Biologia molecolare del DNA

STRUTTURA DEL DNA

DNA-B (Forma più comune)

• Passo dell'elica: 34 Å
• Ogni giro contiene ~10,5 bp
• Diametro elica: 20 Å
• Spazio tra le coppie di basi ASSENTE

⇒ APPAIAMENTO TRA LE BASI

1. CANONICO (Watson e Crick) A≡T C≡G

2. NON CANONICO (Hoogsteen) A≡T G≡C

⇒ Negli appaiamenti di Hoogsteen la CITOSINA È PROTONATA Per questo, nell'ambiente non acido della cellula, le coppie CG di Hoogsteen non possono formarsi. Poiché la transizione teorica tra le coppie Watson-Crick e le Hoogsteen comporta la rotazione di 180° delle basi, l'unico modo per avere le Hoogsteen sarebbe ruotare le basi di tutta l'elica. Per questo le basi in tripla sono sempre nelle coppie W/C.

NB. Le coppie Hoogsteen sono sfruttate in catene peptidiche (PNA) per formare triple eliche in corrispondenza di sequenze da utilizzare con antibiotici di nuova generazione

• Stacking e twist

A, T, C, G sono INSOLUBILI IN H₂O. LO SPAZIO TRA UNA BASE E L'ALTRA DEVE ESSERE EVITATO PER IMPEDIRE L'ACCESSO DALL'ACQUA. Ma la distanza tra i due zuccheri (6 Å) non può variare oltre un certo limite (< 5.5 Å > 6.5 Å).

Data l'incompatibilità del gruppo fosfato (i = costante dello spazio di 6 Å) è impossibile riempire lo spazio interposto di 2.7 Å per semplici sollecitamenti

contatti atomici tra le basi. L'unico modo per riempire lo spazio è una rotazione sull'asse verticale, un TWIST, che nel DNA B è DESTRORSO E DI CIRCA 35°. Il twist porta a contatto le basi, eliminando l'acqua tra loro interposta (STACKING).

NB: Intercalanti del DNA (ex. Etidio Bromuro) si inseriscono tra i bp opponendosi al TWIST, e "UNTWISTANO" il DNA. ex. EtBr untwista di circa 26°

⇒ La ripetizione polimerica dello stesso twist destrorso GENERA UNA DOPPIA ELICA DESTRORSI DI ASPETTO COMPLESSIVAMENTE REGOLARE. ⇒ NB: la disposizione spaziale delle coppie di Watson e Crick è responsabile della formazione dei solchi maggiore e minore.

SOLCO MAGGIORE l'80% DELLE PROTEINE CHE LEGANO IL DNA ACCEDONO DA QUI POCHE PROTEINE (ex TBP) LO PENETRANO SOLCO MINORE

CURVATURA DEL DNA

(Esempi)

Le curve a, b, c sono COERENTI. In a) si ha una variazione di roll di ± 45° ogni giro d'elica (ogni 10 nt). In b) il roll varia di ± 22,5° ogni 5 nt. In c) la variazione di roll è continua, e segue un andamento sinusoidale in linea con il passo della doppia elica.

DNA intrinsecamente curvo

È stato osservato in saggi elettroforetici, facendo correre frammenti di restrizione che avevano la stessa lunghezza in base alle previsioni: la differente distanza di migrazione dei frammenti fa supporre la curvatura intrinseca (dipendente dalla sequenza specifica) del frammento in ritardo.

Lunghezza apparente------------Lunghezza teorica

Fattore di ritardo elettroforetico

Aumento per DNA curvi.

NB: La temperatura aumentata riduce la, quindi si potrebbe ridurre la curvatura

DNA-Z

NB. è sinistrorso

Il DNA-z è stato scoperto da Alexander Rich negli anni '70, studiando sequenze GC ripetute (lunghe almeno 15/20 nt).

Struttura

Nel DNA-z vi è un'alternanza di dinucleotidi CG. Nella guanina il legame glicosidico è in conformazione sin, e nella citosina è in anti (in DNA-A e -B sono sempre entrambi in anti). Questo alternanza porta a una distorsione nell'elica, e seguendo il profilo dello scheletro fosfodiesterico si ha una linea a zig-zag (da qui DNA-z). Lo zig-zag è sobanto al fatto che ogni coppia di basi è costretta a ruotare di 180° rispetto l'altra.

