Biologia molecolare - corso parte 1

ACIDI NUCLEICI

INTRODUZIONE

TERAPIA GENICA

Il professor Michele de Luca si occupa da molto tempo di terapia genica, in particolar modo egli ha curato

un paziente affetto da Epidermolisi bollosa attraverso la terapia genica applicata alle cellule staminali.

L’epidermolisi bollosa è una rara malattia della pelle, cute ed epitelio vanno incontro a scollamento e

formazione di bolle; vesciche e erosione della pelle e della mucosa in seguito a traumi minori (vengono

chiamati bambini farfalla in quanto molto delicati e non li si può toccare).

Il paziente che de Luca ha curato è un bambino di nome Assan; Assan sbarca in Italia dopo un duro viaggio

in barca, dall’Italia va in Germania dove la patologia progredisce e la sua pelle è completamente distrutta.

Circa l’80% della sua pelle è ricoperta da lacerazioni simili ad ustioni, a causa del forte dolore viene messo

in coma farmacologico per diversi mesi.

Si decide di chiamare de Luca in quanto si sa che ha ideato un meccanismo di terapia genica. Fare terapia

genica vuol dire che avendo individuato il gene responsabile della malattia si può clonare questo gene in un

virus, poi questo (lenti)virus, prodotto in maniera del tutto sicura (solitamente si usa il virus dell’AIDS

“smontato” in modo da renderlo non pericoloso), non viene, in questo caso, dato direttamente al paziente ma

lo si dà a campioni di pelle da lui prelevate.

De Luca sapeva infatti che nell’epidermolisi bollosa ci sono parti del corpo che, per motivi sconosciuti, non

vengono affette e possono quindi essere utilizzate per la terapia. Da queste parti vengono prese le cellule

staminali poi trasdotte/infettate con il (lenti)virus. Una volta che il gene si è

integrato nel genoma delle cellule del paziente, queste vengono utilizzate per

far crescere dei lembi di pelle che esprimono il gene corretto. Una volta

ottenuti questi lembi, per tre volte Assan è stato sottoposto a trapianti di pelle

(in 3 momenti diversi) fino a guarire completamente. Questo avviene perché il

gene ‘corretto’ si integra nelle cellule staminali che proliferano continuando a

produrre pelle sana, l’unica cosa che può avvenire è che il gene venga

inattivato, a questo punto si dovrebbe fare un altro trapianto, se possibile.

È importante che il gene venga integrato nel genoma nella posizione corretta,

perché se no diventa pericoloso. Infatti i primi esperimenti di terapia genica

che sono stati fatti avevano causato in alcuni pazienti la leucemia, molto

probabilmente erano stati integrati vicino ad un oncogene attivandolo e

portando allo sviluppo di un tumore. Per questo per un certo periodo vennero

bloccati, ora sono molto controllati.

TERAPIA CON LE CAR-T CELLS

Vi è poi la terapia con le Car-T cells (chimeric antigen receptor) durante la quale vengono isolate le cellule T

dal paziente perché si vuole produrre delle cellule che nel paziente vadano ad aggredire il tumore attraverso

il sistema immunitario; quindi vengono prelevate le cellule T dal paziente, attraverso l’utilizzo di un virus

tali cellule vengono indotte ad esprimere un recettore che sia in grado di far legare la cellula modificata al

tumore in considerazione (quindi deve essere un recettore che riconosce qualcosa di tipico delle cellule

tumorali), le cellule modificate vengono poi espanse in coltura, vengono reiniettate nel paziente che possiede

un’arma in più per combattere le cellule del tumore. Approccio che viene molto utilizzato quando un

paziente non risponde più alle cure. Lo sviluppo di questo approccio terapeutico è stato possibile grazie alle

conoscenze di immunologia (biologia molecolare e cellulare del sistema immunitario), biologia cellulare e

terapia genica e molte altre tecniche di biologia molecolare utili a manipolare le T cells.

TEST MOLECOLARI PER IL COVID 19

Il covid è l’emblema di cosa la ricerca ha permesso perché da una parte abbiamo sviluppato

velocissimamente dei test antigenici e molecolari (che si basano sulle tecniche della real time PCR e del test

di Elisa che poi verranno visti nel dettaglio e saranno materia d’esame) dall’altra siamo riusciti a produrre

dei vaccini in tempi molto rapidi perché conoscevamo già la biologia molecolare del corona virus, perché

conoscevamo già come poter sviluppare dei vaccini contro altri virus simili essendo già stato sviluppato un

vaccino per la MERS (mai utilizzato perché poi è sparita) e perché sono stati messi a punto dei virus a RNA

che non erano mai stati utilizzati prima e che sono stati resi

possibili dalle conoscenze acquisite fino ad adesso.

