Biologia molecolare

Biologia molecolare

Flusso dell'informazione dal DNA alle proteine passando per l'RNA

DNA trascrizione RNA traduzione proteine → → →

Replicazione

Processo secondo il quale da una molecola di DNA iniziale vengono fatte due molecole di DNA figlie identiche.

Trascrizione

Processo che porta a una copia in RNA dell'informazione genetica contenuta nel DNA.

Traduzione

Consiste nella sintesi di una proteina a partire dall'informazione genetica contenuta nell'mRNA. Dal momento che le proteine sono fatte di amminoacidi, la traduzione comporta il trasferimento dell'informazione dagli acidi nucleici a una molecola completamente diversa.

Le proteine costituiscono i 2/3 circa del materiale organico di una cellula.

Controlli negli esperimenti di biologia molecolare

Nella biologia molecolare, riguardo agli esperimenti, è importante il concetto di controllo. Non devono esserci artefatti che possano giustificare la riuscita dell'esperimento. Controllo può essere positivo o negativo.

Esempio: esperimento di PCR fatto per determinare il sesso del soggetto. Amplificazione del cromosoma Y mediante PCR: Se non ottengo segnale, ciò non basta per dire che il soggetto sia per forza di sesso femminile, sono necessari dei controlli perché la PCR è una tecnica molto sensibile e suscettibile alla contaminazione da parte di DNA estraneo al campione, basta una molecola dell'operatore per falsare il risultato.

Controllo negativo

• Provetta con il DNA del paziente (+ tutto ciò che serve per la reazione di PCR)
• Provetta contenente tutto ciò che serve per la PCR e nessun DNA (o eventualmente DNA di soggetto sicuramente di sesso femminile)

Risultato elettroforesi

• Banda se paziente di sesso maschile.
• Nessuna banda, non deve dare risultato, significa che la reazione non è stata contaminata da DNA estraneo.

Controllo positivo

Aggiunto alla reazione DNA sicuramente maschile e verificare se i risultati sono corretti.

Che cosa sono le biotecnologie?

Tutte le applicazioni tecnologiche della biologia. La biotecnologia è l'applicazione tecnologica che si serve dei sistemi biologici, dei sistemi viventi o di derivati di questi per produrre o modificare prodotti o processi per un fine specifico. È un ramo della biologia che utilizza gli esseri viventi al fine di ottenere beni o servizi utili al soddisfacimento dei bisogni della società.

DNA, depositario dell'informazione genetica

Gli acidi nucleici trasmettono l'informazione genetica. L'RNA era considerato il primo depositario dell'informazione genetica, ma è molto labile. Il DNA, invece, è una molecola più stabile e per questo più facile da tramandare tramite replicazione. Inizialmente si credeva che le molecole depositarie fossero le proteine, quando non si era ancora riusciti a isolare completamente il DNA.

Esperimento di Griffith

Griffith dimostra che esiste una molecola depositaria delle informazioni genetiche durante i suoi studi sulla polmonite al fine di trovare un vaccino.

Esperimento: isolati due diversi ceppi di Streptococco:

• R ceppo rugoso benigno, non dotato di capsula protettiva, per questo viene riconosciuto dal sistema immunitario.
• S ceppo liscio, virulento, dotato di capsula polisaccaridica che previene il riconoscimento da parte del sistema immunitario.

Iniezione batteri di ceppo S nel topo: morto. Iniezione batteri di ceppo R: sopravvive (controllo negativo). Ceppo S inattivato al calore iniettato nel topo: vivo. Ceppo S inattivato + ceppo R: morte. Nel topo morto si rinvengono cellule batteriche lisce. L'informazione dell'involucro passa dalle cellule morte a quelle vive; all'interno dei batteri di ceppo S morti per inattivazione al calore, deve esserci qualche sostanza in grado di conferire al ceppo R la capacità di sintetizzare la capsula polisaccaridica, chiamato principio trasformante.

Esperimento di Avery

Bomba di Avery, dimostrazione di quale è il reale depositario dell'informazione genetica. Coltivazione unica di batteri su piastra del ceppo S di Pneumococco (incapsulati e virulenti) in coltura liquida.

Da queste cellule estrazione di:

• Proteine
• Lipidi
• Polisaccaridi
• RNA
• DNA

5 provette + 1 di controllo negativo solo con il mezzo di coltura (eventuale controllo positivo con estratto totale). In tutte le provette vengono aggiunti batteri vivi del ceppo R. Dopo incubazione su terreno solido o/n a 37°C, crescita delle colonie. Crescono sempre colonie ruvide eccetto nella petri dove c'era il DNA (colonie lisce). Il DNA porta informazione della capsula del ceppo liscio, depositario dell'informazione genetica. Prima dimostrazione, che però non è stata accolta dal mondo scientifico.