Il DNA-z è favorito da alte forze ioniche (schermano i fosfati troppo vicini) e dal supercoiling negativo. È anche favorita dalla presenza di citosine metilate (-CH3 ingombra i buelli laterali del zig-zag).

Biologia

L'esistenza naturale del DNA-z è stata prima osservata con gli esperimenti di Rich; osservò l'esistenza di anticorpi anti-DNA-z in pazienti col lupus eritematoso. Altri esperimenti hanno dimostrato l'alta affinità di alcune proteine cellulari per il DNA-z. Altri esperimenti di deproteinizzazione di cromosomi politenici di Drosophila in ambienti acidi hanno mostrato un segnale di fluorescenza con anticorpi anti-z. La questione rimane comunque aperta: non è stata dimostrata la presenza di DNA-z nei viventi.

Triple e quadruple eliche

Esistono forme specifici di DNA a tripla e quadrupla elica. (->vedi RNA a tripla elica) ND. le quadruple sono tratti ad elica quadrupla formati nei telomeri per proteggere da nucleasi ed eventi di ricombinazione.

REPLICAZIONE

• generalità

⇒ La replicazione è SEMICONSERVATIVA (⇒Exp. Meselson e Stahl)

→ Necessario esatto numero temporale per l'inizio della replicazione (FIRING)

→ Vengono sempre aggiunti desossiribonucleotidi trifosfato, con rottura delle legame tra P_α e P_β, e con rilascio di PIROFOSFATO P_β P_γ, degradato dalla PIROFOSFATASI per spostare l'equilibrio catabolico della polimerasi verso l'incorporazione. ↳ L'incorporazione del fosfato è stata dimostrata con esperimenti di incorporazione di ³²P.

DNA polimerasi

È paragonata a una mano destra particolarmente chiusa, con 3 domini importanti (pallice, dita e palmo).

Le DNA pol sono molto veloci (~ 1000 nt/s) grazie alla loro NATURA PROCESSIVA: una volta iniziata la sintesi non procede senza distacco dell'enzima per molti nt. Ciò avviene grazie alla Sliding Clamp (vedi dopo)

• → Il palmo contiene un foglietto β, che lega ioni metallici bivalenti (Mg²⁺ Zn²⁺), che hanno due ruoli fondamentali :

1. STABILIZZARE il dNTP in entrata legando i fosfati
2. AUMENTARE LA NUCLEOFILIA DELL'OSSIGENO 3'-OH prosperità della catena in allungamento, per favorire l'attacco di fosfato.

Il pollice della DNA pol forma molti legami a idrogeno con le nuove basi attraverso il solco minore della doppia elica, indipendentemente da quali basi siano. Ciò avviene correttamente solo se l'appaiamento è strutturalmente esatto. IN CASO CONTRARIO SI RIDUCE L'AFFINITÀ DNA pol - DNA, e la CATALISI RALLENTA E INTERVIENE IL RIPARO.

Studi recenti hanno dimostrato che in ogni forcella replicativa il replisoma è organizzato nel modo seguente:

• il core è _duto complesso 3
• del core sono legate 3 proteine e la sliding clamp
• alla proteina è legato ogni core di Pol III

L'intero replisoma ( con 3 Pol III core) è detto Pol III oleometria.

NB: Le proteine sono _dosi, e consentono di connettere l'adesina risultante le polimerasi si muovono indipendentemente.

Movimenti coordinati e associati del replisoma

Riparo BER (Base Excision Repair)

Il BER interviene su basi singole danneggiate, rimuovendole e riformando il sito AP (A-Purinico/Pirimidinico) generatosi o direttamente su siti AP formatisi per idrolisi spontanea delle basi.

Una volta individuato il sito AP, la APE1 crea un NICK e produce un 3'-OH per la DNA polimerasi: il BER può quindi procedere per 2 vie.

• SHORT-PATCH BER (maggiore) Viene sostituito solo il nucleotide con la base errata.
• LONG-PATCH BER (minore) Vengono cambiati una decina di nt a partire da quello alterato.

NB: Le glicosilasi hanno specificità di danno (11 glicosilasi di BER umane), e studi cristalografici hanno dimostrato che l'incisione di base è compiuta ribaltando la base stessa all'infuori della doppia elica.