IL CORSO DI BIOLOGIA MOLECOLARE: IL FLUSSO

DELL’INFORMAZIONE DAL DNA ALLE PROTEINE

PASSANDO PER L’RNA

Il concetto del corso sostanzialmente è duplice: da una parte il fatto che alla fine nelle nostre malattie molto

spesso c’è un processo che non sta funzionando molto correttamente ed è un processo “molecolare

biochimico”. Quindi l’alterazione del processo molecolare biochimico sarà probabilmente dovuto a delle

mutazioni, che avvengono nel DNA (e questa è la parte più di genetica), ma queste mutazioni poi possono

alterare alcuni pathways molecolari (noi ovviamente non li facciamo tutti). Tuttavia, a volte quello che viene

a cambiare è l’espressione genica. Quello su cui io vorrei insistere è che molto spesso le nostre malattie,

direttamente o indirettamente, alterano la nostra espressione genica, e per espressione genica si intende che

abbiamo il depositario dell’informazione genetica, che è il DNA (e quindi dobbiamo vedere come è stato

scoperto che il DNA è il depositario dell’informazione genetica e come è fatto). Questo DNA poi, per dare

origine al prodotto finale, che spesso è una proteina, deve essere trascritto (quindi vedremo poi come

avviene la trascrizione e come viene regolata). Una volta che il trascritto (una molecola di RNA) è stato

prodotto, viene fatta, molto spesso ma non sempre, una proteina (quindi vedremo come avviene il processo

di sintesi proteica o di traduzione). Vedremo nel dettaglio tutti questi processi: come è fatto il DNA, come

questo viene trascritto, come è fatto l’RNA e come questo viene tradotto. Contestualmente ovviamente

quello che noi siamo lo dobbiamo al fatto che continuiamo a mantenere stabile la nostra informazione

genetica attraverso la replicazione, e quindi andremo a vedere anche il processo della replicazione. Quando

dico che andiamo a vedere il processo intendo che andiamo a vedere, questa volta nel dettaglio, i

meccanismi molecolari con cui questi processi avvengono: come vengono regolati, come vengono

controllati, che cosa succede se va storto e se abbiamo delle modalità per intervenire qualora uno di questi

processi vada storto e sappiamo che è causa di una particolare patologia.

STORIA DEGLI ACIDI NUCLEICI

La storia degli acidi nucleici consiste nel capire come si è scoperto che sono loro a trasmettere

l’informazione genetica. Ma la prima cosa che ovviamente è stata scoperta è che esiste un cosiddetto

“principio trasformante”, un’informazione che, se spostata da una cellula all’altra, è in grado di cambiare le

caratteristiche e gli attributi della cellula stessa.

Questo è stato fatto da uno pneumologo, Griffith, il quale stava studiando lo Streptococcus pneumoniae. In

particolar modo quello che si era scoperto ai tempi era che di Streptococcus pneumoniae esistevano due

ceppi: un ceppo che veniva chiamato R (“rough”, rugoso, per cui al microscopio si osservavano delle

colonie non traslucide) e un ceppo S (“smooth”, liscio, che invece osservato al microscopio dava una colonia

liscia). La differenza tra i due ceppi non era soltanto di tipo morfologico, data dal fatto che la colonia liscia

aveva una capsula polisaccaridica al suo esterno, ma anche dal punto di vista clinico. Infatti, il ceppo rugoso

è poco pericoloso quando infetta l’uomo, in quanto non

riesce ad evadere il sistema immunitario e quindi viene

distrutto, mentre la capsula polisaccaridica che riveste il

ceppo S lo rende molto più capace di evadere il sistema

immunitario.

L’ESPERIMENTO DI GRIFFITH (1928)

Griffith voleva capire che cosa ci fosse di differente tra il

ceppo S e il ceppo R, cioè qual era l’informazione che

era presente nelle cellule S e non nelle R, e che quindi determinava la loro differenza. Di conseguenza, per

capire se i batteri S hanno un’informazione che gli permette di fatto di costruirsi questa capsula esterna, egli

fece il seguente esperimento.

La prima cosa che fa è prendere i batteri S e dimostrare che siano veramente di tipo “smooth”, quindi

virulenti. Per fare ciò li inietta nel topo e il topo muore; inoltre si vanno a prelevare i batteri presenti nel topo

si vede che effettivamente vengono isolati dei batteri di tipo S.