Trasformazione vista molecolarmente

Cellula S patogena dotata di genoma circolare chiuso nel quale è presente gene che codifica per il capside Cap+. Rottura delle cellule mediante calore → DNA rotto in frammenti casuali, qualche frammento contiene gene Cap+. Frammenti di DNA entrano a contatto con le cellule R → internalizzano DNA mediante processo di trasformazione. Alcune cellule possono ricevere frammento di DNA Cap+ → processo di ricombinazione omologa, crossing-over integrazione del gene Cap+, divisione cellulare dà origine a due cellule lisce. Poche colonie lisce su piastra, soprattutto colonie rugose, frammento contenente gene del capside internalizzato solo da alcune cellule.

Esperimento di Chase e Hershey

Chase e Hershey, 1952 conferma definitiva. Fago lambda virus batterico composto principalmente da DNA + proteine. Involucro proteico e porzione centrale di acido nucleico. Inietta informazione genetica nelle cellule batteriche infettandole.

Sfruttata differenza fra le due macromolecole:

• Proteine contengono zolfo, marcato radioattivamente con S³⁵.
• DNA contiene fosforo, marcato radioattivamente con P³².

Due campioni di fagi marcati uno sulle proteine e l'altro sugli acidi nucleici usati per infettare cellule di E. coli in due fiasche separate. Dopo infezione, batteri trasferiti in un omogenizzatore per eliminare il materiale del fago che era rimasto fuori dalla parete batterica (ciò che non contiene info genetica). Cellule raccolte sul fondo della provetta, mentre i fagi si trovavano nel surnatante. Misura della radioattività del pellet: radioattivo con P³², DNA; surnatante radioattivo con S³⁵, proteine. Prova definitiva che dimostra che è il DNA a trasmettere le informazioni genetiche. La progenie fagica prodotta dalle cellule infettate, conteneva P³² e non S³⁵.

Trasformazione batterica

Oggi sfruttata per introdurre DNA batterico (plasmide) in cellule batteriche. Plasmide: molecola circolare di DNA chiusa covalentemente. Trasfezione DNA plasmidico in piante o animali. Se introdotta molecola lineare verrebbe degradata, per questo usato plasmide, essendo circolare ha le estremità protette dall'attacco da parte delle nucleasi. Trasformazione è un evento raro, necessario rendere le cellule competenti in laboratorio. Integrazione del DNA mediante ricombinazione.

Acidi nucleici

Polimeri lineari di nucleotidi:

• Gruppo fosfato
• Zucchero, in posizione 2' no ossidrile se DNA
• Base azotata purinica o pirimidinica

Condensazione con rilascio di acqua. Fra nucleotidi legame fosfodiesterico, fosfato forma legame estere con 5’ di uno zucchero e con il 3’ dello zucchero successivo, rilascio di una molecola di acqua.

Basi possono essere modificate:

• Metilazione della citosina o dell'adenosina, avviene dopo la sintesi del DNA.
• Basi dell'RNA modificate sono molto frequenti.

Base + zucchero = nucleoside. Se nucleoside legato al gruppo fosfato = nucleotide. Nomenclatura nucleotide trifosfato: α fosfato direttamente legato allo zucchero; β fosfato in mezzo; γ fosfato in coda. Nucleotide trifosfato è substrato della polimerasi, durante la sintesi mantenuto solo fosfato in α nella catena DNA; β/γ escono come pirofosfato.

Regola di Chargaff

Specifica la composizione nucleotidica del DNA. Purifica DNA da certo numero di cellule diverse → trattato all'acido per ridurlo nei singoli nucleotidi che lo compongono, ottenendo così una miscela di nucleotidi al fine di studiare le singole proporzioni. Mediante cromatografia, separazione dei diversi nucleotidi in base alle diverse basi che li compongono (diverse proprietà chimico/fisiche), trascinate per capillarità con diversa velocità in base all'affinità con la lastra sulla quale viene posta una soluzione di nucleotidi.

• I 4 nucleotidi non sono presenti in uguale quantità.
• Le specie hanno diversa composizione in nucleotidi.
• Il DNA preparato da diversi tessuti e organi dello stesso organismo ha sempre la stessa composizione in basi.
• Il numero di A = al numero di T.
• G = C.
• A+G = T+C.
• Rapporto purine/pirimidine è 1.

