucarioti, la necessità della regolazione trascrizionale è massima a causa dell'ampiezza del genoma. La coda CTD della pol II è data da una sequenza ripetuta conservata, le cui serine e prolina sono facilmente fosforilabili e defosforilabili. La CTD è la componente della Pol II che lega i fattori di trascrizione e altre proteine di maturazione dell'RNA nascente. Lo stato di fosforilazione della CTD varia continuamente durante la trascrizione, e con ciò varia l'affinità per i fattori, quindi la forza con cui essi sono legati alla Pol e il loro numero. NB. Ex. una CTD molto affine ai fattori di splicing alternativo ne recluta molti; ma solamente fattori non disponibili allo splicing alternativo. Durante l'allungamento, la CTD è iperfosforilata.

Fattori trascrizionali

I 3 fattori trascrizionali di ogni cellula sono in sta, cioè combinazioni di fattori specifici su un totale di un centinaio di proteine. Fattori molto specifici (circa 10 fattori) si trovano in cellule termi diate differenti dove devono produrre in maniera massiva alcune proteine (ex. cellule secetorie). NB. Gli effetti netti sulla trascrizione sono strettamente dipendenti delle concentrazioni di fattori nei pressi del trascrittosoma.

Promotore di Pol III

Il promotore proximale ha, da solo, una resa di trascrizione molto bassa (3-4%). Mutare una base in TATA o in altre regioni specifiche del promotore (ex. la A del sito di inizio della trascrizione) abbassa drasticamente il tasso di trascrizione.

Capping del pre-mRNA

Il CAP di 5' è essenziale per aumentare l'efficienza dello splicing, per il trasporto nel citoplasma e per l'inizio della traduzione (lega il fattore di inizio della traduzione eIF4F). NB. Trascritti non cappati sono rapidamente degradati, con terminazione precoce della trascrizione.

3 fattori di CAPPING sono reclutati dalla CTD particolarmente fosforilata sulla Ser5 nella fase iniziale dell'allungamento. La sequenza di eventi è:

1. La prot. DSIF si ancora a PolII subito dopo l'inizio della trascrizione, e recluta la prot. NELF. NELF blocca l'avanzamento di PolII, che può quindi reclutare sulla CTD gli enzimi di capping.
2. Una RNA TRIFOSFATASI rimuove il fosfato γ del trifosfato del 1° nt 5'. Poi una GUANILILTRANSFERASI rimuove i fosfati β e γ del GTP che fornirà il cap, catalizzando il legame tra il fosfato α del GMP così formato e il fosfato β preesistente del 5' dell'RNA. A questo punto la guanina è ancorata all'mRNA da un ponte 5'-5' trifosfato.
3. Una METILTRANSFERASI aggiunge un -CH₃ alla guanina - oppure aggiunge 2 un -CH₃ alla purina esterna del 5' dell'mRNA. A seconda del tipo di capping sono anche possibili metilazioni metossilori in varie sedi (1° e 2° ribosio 5').

Splicing

È cotranscrizionale. Un pre-mRNA inserito nella cellula subisce splicing con una efficienza 100 volte più buona rispetto a quella di uno stesso trascritto splicato cotrascrizionalmente.

I geni tipici di mammifero hanno almeno 6/7 introni, mentre quelli di organismi inferiori ne hanno di meno (S. cerevisiae ha geni con, solitamente, un introne piccolo o 5¹).

S. cerevisiae ha 246 geni con introni su 6000 geni totali. Negli eucarioti complessi gli introni sono grandi e con dimensioni variabili, mentre gli esoni sono piccoli e in genere di dimensioni molto simili tra loro.

Generalità sulle sequenze di splicing

La cellula stabilisce quali frammenti rimuovere riconoscendo sequenze-strutture altamente conservate nell’RNA nascente. Di nuovo, i complessi di splicing riconoscono consensus introniche, ma in eucarioti complessi il taglio è guidato anche da sequenze esoniche. La variabilità di alcune basi delle sequenze consensus è alla base della variabilità dell’efficienza di riconoscimento e di taglio. La coda CTD (dalla quale si ancorano i complessi di splicing) è di 52 AA, ma aumenta di lunghezza proporzionalmente alla lunghezza media dei geni del genoma, per consentire l’allungamento dei...