Dall’altra parte, se invece si prendono dei batteri R, che quindi non hanno la capsula, e si iniettano nel topo,

questo sopravvive.

A questo punto, dopo aver dimostrato che effettivamente i batteri S si comportano come batteri S e i batteri

R come batteri R (il cosiddetto “controllo sperimentale”), la stessa quantità di batteri S viene scaldata al

calore in modo tale da ucciderli. Una volta uccisi, li inocula dentro al topo e il topo sopravvive. A questo

punto prende una stessa quantità di batteri S uccisi e li mescola con un’analoga quantità di batteri acapsulati

R e, dopo averli incubati per un certo tempo, li inietta all’interno del topo: quello che vede è che il topo

muore. Inoltre se si va a vedere quali sono i batteri all’interno del topo morto si vede che ci sono dei batteri

di tipo S. Questo significa che l’informazione presente nei batteri S che permetteva di costruire la capsula

polisaccaridica era passata dai batteri S uccisi al calore ai batteri R vivi trasformandoli in batteri S, e

rendendoli quindi capaci di costruire la loro capsula polisaccaridica.

Quindi questo esperimento permise a Griffith di dimostrare che esiste un cosiddetto “principio

trasformante”, ovvero un qualcosa che può passare da una cellula all’altra, e in questo modo dare a quella

cellula delle nuove proprietà, un nuovo fenotipo.

Questo esperimento ha dimostrato che la trasformazione è:

- definitiva: perché i batteri S, come si vedeva nell’immagine precedente, continuavano poi ad

uccidere i topi successivi

- ereditaria: perché le cellule nuove S propagano le cellule S successive e quindi appunto

continuiamo a uccidere i topi che vengono infettati

(Si nota intanto che già nel 1928 si faceva la sperimentazione animale, ovvero tutta quella ricerca che

viene fatta utilizzando degli animali. La sperimentazione animale non è vivisezione: quest’ultima consiste

nell’ applicare delle procedure sperimentali, che possono anche essere estremamente dolorose, con animali

svegli.

Con la sperimentazione animale, invece, non è possibile ed è estremamente vietato operare un animale da

sveglio: innanzitutto perché non etico, e poi perché non è sperimentalmente intelligente, in quanto un

animale che soffre non produce le giuste risposte che ci servono per la cura. Noi infatti vogliamo che

l’animale sia il migliore modello possibile di un uomo per cercare di trovare una cura.

La sperimentazione animale oggi viene fatta in molti laboratori ed è estremamente controllata: tutte le

procedure devono essere dichiarate e va chiesto il permesso al ministero. Ad oggi inoltre non c’è farmaco

che venga somministrata all’uomo la cui efficacia non sia stata prima dimostrata su almeno due modelli

animali, uno piccolo e uno grande. Questo dopo ciò che è avvenuto con la talidomide, farmaco che non è

stato provato su animali adatti e che si è poi rivelato pericoloso per l’uomo.)

Quindi Griffith dimostra l’esistenza di un principio trasformante. Ma la domanda successiva è: in quale

molecola è insito il principio trasformante?

Per noi è evidente che le molecole in questione sono gli acidi nucleici, ma ai tempi non era così. Infatti si

sapeva dell’esistenza degli acidi nucleici, ma il fatto è che non erano facilmente isolabili. Le molecole di

acidi nucleici che venivano isolate erano, infatti, molto corte, e ovviamente l’idea che l’informazione genica

fosse contenuta in una sequenza così piccola di nucleotidi era estremamente remota. Le proteine, invece,

erano molto più affascinanti: si riusciva ad isolarle in una dimensione maggiore, le combinazioni dei 20

amminoacidi erano molto differenti, etc. Quindi la

comunità scientifica voleva di fatto dimostrare che il

principio trasformante fosse insito nelle proteine.

L’ESPERIMENTO DI AVERY (1944)

Questo esperimento viene anche chiamato “la bomba di Avery”, in quanto la comunità

scientifica non è pronta a pensare che il DNA sia il depositario dell’informazione genetica,

e quindi il principio trasformante.

Il concetto dell’esperimento è identico a quello di Griffith: usiamo come sempre gli

pneumococchi S, che uccidiamo al calore, e otteniamo un estratto di contenuto cellulare (in

una provetta troveremo i lipidi, gli zuccheri, le proteine, l’RNA e il DNA).

A questo punto vengono tolti i lipidi e gli zuccheri in modo tale che rimangano soltanto le

proteine, l’RNA e il DNA delle cellule di tipo S. Per scoprire in quale di queste molecole

sia contenuto il principio trasformante, dividiamo il contenuto della provetta in tre.

