Biologia molecolare

PYROSEQUENCING

∎

No elettroforesi, no ddNTPs

Si basa su per ogni evento di polimerizzazione, avviene il rilascio di un pirofosfato

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- Pirofosfato viene convertito in una molecola di ATP dall’ATP SOLFORILASI

- Produzione di una molecola di luce dalla luciferasi 1 ATP 1 FOTONE

⇾

Nucleotide polimerasi fosfodiesterico + pirofosfato

⇾ ⇾legame

PPi + APS ATP solforilasi ATP + solfato

⇾ ⇾

ATP + luciferina + ossigeno luciferasi AMP + PPi + ossiluciferina + CO2 + LUCE

⇾ ⇾

Primer si ibrida allo stampo a singola elica amplificato per PCR e viene incubato con:

→ - DNA polimerasi

- ATP solforilasi

- luciferasi

- asprirasi

- dNTP

- adenosin 5’ fosfosolfato APS

- luciferina

Aggiunta di un desossinucleotide trifosfato alla volta con andamento ripetitivo

→ - se non complementare viene degradato

- se complementare viene incorporato grazie alla DNA polimerasi

ogni evento di incorporazione accoppiato a rilascio di un pirofosfato

In presenza di adenosina 5’ fosfosolfato (APS),

→ ATP solforilasi converte il PPi ad ATP che a sua volta guida la conversione, catalizzata dalla luciferasi, di

luciferina ad ossiluciferina con conseguente produzione di luce di intensità proporzionale alla quantità di ATP

La luce prodotta è rilevata da una CCD camera e visualizzata come picco in un pirogramma

→ L’aspirasi, un enzima che degrada nucleotidi, degrada continuamente tutti i dNTP non incorporati e l’ATP in

→ eccesso (non appena la degradazione è completata viene aggiunto un altro dNTP)

I dNTP vengono aggiunti sequenzialmente, uno alla volta

→ poiché il ATP è un substrato naturale della luciferasi, allora viene utilizzata la desossiadenosina α-tio-trifosfato

(dATPS) che viene riconosciuta dalla DNA polimerasi

Man mai che il processo continua, il filamento di DNA complementare è

sintetizzato e la sequenza nucleotidica è determinata dai picchi del pirogramma

Di solito usato per confermare sequenza già analizzata, risequenziamento

SEQUENZIAMENTO DI SECONDA GENERAZIONE

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- Non è più necessaria la fase dell’elettroforesi, la lettura della sequenza viene effettuata step by step

- E’ sempre necessaria la fase di amplificazione del DNA ma viene effettuata in nanoreattori in emulsione

Tre tecnologie attualmente disponibili: - Roche/454 pyrosequencing

- Applied biosystems SOLID sequencing by ligation

- Illumina/Solexa modified Sanger

- NEXT GENERATION SEQUENCING NGS

Con il sequenziamento di Sanger ad alta processività:

Preparazione della libreria

→ frammentazione casuale del DNA genomico, clonazione e trasformazione in batteri

Raccolta delle colonie

→

Necessari circa 7/10 gg

Purificazione del DNA dalle colonie, sequenziamento Sanger, elettroforesi capillare

→ Risequenziamento

→

Necessarie settimane/anni: dipende dalla dimensione del genoma e dagli strumenti utilizzati

Con il sequenziamento di nuova generazione:

Preparazione della libreria

→ frammentazione casuale del DNA genomico, ligazione agli adattatori

Amplificazione clonale dei frammenti

→

Necessari 1/3 gg

Sequenziamento mediante sintesi e ligazione

→ Processamento delle immagini

→ Mappatura delle reads su un genoma di riferimento o assemblaggio de novo

→

Necessari 1/6 giorni

Preparazione di una libreria dei frammenti

Frammentazione del DNA

→ Ligazione delle sequenze A e B alle estremità dei frammenti (adattatori)

→ Purifico frammento che si sono ligati alle sequenze A e B (ibridazione con sfere che hanno sequenze sequenze

→ complementari agli adattatori)

Ho tanti frammenti somma genoma

⇾

Attacco dei frammenti a sferette con adattatori, a una sfera si lega solo un frammento

→ Si emulsionano le sferette in una water-in-oil mixture contenente i reagenti per l’amplificazione PCR,

→ amplificazione clonale

in ogni bolla una sola biglia con frammento PCR ne ottengo milioni di copie

⇾

Il sequenziamento inizia con la preparazione della piastra PicoTitier

→ durante questo passaggio una miscela di beads, enzimi per il sequenziamento e la libreria di DNA a singolo

filamento vengono depositati nei pozzetti di 44 µm

Il processo di deposizione delle beads massimizza il numero di pozzetti che contengono un frammento

→ individuale della libreria sstDNA

La piastra PicoTiter viene caricata sul sequenziatore

→

1 sola biglia per pozzetto, sequenziamento avviene nei pozzetti

Aggiunta primer complementari alle sequenze A o B, DNA

→ polimerasi e luciferasi

Aggiunti dATP (modif), dGTP, dTTP, dCTP

→ uno alla volta, cella per cella

Luce per vedere se incorporano

→

SEQUENZIAMENTO DI NUOVA GENERAZIONE

Metodiche si basano sul principio del sequenziamento di ‘cluster’ clonali

Il processo, che incomincia con una singola molecola target, prevede la creazione di targets clonali durante un

processo intermedio di amplificazione. Copie multiple identiche sono infatti necessarie per avere un alto

rapporto segnale-rumore.

Alto costoso, usato per sequenziare sequenze molto lunghe

No usato per sequenziare un nuovo genoma, rilettura e confronto con sequenza sana (nel caso di malattia)

Studio su polimorfismi

Studi su trascrittomi

Studi di mutazioni

STUDIO DELLE PROTEINE

Quali proteine vengono espresse dalla cellula?

