Appunti esame biologia molecolare

Il promotore e l'oloenzima RNA polimerasi

Il promotore è quella regione di DNA che è riconosciuta dall'oloenzima RNA polimerasi. Nei batteri ci sono diversi fattori ma il principale viene chiamato σ70 perché ha un peso molecolare di 70 kDa. Il fattore riconosce in modo specifico un promotore che ha 2 sequenze molto conservate: la sequenza -35 e la sequenza -10. La distanza tra queste due sequenze è di 17-19 paia di basi. Queste sequenze si trovano a monte del sito di inizio della trascrizione e prendono il nome di pribnow box. Sono sequenze ricche in adenina e timina. Una zona ricca in adenina e timina è una zona più facilmente denaturabile. È richiesta quindi meno energia per rompere i legami a idrogeno e per formare quindi il complesso aperto.

Dal confronto fra le sequenze di 300 promotori di E. Coli riconosciuti da σ70 è stata ottenuta la sequenza consenso del promotore. Si è visto infatti che intorno alla regione -10 e intorno alla

Regione -35 e promotori

Di questi promotori c'erano dei nucleotidi più frequenti. Tanto più la sequenza di un promotore è identica a quella del consenso tanto maggiore sarà la forza del promotore. Non tutti i promotori sono esattamente uguali ma ci possono essere delle differenze. Ci sono infatti promotori più o meno forti.

Qui vediamo alcuni tipi di promotori riconosciuti da:

In a vediamo il classico σ 70 promotore con le due pribnow box.

In b osserviamo un promotore forte (come ad esempio i promotori per la trascrizione dei geni per l'rRNA). Questo promotore ha la caratteristica di avere a monte della sequenza -35 un elemento chiamato up. Questa sequenza viene riconosciuta dalla coda C-terminale della subunità α della polimerasi.

In c vediamo dei promotori che mancano della sequenza -35 ma in compenso hanno una sequenza -10 più estesa.

In d osserviamo un promotore che a valle della sequenza -10 presenta un elemento discriminatore. I diversi domini

Il dominio 4 è responsabile dell'interazione ad alta affinità con il promotore mentre il dominio 2 è responsabile dello svolgimento della doppia elica (la sequenza -10 è più facilmente denaturabile). Il passaggio da complesso chiuso a complesso aperto è definito isomerizzazione. L'isomerizzazione prevede dei cambiamenti conformazionali. Osserviamo come il DNA riesce a spostare via il dominio 1 del fattore σ per potersi infilare nel canale. Quando avviene anche un altro cambiamento conformazionale che sposta il dominio 4 del fattore allora si può avere l'allungamento dell'RNA. La fase iniziale della sintesi dell'RNA è descritta da 3 possibili modelli. Una volta che l'RNA polimerasi ha subito isomerizzazione, l'enzima inizia a trascrivere, ma fa degli eventi abortivi. Sintetizza cioè dei brevi RNA che poi vengono dissociati. Questi 3 modelli spiegano come vengono fatte queste

canale d'uscita dell'RNA.σQuando la polimerasi deve lasciare il promotore per andare avanti con l'allungamento la subunità si deve dissociare. Questa subunità si dissocia proprio quando avviene il cambiamento conformazionale che porta allo spostamento del dominio 4 e alla liberazione del canale d'uscita dell'RNA. Infatti, viene a mancare l'interazione con la sequenza -35 e può dissociarsi. L'RNA polimerasi continua a legare il DNA e a catalizzare la sintesi di RNA.

L'RNA polimerasi ha un tasso di errore pari 1/10. Per ovviare a questo problema la polimerasi ha sviluppato una capacità endogena di correzione di bozze. La polimerasi splica la correzione di bozze attraverso 2 meccanismi diversi: l'editing pirofosfolitico e l'editing idrolitico. Nell'editing pirofosfolitico l'enzima catalizza la rimozione del ribonucleotide inserito in maniera sbagliata tramite la