Ad un terzo aggiungo le proteinasi, degli enzimi che idrolizzano le proteine. Quindi nel

primo estratto ho tolto le proteine e mi sono rimasti l’RNA e il DNA.

Nell’altro terzo aggiungo l’RNasi, quindi idrolizzo l’RNA e mi rimangono le proteine e il

DNA.

Nell’ultimo terzo aggiungo la DNasi, quindi tolgo il DNA e mi rimangono proteine e RNA.

Quindi produco tre provette che hanno la stessa quantità di estratto e in cui in una mancano

in una le proteine, nell’altra l’RNA e nell’ultima il DNA.

A questo punto a queste tre provette aggiungo le cellule R che, come abbiamo già visto, sono capaci di

acquisire il principio trasformante. Dopo aver aggiunto un’uguale quantità di cellule in tutti e tre gli estratti e

averli incubati per un tempo idoneo (piastro le cellule sul terreno e faccio crescere le colonie), vado a vedere

se le colonie saranno di tipo liscio o di tipo rugoso.

Vedo che se ho trattato con la proteinasi (non ci sono quindi proteine) la maggior parte delle colonie saranno

di tipo rugoso, in quanto l’evento che stiamo cercando è un evento raro, ma ci sono anche colonie lisce.

Se ho trattato con l’RNasi avrò ugualmente tante colonie rugose, ma anche lisce.

Invece se ho trattato con la DNasi noto che non avrò mai la comparsa di colonie di tipo liscio.

Questa è stata la prima dimostrazione che il principio trasformante individuato Griffith era contenuto nel

DNA, perché scompariva completamente se lo trattavo con DNasi.

LA TRASFORMAZIONE DI AVERY VISTA MOLECOLARMENTE

Dal punto di vista molecolare la nostra cellula S è fatta in questo modo: all’esterno, in giallo,

abbiamo la capsula, sotto in verdino la membrana plasmatica e poi abbiamo il genoma (che, come

ricordiamo, nei procarioti è un unico cromosoma circolare covalentemente chiuso, quindi una molecola

circolare saldata).

In questa immagine vi fa vedere che a fronte di un “n” numero di geni ci sarà un gene, indicato in giallo, che

determina la produzione del capside.

Se noi rompiamo la cellula al calore ci immaginiamo che durante il trattamento si siano rotte la parete, la

membrana plasmatica e si sia anche disintegrato il DNA in tanti frammenti. Di questi frammenti alcuni

potranno avere l’informazione necessaria e sufficiente per produrre la capsula.

Questi frammenti di DNA vengono in contatto con la cellula rugosa che è viva. La cellula rugosa viva non

ha l’informazione per fare S, ma ha l’informazione per fare una parete diversa (allele capR). Quindi quello

che succede è che noi mettiamo l’estratto delle nostre cellule a contatto con le cellule rugose, le cellule

rugose ogni tanto faranno entrare le molecole di DNA, e tra di esse ogni tanto potrà entrare il frammento di

DNA che porta il gene capS. A questo punto, se questo per ricombinazione si integra nel genoma, abbiamo

prodotto un organismo che è geneticamente modificato (OGM) in cui quello che è successo è che abbiamo

dato la capacità alla cellula rugosa di diventare di tipo S.

Il problema è che il mondo scientifico non era pronto ad accettare che il DNA fosse il depositario

dell’informazione genetica, quindi si è iniziato a dire che l’esperimento fatto da Avery fosse un esperimento

che probabilmente aveva al suo interno un artefatto, un problema per cui si erano ottenuti tali risultati. Di

conseguenza è stata necessaria una seconda prova scientifica, ovvero l’esperimento fatto da Chase and

Hershey.

L’ESPERIMENTO DI CHASE E HERSHEY

In questa fase, invece di avvalersi dello pneumococco si avvalgono dei fagi, dei virus che infettano i batteri.

Come sappiamo i virus sono fatti da un capside di tipo proteico che serve a proteggere il materiale genetico,

a contenerlo e anche poi ad interagire con quello con cui devono interagire per introdurre il proprio

materiale genetico all’interno della cellula. A questo punto il materiale genetico viene iniettato all’interno

della cellula, che sia procariotica o eucariotica (nei fagi è procariotica), e la cellula diventa “schiava” del

virus mettendosi a produrre particelle virali. Il genoma del virus può essere di DNA o di RNA e questo

dipende dal virus che stiamo trattando. Nel caso dei fagi sappiamo che il virus è a DNA.

Quindi Chase e Hershey decidono volutamente di lavorare con un virus perché in questo modo possono

lavorare con o