Biologia Molecolare dell'RNA

Biologia Molecolare dell'RNA

2017 - 2018

Prof. Carlo Peretti

Pol II e ruolo nella maturazione dell’mRNA

• RNA Pol II
  • Ha varie subunità
    • Domini di legame al DNA, scorrimento e polimerizzazione
    • Domini di interazione con fattori eucariotici di trascrizione ed elaborazione

  NB: RNA pol facilita trascrizione e riconoscenza di fattori di trascrizione.

• Negli eucarioti la necessità della regolazione trascrizionale è massima a causa dell’ampiezza del genoma.

• La coda CTD della Pol II è dotata di una sequenza ripetuta conservata, le cui serine e treonine sono facilmente fosforilabili e defosforilabili.

  La CTD è la componente della Pol II che lega i fattori di trascrizione e altre proteine di maturazione dell’RNA nascente.

• Lo stato di fosforilazione della CTD varia continuamente durante la trascrizione, e con ciò varia l’affinità per i fattori, quindi la forza con cui essi sono legati alla Pol e il loro numero.

  NB: Es., una CTD molto affine ai fattori di splicing alternativo ne recluta molti, ma solamente i fattori non disponibili allo splicing alternativo.

• Durante l’allungamento la CTD è iperfosforilata.

Fattori Trascrizionali

• 3 fattori trascrizionali di ogni cellula sono in Act, cioè costituiscono i fattori specifici: su un totale di un centinaio di proteine.
• Fattori molto specifici (≈10^3 di fattori) si trovano in cellule terminalmente differenziate che devono produrre in maniera massiva alcune proteine (ex. cellule secretorie).

NB: Gli effetti netti sulla trascrizione sono strettamente dipendenti dalle concentrazioni di fattori nei pressi del trascrittosoma.

- Per l'analisi dello splicing si possono fare RNA in vitro (con RNApol fagi ca e partire da gene pronti in vitro, sotto il controllo del promotore fagico) e iniettare nel nucleo (generalmente in un oocito di anfibio).

- NB. Gli RNA prodotti in vitro prima di essere iniettati, devono essere cappe e poliadenilati, altrimenti verrebbero degradati.

- Northern blotting su RNA nucleari permette di seguire l'andamento temporale dello splicing, e ribadire sia l'ordine degli introni nel pre-mRNA sia l'efficienza della relativa e giunzioni di splicing.

- Nell'esempio a dx, l'ordine delle bande nella corso riflette solo l'ordine degli introni nel pre-mRNA che la bontà delle loro giunzioni.

- NB. Occorre considerare anche che gli introni trascritti prima hanno più tempo per essere processati e rimossi, indipendentemente della loro sequenza consenso.

- NB. In questi esperimenti la coda CTD è fosforilata in modo non canonico ↓ È critica l'interpretazione dei risultati.

Occorre specificare che sxl è sotto il controllo di due promotori:

• Pe - promotore di avvio, produce Sxl attiva solo se attivato da SioA/B.
• Pm - promotore di mantenimento, produce una Sxl contenente un esone che rende Sxl non funzionale, in modo costitutivo sia in ♂ che in ♀.

Dunque la Sxl prodotta da Pe, è presente solo nelle ♀. Sxl prodotta da Pm, produce in ordine lo splicing della Sxl prodotta da Pm, che intercede permettendo i entrambe i sessi. In base a ciò, solo nelle ♀ Sxl e Pm possono soggetti ad uno splicing (da parte di Sxl e Pe) che la rendono funzionale e che conservano l’esone.

NB Sxl è un reppressore dello splicing: impedeisce l’incorporazione dell’esone.

Sxl dirige, oltre al suo splicing, lo splicing di altri pre-mRNA, tra cui quello di tra. Il trascritto immaturo del gene tra è reso funzionale dallo splicing guidato da Sxl (quindi solo nelle ♀).

Tra è un attivatore di splicing, e tra i suoi bersagli c’è il pre-trascritto del gene dsx. Se Tra è presente si produce una isoforma di Dsx (Double Sex) che reprime i geni maschili e attiva i femminili, mentre se Tra è assente si produce una isoforma di Dsx ugualmente funzionale ma diversa, che reprime i geni femminili.

MASCHI ♂ 2X:2A

Pm Pe sxl NO Sxl Sxl immatura

dsx

FEMMINE ♀ 1X:2A

+ SioA/B Pm Pe sxl Sxl tra tra dsx

RNA REGOLATORI EUCARIOTICI

RNA eucariotici

• grandi
  • priRNA
  • eucRNA
  • circRNA
• piccoli
  • tRNA
  • tRNA
  • muRNA
  • piRNA

micro RNA (miRNA)

miRNA sono brevi RNA di 20/23 nt, e H.sapiens ne possiede ~2000. Vengono prodotti a partire da precursori molto pi grandi, codificati da circa il 1% dei geni gesti

Generale il RNA hanno un effetto negativo sull'espressione: legano il mRNA e la traduzione.

La produzione di miRNA avviene a partire da un grande precursore, il pre-miRNA, che subisce 2 tagli successivi.

1. Il 1° taglio è operato dal COMPELSSO MICROPROCESSORE, formato da DROSHA (una RNasi) e PASHA/DGCR8 (due fattori accessori che denano specificità e vanno a riciclare dell'organismo). Dopo il taglio otteniamo un RNA da ~44 bp e una forcina da RNA da ~22 bp (pre-miRNA).
2. Il 2° taglio avviene solo dopo l'exportazione della forcina da 22 bp nel citoplasma, ed è operato dalla proteina DICER. Dicer è formato da una DOMINO PAZ, che riconosce e lega il 3' sp-vante del pre-miRNA, e da 2 DOMINI RNasi che tagliano i due punting della forcina, liberando l'RNA e il siRNA.

Una volta formato, il miRNA viene incorporato (RISC), per espletare le sue funzioni regolatizie.