Parametri strutturali della doppia elica

Scheletro esterno impalcatura zucchero-fosfato carica negativamente. Interno basi e legami a idrogeno fra di esse, idrofobiche si isolano dall'ambiente acquoso. I due filamenti sono antiparalleli e hanno estremità 5’ fosfato e 3’ -OH. Molecola molto regolare. Diametro di 20 Å (20 nm). Giro dell'elica 34 Å, 10.5 paia di basi. Solco minore 12 Å. Solco maggiore 22 Å. Orientamento destrorso. Nota come forma B. Tra timina e adenina 2 legami a idrogeno. Tra guanina e citosina 3 legami a idrogeno. Proteine tendono a interagire con il solco maggiore del DNA; α elica ha dimensione perfettamente compatibile con il solco maggiore.

Molecola di DNA mantenuta stabile grazie a diverse forze:

• Interazioni idrofobiche
• Legami a idrogeno
• Repulsioni elettrostatiche
• Interazioni di impilamento

Se voglio denaturare molecola di DNA necessario trattamento al calore (95°C) o con soluzione basica (soda). Complementarietà della doppia elica ne garantisce la duplicazione in due molecole figlie.

Strutture alternative del DNA

• A: coppie di basi più angolate rispetto al piano perpendicolare all'asse della doppia elica, 11 coppie di basi per ogni giro d'elica.
• Z: elica sinistrorsa, diametro di 18 Å e passo di 46 Å, dotata di sequenze molto ricche in G-C.

RNA

Contiene uracile al posto di timina e ribosio al posto di desossiribosio. È a singolo filamento anche se forma regioni a doppio filamento (loop dove è complementare). Molecole molto più corte rispetto al DNA, portano informazione di uno o pochi geni. Molto instabile. Può contenere basi insolite non presenti nel DNA. Eccezioni date da virus con genomi a RNA a singolo o doppio filamento.

In natura presenta porzioni a doppio filamento che permettono di scaricare energia. Le basi possono ruotare e ripiegarsi liberamente intorno al legame fosfodiesterico e ai legami che lo legano al ribosio e perché le basi possono anche impegnarsi in appaiamenti non di tipo Watson-Crick. Ossidrile in posizione 2’ impedisce la formazione di una doppia elica di tipo B, favorendone una di tipo A con il solco maggiore più stretto e profondo e quello minore più largo e accessibile. Ossidrile rende inoltre la molecola molto reattiva perché esso tende a fare un attacco nucleofilico sullo scheletro zucchero-fosfato, questa caratteristica permette all'RNA di avere funzioni catalitiche. Singolo filamento di RNA può ripiegarsi su se stesso formando corti frammenti appaiati o parzialmente appaiati collegati a regioni a singolo filamento struttura secondaria. Filamenti appaiati sono antiparalleli. Esistono appaiamenti non del tipo Watson-Crick come A-A e G-U. Struttura secondaria si stabilizza e forma una struttura compatta. Ioni bivalenti si legano a siti specifici del RNA e aiutano a schermare la carica negativa dello scheletro, rendendo possibile l'assunzione di una forma più compatta della molecola.

Melting e annealling degli acidi nucleici

Denaturazione: Soluzione di acidi nucleici a doppio filamento sono molto viscose, se poste a una temperatura di fusione di circa 90°C, la soluzione diventa meno viscosa perché iniziano a denaturarsi, quindi avviene un cambiamento fisico. Non avviene rottura di legami covalenti, ma di legami a idrogeno e interazioni deboli.

Rinaturazione: Processo di annealing, avviene quando le condizioni di temperatura e pH tornano normali. Avviene rapidamente se non tutti i filamenti vengono separati completamente.

• Lento: Sequenze complementari dei due filamenti si 'cercano' grazie a collisioni casuali e formano breve tratto a doppia elica.
• Veloce: Legami fra le basi non ancora appaiate.

Come stimare la concentrazione: Utilizzo dello spettrofotometro stima della concentrazione di macromolecole in base all'assorbanza rilevata. Basi azotate assorbono nell'ultravioletto cuvetta di quarzo. Basi azotate assorbono ma vengono schermate dallo scheletro nel caso del DNA. RNA non ha lo scheletro assorbe di più. DNA ha scheletro schermante assorbe di meno. A parità di concentrazione l'RNA ha un'assorbanza maggiore rispetto al DNA. DNA assorbe a 260 nm. Proteine assorbono a 290 nm. Necessario tarare lo strumento con un bianco (tutti i reagenti escluso il campione).

