Biologia molecolare - corso parte 1

Spiegazione sui fluorocromi

Per marcare una sonda si utilizzano il fosforo, lo zolfo, il trizio o i fluorocromi. La Southern, tecnica che abbiamo già visto, si avvale ancora della radioattività perché permette di avere un migliore risultato rispetto all'utilizzo dei fluorocromi con i quali alcuni vantaggi si perdono.

Northern Blotting

Tecnica successiva alla Southern che concettualmente è la stessa cosa, ma che risponde a una domanda scientifica diversa. Nella Southern si voleva vedere se, all'interno di una miscela di molecole di DNA, che è stata separata mediante elettroforesi e trasferita poi su un filtro di nitrocellulosa, fossero evidenti uno o più frammenti di DNA complementari alla sonda che testimonia che in quel genoma esiste quell'informazione.

Nel caso, invece, della Northern blot la domanda è:

"All'interno della miscela di molecole di RNA che ho purificato, separato mediante elettroforesi e...

trasferito su un filtro di nitrocellulosa, è presente un trascritto complementare alla sonda?" Quindi al posto di andare a guardare il DNA, sul gel caricheremo e osserveremo l'RNA.

Le altre domande a cui la Northern blot risponde sono:

• "caricando due campioni diversi, ad esempio uno sano e uno malato, quel gene in quale campione è più o meno espresso?"
• "dà informazioni sul peso molecolare del trascritto?", grazie alla risposta a questa domanda possiamo capire se sono avvenuti o meno eventi di splicing alternativo (esistono quindi più trascritti differenti in quanto la sonda si appaia a più trascritti).

PROCEDURA:

1. Estrazione RNA totale dalla cellula (95% di rRNA, tRNA e piccoli RNA e 5% di mRNA)
2. (facoltativo sia farlo che saperlo) purifico l'RNA poliA, ossia mantengo solamente l'mRNA perché è quello che rende possibile osservare la presenza di un trascritto raro che se fosse studiato

Non può essere visibile in quanto l'mRNA costituisce solo il 5% di tutto l'RNA cellulare. Per ovviare si carica sul gel solo l'mRNA eucariotico che è poliadenilato, presenta cioè al 3' una coda lunga di AAAAA che è complementare a una sequenza di TTTTT. Ci sono delle "colonnine" come se facessi una cromatografia in cui sono attaccate delle biglie molto piccole di lunghe code di T che si appaiano unicamente con gli mRNA poliA che sono la maggioranza (fa eccezione ad esempio l'mRNA degli istoni). A questo punto, aumentando la temperatura della soluzione, i poliA si staccano e quindi si ha una soluzione più diluita. Con questa procedura si aumenta la probabilità di vedere un segnale.

3. Preparo un gel di agarosio denaturante, in grado quindi di mantenere l'RNA lineare per far sì che migri unicamente per peso molecolare senza che sia influenzato dalla presenza di sezioni a doppio filamento.

4.

Aggiungo l'mRNA e lo faccio correre.

Trasferisco tutto su un filtro di nitrocellulosa o di nylon senza dover denaturare nuovamente l'RNA in quanto già denaturato grazie al passaggio nel gel denaturante.

Il filtro è una replica del gel con i trascritti esposti sulla superficie in modo tale da ibridare più facilmente con la sonda.

Preibrido la membrana (con RNA o sperma di salmone) e poi la ibrido con una sonda a DNA radioattiva.

Lavo tutto ciò che si è legato in maniera aspecifica.

Faccio l'autoradiografia.

Quando estraiamo l'RNA totale da tutta la cellula, la maggior parte degli RNA sono maturi quindi sono andati già incontro a splicing nel nucleo, se vediamo un'unica banda vuol dire che sono rimasti tali, se invece vediamo più bande significa che gli RNA maturi dopo splicing nel nucleo sono andati incontro a splicing alternativo a livello citoplasmatico.

Se da uno stesso campione ricavo più

trascritti per sapere la quantità totale li sommo.

ESEMPIO DI NORTHERN BLOT

Domanda dell'esperimento: "andare a vedere se in diversi tessuti umani ci sia una diversa espressione di un determinato gene (sono due nell'esempio ma per semplificare ne teniamo in considerazione uno solo)".