Come differisce l’espressione delle proteine da una cellula sana a una malata?

Utilizzo SONDA ANTICORPO

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ANTICORPO: si ritrovano nel sangue e sono usati dal sistema immunitario per identificare e neutralizzare

sostanze estranee, come batteri e virus

ANTIGENE: qualunque sostanza che introdotta in un organismo stimola la produzione di un anticorpo

SAGGIO IMMUNOENZIMATICO: tecnica di laboratorio che si avvale del legame tra antigene e il suo anticorpo

omologo per identificare /o quantificare uno specifico antigene o anticorpo

in un campione

Anticorpo come sonda permette di rilevare assenza/presenza/livello di trascrizione di certa proteina

organismo deve fare anticorpo contro quella proteina

inietto in un altro animale che la riconosce come non propria e per questo produce anticorpi e prendo il suo

sangue

Antigene è una molecola che suscita una risposta anticorpale

animale sviluppa anticorpo dipende quanto è diverso

⇾ regioni proteiche che differiscono per 10/12 aa sono sufficienti a stimolare

risposta

ANTICORPI POLICLONALI: riconoscono molteplici epitopi

generalmente prodotti in coniglio (ma anche topo, gallina, capra, struzzo)

ANTICORPI MONOCLONALI: procedura complessa di fusione cellulare e screening che ci porta ad avere cloni

singoli che producono un solo tipo di anticorpo capace di riconoscere un solo

epitopo (generalmente prodotti in topo)

Recettori delle cellule immunitarie riconoscono porzione

dell’antigene detta epitopo

Anticorpi molecole con strutture simili a una Y

le due braccia sono responsabili del riconoscimento degli

antigeni

lo stelo è formato da una regione molto meno variabile

2 catene leggere e 2 catene pesanti

Catene pesanti restano costanti, catene leggere sono variabili

Anticorpo PRIMARIO:

isolare e purificare la proteina in esame

iniettare la proteina in un animale che riconoscerà la proteina

come estranea e produrrà anticorpi contro quella proteina

Isolare e purificare gli anticorpi

Anticorpo SECONDARIO:

generato contro le proteine della specie animale in cui è stato

prodotto il primario

Anticorpo SECONDARIO riconosce la catena pesante

ANTICORPO PRIMARIO

Anticorpo che può riconoscere una proteina (antigene)

ANTICORPO SECONDARIO

Anticorpo che riconosce anticorpo primario

Più sensibile

Di solito legato a enzima o a molecola fluorescente riconoscimento dell’antigene di interesse

⇾

Se anticorpo primario prodotto in mouse, secondario deve essere anti-mouse (prodotto in altro animale)

L'anticorpo secondario viene prodotto contro la specie ospite utilizzata per generare l'anticorpo primario; per

esempio, se si utilizza un anticorpo primario prodotto in rabbit, servirà un anticorpo secondario anti-rabbit

prodotto in una specie ospite diversa dal coniglio (per es. secondario di mouse anti-rabbit)

WESTERN BLOT

∎

Serve per identificare proteina specifica all’interno di un estratto proteico separato per Western blot

Nel mio estratto proteico è espressa o no proteina di interesse (di cui ho anticorpo)?

Fare un estratto proteico

→ Separare e rendere negative le proteine mediante SDS-PAGE

→ Trasferimento delle proteine dal gel al filtro di nitrocellulosa

→ deve avvenire elettricamente per via dell’alta densità dell’acrilammide, per questo non avverrebbe per

capillarità, migrano verso anodo

Saturare i siti aspecifici della membrana bagnandola nel latte, caseina occupa i siti non occupati dalle proteine

→ del mio estratto proteico

Aggiunta di una soluzione contenente l’anticorpo primario, incubazione e lavaggio

→ Aggiunta di una soluzione di anticorpo secondario

→ aumenta specificità del riconoscimento proteina di interesse, costerebbe troppo marcare anticorpi primari

prodotti iniettando porzione costante dell’anticorpo primario (catene pesanti) in un altro animale, che

produrrà degli anticorpi contro quell’anticorpo

Anticorpo secondario riconosce catena pesante dell’anticorpo primario, ha legato covalentemente:

- enzima come la perossidasi di rafano, dando substrato emette luce, quanti di luce impressi su lastra

- molecola fluorescente, rilevata al microscopio fluorescente o grazie ad altri macchinari

Detection dell’anticorpo secondario (in base a cosa aveva legato)

→

Anticorpo policlonale maggiore sensibilità, più alta probabilità di risposte spurie

⇾

Anticorpo monoclonale minore sensibilità, più accuratezza e specificità

⇾

Per produrli non serve sempre sopprimere animale, clonano

SAGGIO ELISA

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Paziente probabilmente infetto, quale titolo di virus o proteina ha nel suo sangue?

Micropiper pozzetti rivestiti da anticorpi contro specifici antigeni che voglio studiare

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Metodo DIRETTO:

Anticorpo primario per antigene posto sul fondo del pozzetto

→ Aggiunta del siero del paziente in cui potrebbe esserci antigene, diverse concentrazioni non note

→ Eventuale legame anticorpo-antigene (se presente)

→ Lavaggio dell’antigene in eccesso che non si è legato

→ Aggiunta anticorpo secondario coniugato a enzima

→ es. anticorpo anti-immunoglobuline umane legati a perossidasi di rafano o fosfatasi alcalina

Lavaggio

→ Aggiunta substrato enzima dà luogo a reazione colorimetrica

→ ⇾

- perossidasi: s