Effetto ipercromico

Soluzione di filamenti di DNA denaturati assorbe di più rispetto alla molecola a doppio filamento. Basi a singolo filamento non vengono più schermate dallo scheletro carbonioso e per questo assorbono di più. Assorbimento luce UV DNA single strand è maggiore del 40%. Quando l'agitazione termica supera la forza dei legami idrogeno, delle interazioni idrofobiche e delle altre forze che stabilizzano la doppia elica, la molecola fonde e la separazione dei filamenti modifica l'assorbimento della luce UV a 260 nm. Grazie allo spettrofotometro è possibile controllare la denaturazione. Quando la temperatura della soluzione di DNA viene abbassata lentamente, i singoli filamenti si riappaiano con quelli complementari, ricostituendo una doppia elica regolare. Quando la temperatura della soluzione di DNA viene abbassata rapidamente (ghiaccio) si forma un così detto gomitolo statistico, prevalentemente dato da legami a idrogeno intramolecolari. Alcune regioni a doppio filamento scaricano energia. Una provetta con due tipi di doppi filamenti diversi ma molto simili e della stessa lunghezza. Calore denaturazione, singoli filamenti. Riporto a temperatura ambiente ibridazione, appaiamenti casuali fra i diversi singoli filamenti, eventuali mis-match.

Concetto di sonda di RNA o DNA si basa sull'ibridazione degli acidi nucleici. Molecola in largo eccesso spesso marcata con sequenza complementare a sequenza (per esempio di un gene) di mio interesse. Denaturo DNA e aggiungo sonda in largo eccesso affinché vi siano maggiori probabilità di appaiamento. Poi rinaturazione e misura della radioattività o della chemiluminescenza a seconda di come la sonda fosse marcata. Riconosco da contesto sequenza di mio interesse.

Esempio: ibridazione su colonia

Ciascuna colonia contiene all'interno una diversa sequenza di DNA. Foglio di nitrocellulosa tenuto premuto su una piastra nella quale vi sono le colonie, alcune cellule batteriche vi aderiranno. Foglio trattato con sostanze che rompono la membrana cellulare e denaturano il DNA che rimane adeso al foglio in una regione che rispecchia dove la colonia si trova sulla piastra. Aggiunta di una sonda radioattiva, incubazione e in seguito misura della radioattività per vedere quale colonia ha integrato la sequenza nucleotidica di mio interesse.

Proteine

Le proteine sono macromolecole da cui dipendono praticamente tutte le attività della cellula: esse sono strumenti e macchine molecolari che permettono il funzionamento della cellula. Come enzimi le proteine aumentano a velocità delle reazioni metaboliche. Come ormoni, fattori di crescita e attivatori genici svolgono funzioni di regolazione. Come recettori e trasportatori di membrana selezionano ciò che reagisce con la cellula entrando e uscendo. Formando filamenti contrattili costituiscono l’apparato per l’attività motoria. Formando fibre forniscono il sostegno meccanico sia alla cellula sia all’ambiente che la circonda.

Le proteine, fra le loro numerose funzioni, agiscono anche da anticorpi, da tossine, fanno coagulare il sangue, assorbono o rifrangono la luce e trasportano sostanze da una parte all'altra del corpo. Formate da catene lineari di amminoacidi (20 diversi) che poi si ripiegano in diverse conformazioni tridimensionali.

Amminoacido

Formato da:

• Gruppo amminico NH₂
• Gruppo carbossilico COOH
• Gruppo R che rappresenta il resto della molecola e può essere: polare, apolare, acido, basico.

Apolari (idrofobici e privi di carica)

• Glicina
• Alanina
• Valina
• Isoleucina
• Triptofano
• Fenilalanina
• Prolina
• Metionina
• Leucina

Polari (idrofilici e privi di carica)

• Serina
• Treonina
• Tirosina
• Asparagina
• Glutammina
• Cisteina

Acidi (carichi -)

• Acido aspartico
• Acido glutammico

Basici (carichi +)

• Lisina
• Arginina
• Istidina

Legame peptidico

Si forma tra gruppo carbossilico del primo amminoacido e gruppo amminico del secondo. Gruppo -OH + -H condensazione e perdita di una molecola di acqua.

Struttura delle proteine

• Ogni proteina assume un'unica conformazione anche se ne potrebbe assumere teoricamente un numero enorme, ma assume quella più conveniente dal punto di vista energetico.
• Le istruzioni per assumere quella conformazione unica sono contenute nella sequenza amminoacidica (struttura primaria).
• Non siamo ancora capaci di poter prevedere con assoluta certezza la conformazione di una proteina.
• Il folding è per lo più influenzato dal comportamento della proteina in ambiente acquoso (residui idrofobici).