Attraverso una sonda complementare al trascritto del gene, in questo caso PSAT, si osserva se c'è ibridazione. Una volta osservati i risultati si fanno delle deduzioni: tanto più la banda è marcata tanto più è presente il gene. In realtà non possiamo essere certi sulle quantità di geni espressi perché potrebbero esserci artefatti, per esempio nei diversi campioni potrebbero esserci quantità diverse di RNA che quindi alterano i risultati.

Ad esempio il testicolo rispetto alla prostata ha un segnale 3-4 volte maggiore, questo implicherebbe che il testicolo replica 3 o 4 volte di più rispetto alla prostata.

però non è un dato sicuro perché bisogna tenere conto di qualcosa di tecnico che potrebbe aver influenzato il risultato e cioè la possibilità che ci siano quantità diverse di RNA.

Per il DNA non ci siamo posti la stessa domanda perché:

1. Il DNA è molto stabile e quindi la possibilità che si degradi è molto bassa.
2. Ci siamo chiesti se esistesse o meno un pezzo di DNA complementare alla sonda e non quanto fosse rappresentato un gene perché non esiste questa domanda parlando di DNA, di cui ne esistono solo due copie: una nell'allele paterno e una in quello materno.

Quindi per arrivare a una conclusione devo sapere se tutti i campioni hanno l'RNA integro usando l'elettroforesi e successivamente lo spettrofotometro con l'etidiobromuro (è integro se vedo le bande di 18s e di 28s e se quella di 28s è circa il doppio di quella di 18s), dalla quantità di fluorescenza si ottiene...

unastima del fatto se è stato fatto un errore e quanto RNA ho caricato per ciascuno campione (conoscere diquanto è diverso il caricamento). In alternativa si può usare la β-actina (gene che codifica per una proteina del citoscheletro) che viene definita come un gene housekeeping, ossia fa parte di quei geni che, in maniera similare, sono espressi in ogni cellula. Infatti, tutte le nostre cellule svolgono delle funzioni di base che le accomunano e i geni che esprimono queste azioni sono definiti housekeeping. La percentuale di β-actina è circa sempre uguale in tutte le cellule, quindi pongo un pannello di β-actina vicino a quella dell'altro gene che voglio studiare e in base alle quantità rilevate di β-actina deduco le quantità di RNA. Dopo aver ibridato per il gene PSAT (in questo caso) ibrido anche per la β-actina ottenendo dei segnali che riferiscono quanto RNA ho caricato perché parto dal presupposto che la

βactina è un gene housekeeping, ugualmente rappresentato in tutte le cellule. Se questo è vero, in quale tessuto ho caricato più RNA? Nel "terzultimo", quello che rappresenta i muscoli scheletrici. Il segnale della β-actina in questo caso è intenso eppure il gene del PSAT non ha segnale, quindi non è espresso. Questo mi fa da controllo interno: all'interno dello stesso campione, all'interno dello stesso pozzetto, all'interno dello stesso gel, vedo una perfetta ibridazione della β-actina, quindi l'RNA non può essere degradato perché se no la β-actina non avrebbe dovuto appaiarsi ed ibridarsi così bene, ma non ho segnali nel PSAT. Il campione con tessuto meno carico di RNA è invece il fegato. A questo punto, se il fegato è caricato poco e lo comparo con il cervello che è carico circa 10 volte di più di RNA, noto che il segnale di PSAT del cervello è

circa due volte più intenso. Avendo fatto il segnale con la β-actina, so che in realtà è il fegato che presenta maggiore PSAT proprio perché le due quantità di RNA sono diverse. Il calcolo che si può fare per stabilire i rapporti tra le concentrazioni di RNA viene definito quantificazione dei risultati di northern: tra un controllo sano e il campione malato, il mio gene di interesse (target gene) quanto è espresso? Vado a fare l'ibridazione con il gene di interesse e con uno standard interno che è un gene housekeeping (β-actina, GAPDH, RPLP0, ...) poi, attraverso una macchina, calcolo la differenza del segnale, in particolare esso è: - 10 volte più intenso per quanto riguarda il target gene; - 2 volte più intenso per il gene housekeeping. Nel campione malato, il gene di interesse ha un segnale 10 volte più alto a fronte di aver caricato una doppia dose di RNA e quindi effettivamente è

comodità so già che il trascritto ha un determinato peso molecolare e quindi una determinata posizione