re-incorporazione di un gruppo pirofosfato. In realtà si è visto che l'enzima può rimuovere anche i ribonucleotidi appaiati in modo corretto. Nell'editing idrolitico l'enzima torna indietro di uno o più nucleotidi tagliando il nucleotide appaiato in maniera scorretta attraverso l'idrolisi del legame fosfodiesterico. Questo meccanismo è stimolato da fattori proteici (GreA e GreB). Vediamo ora come avviene la terminazione. Esistono delle sequenze che si chiamano terminatori che segnalano alla polimerasi di staccarsi dal DNA e quindi di rilasciare la catena di RNA neosintetizzata. Nei procarioti abbiamo 2 tipi di segnali terminatori. I terminatori intrinseci o rho-indipendenti inducono la polimerasi a staccarsi dal complesso senza l'aiuto di alcun fattore aggiuntivo. A livello del DNA il terminatore rappresenta due sequenze ripetute e invertite chiamate sequenze palindromiche. Queste sequenze sono ricche in C e G. Dopo queste 2 sequenze

(più a destra) c’è un tratto riccoin A e T. Quando l’RNA polimerasi trascrive queste sequenze palindromiche l’RNAappena trascritto conterrà 2 sequenze che sono tra loro complementari. Il trascritto potràquindi andare a formare una struttura a forcina. La forcina è detta forcina diterminazione. In seguito alla trascrizione del tratto ricco in A e T si formeranno degliappaiamenti A-U. Questi appaiamenti sono i più instabili tra tutti gli appaiamentipossibili. Di conseguenza il complesso trascrizionale così destabilizzato (attraverso laformazione della forcina e degli appaiamenti A-U) potrà dissociarsi e l’RNAneosintetizzato verrà rilasciato.

Il terminatore rho-dipendente è costituito da una sequenza di circa 70-90 nucleotidi riccain C e povera in G. Questo terminatore richiede la presenza di rho.Rho è una proteina omoesamerica (6 subunità uguali) con attività ATPasica ed

elicasicaRNA-dipendente che si lega all'RNA a monte del terminatore. Rho riconosce in modo specifico la sequenza di circa 70-90 nucleotidi ricca in C e povera in G. Una volta che la proteina si è legata agisce come una elicasi ATP-dipendente promuovendo il distacco della RNA polimerasi. Una volta che sono state trascritte le sequenze ricche in C, rho si lega all'RNA con queste sequenze ricche in C. Rho si muove sull'RNA grazie all'attività ATPasica. L'attività ATPasica fornisce infatti l'energia per il movimento. A valle della sequenza di 70-90 nucleotidi ricca in C e povera in G si trova un'altra sequenza palindromica molto importante. Una volta che la polimerasi trascrive questa sequenza si forma una struttura a forcina che rallenta o addirittura blocca la polimerasi. In questo modo rho può raggiungere la polimerasi determinandone il distacco. Viene attivata l'attività elicasi di rho per dissociare l'ibrido RNA-DNA.

Si ha quindi il rilascio del trascritto. Durante la trascrizione il livello di superavvolgimento viene modificato. Con l'avanzare dell'RNA polimerasi sul DNA si ha un accumulo di superavvolgimenti positivi a valle e un accumulo di superavvolgimenti negativi a monte. I superavvolgimenti positivi potrebbero bloccare l'avanzamento dell'RNA polimerasi. Devono quindi intervenire delle topoisomerasi per rimuovere questi superavvolgimenti. Questo modello è stato definito "modello dei domini gemelli" per indicare il fatto che il DNA che si trova a valle e il DNA che si trova a monte vanno incontro a due diversi tipi di superavvolgimento. Alcuni promotori risentono molto del livello di superavvolgimento. Il livello di superavvolgimento influenza infatti l'efficienza dei promotori. La direzione della trascrizione lungo una regione del cromosoma batterico può avvenire in entrambe le direzioni. Alcuni geni sono trascritti usando uno dei filamenti.

comestampo mentre altri sono trascritti usando l'altro filamento. La direzione di trascrizione è determinata dal promotore all'inizio di ciascun gene (frecce verdi). Nei procarioti trascrizione e traduzione sono accoppiate. Nei batteri in realtà anche il processo di degradazione dell'RNA è accoppiato. La nucleasi, che va a degradare l'RNA trascritto, può agire direttamente durante la trascrizione. Si verificano quindi contemporanei processi di trascrizione, traduzione e degradazione dell'RNA. Questo processo è rapido: l'RNA ha infatti una vita media di massimo 3 minuti. C'è quindi una competizione tra i ribosomi che traducono le proteine.