Biologia molecolare compito obbligatorio

PREPARAZIONE DI SONDE:

marcatura di acidi nucleici

→marcatura al 5' terminale usando la polinucleotide chinasi = il filamento viene prima trattato con

fosfatasi che rimuove al 5' il P, che spesso si trova sui DNA trattati con enzimi di restrizione, e

aggiunge OH, poi la polinucleotide aggiunge il P radioattivo.

→fill in = si sfrutta in questo caso il fatto che alcuni enzimi di restrizione lasciano al 3' filamenti

sporgenti a singola elica. La DNA-polimerasi I ed in particolare il frammento di Klenow permette

di aggiungere il filamento mancante riempiendo l'estremità. Se questo viene fatto in presenza del

deossiribonucleotide marcato con P32 nel fosfato alfa le estremità verranno rese radioattive.

→marcatura al 3' terminale usando la terminal trasnferasi

→nick translation = il DNA da marcare viene trattato con una miscela molto diluita di endonucleasi

che introduce una serie di tagli ad elica singola in modo casuale nella molecola. Nella miscela si ha

anche la DNA-polimerasi I che legandosi in corrispondenza dei tagli esercita la nick trasltion grazie

all'attività esonucleasica 5'→ 3', degraderà una parte della catena che poi sarà resintetizzata a partire

dal primo 3'OH disponibile dall'attività polimerasica. Se il tutto viene fatto con nucleotidi

radioattivi si avrà un filamento marcato.

→random priming= si basa sulla ibridizzazione casuale di una miscela di tutti i possibili

esanucleotidi alla singola elica di un frammento di DNA sonda. Il filamento complementare viene

sintetizzato dalla 3'OH degli esanucleotidi che riescono a legarsi grazie alla attività polimerasica

della polimerasi.

Metodi non radioattivi

→nucleotidi coniugati a fluorosceine

→nucleotidi biotinilati = hanno un residuo di biotina legato a un UTP in posizione 5'. La biotina

può essere riconosciuta successivamente dalla streptavidina o da anticorpi anti-avidina coniugati ad

enzimi e rivelati per chemioluminescenza o enzimaticamente.

→nucleotidi coniugati alla digeossigenina

CENTRIFUGAZIONE

esistono vari tipi di centrifugazione e varie metodologie per la purificazione ed il frazionamento di

diversi componenti cellulari e molecolari e per l'analisi delle loro proprietà e caratteristiche.

Innanzitutto bisogna dividere tra centrifugazione differenziale e in gradiente di densità. La prima è

si basa sulla diversa velocità di sedimentazione di particelle tra loro diverse per densità e

dimensioni; la centrifugazione porterà inizialmente alla sedimentazione delle particelle di maggiori

dimensioni. Se le particelle hanno la stessa massa ma densità diversa, quelle con densità maggiore

sedimenteranno più rapidamente di quelle meno dense. Si pone il campione in una provetta e lo si

sottopone a diverse centrifughe aumentando la velocità nel tempo e raccogliendo di volta in volta il

surnatante in modo da poterlo centrifugare ancora e ogni pellet viene preso e messo da parte. Tale

tecnica si usa ad esempio nel frazionamento subcellulare: si parte da un omogenato di cellule di un

determinato tessuto o organo e lo scopo è quello di poter effettuare lo studio della morfologia,

composizione e attività dei componenti, la separazione di sostanze con caratteristica localizzazione

subcellulare (DNA, Enzimi, CoEnzimi ecc) e l’integrazione delle attività di componenti subcellulari

isolati.

La centrifugazione in gradiente di densità riduce al minimo le perturbazioni dovute ai moti

convettivi, evitando il rimescolamento e permette la separazione di particelle con dimensioni simili

e con diversa densità. Si divide in:

→ centrifugazione in gradiente di saccarosio = tale tecnica permette di separare macromolecole e

complessi macromolecolari in base alla loro velocità di sedimentazione. Il coefficiente di

sedimentazione è lo Svedberg ed esso dipende dalla massa della macromolecola, dalla sua struttura

e densità. Il campione da analizzare viene posto in una provetta dove è presente un gradiente di

saccarosio preformato e in seguito viene centrifugato. La centrifugazione viene interrotta quando

molecole e complessi hanno migrato all'interno del gradiente che viene analizzato e/o raccolto in

frazioni. Il ruolo principale del gradiente di saccarosio è quello di stabilizzare la colonna di liquido

in cui si fanno sedimentare le molecole, permettere la stratificazione sopra la colonna e

miniminizzare i movimenti convettivi e la diffusione durante la centrifugazione.

La velocità di centrifugazione dipende dal tipo di campione ma si parla di velocità tra 20 000 e 40

000 rpm e è necessario un rotore particolare che inizialmente verticale durante la rotazione si viene

a trovare in posizione orizzontale. Al termine si buca la provetta e si fa colare il gradiente e si

dispone in varie provette secondo il gradiente con cui è sedimentato.

→ centrifugazione in gradiente di Cloruro di cesio = con tale tecnica si analizzano e frazionano le

macromolecole e complessi macromolecolari sulla base della loro densità. Tale tipo di

centrifugazione viene detta isopicnica in quanto il campione non sedimenta dall'alto al basso della

provetta ma forma una banda nel punto in cui il gradiente ha la sua stessa densità ed è per questo

che si chiama densità di galleggiamento. Tale centrifugazione discrimina i DNA e RNA sulla base

del peso specifico indipendentemente dal loro peso molecolare. Anche il campione viene caricato in

modo diverso: si inizia infatti da una provetta contenente DNA e CsCl e di quest'ultimo in

3

particolare viene introdotta una concentrazione che sia simile alla densità del DNA (1,701 g/cm ). Il

Cs è pesante e tende a sedimentare in seguito alla forte g a cui è sottoposto nella centrifugazione e si

viene a creare un equilibrio tra la tendenza a sedimentare e la diffusione. Si ha così la formazione di

+

un gradiente di Cs dalla cima al fondo della provetta. A metà della provetta avrà più o meno la

densità del DNA, in cima una densità minore ed in fondo maggiore e grazie a dove si dispone il

DNA del campione se ne può evincere la densità e quindi la composizione in basi. Questa è la

tecnica che è stata utilizzata da Meselson e Stahl nel loro esperimento per capire con quale metodo

il DNA si replica. La densità di DNA inoltre può ulteriormente essere aumentata dall'aggiunta di

bromuro di etidio alla soluzione: esso si intercala nella doppia elica, srotolandola un po' e quindi

rendendola meno densa. Dato che in un DNA circolare covalentemente chiuso si può intercalare

meno bromuro che in un DNA lineare questo sarà più leggero del primo.

TECNOLOGIE DI BASE PER L'ISOLAMENTO E LA MANIPOLAZIONE DEI GENI

→clonaggio di un segmento di DNA = un gene o un segmento di esso viene introdotto all'interno di

una cellula in modo che venga copiato quando la cellula si replica. Un esperimento di clonaggio è

diviso in due parti: una parte in vitro in cui si producono frammenti di DNA da inserire in un

opportuno elemento genetico (vettore) ed una parte in vivo dove la molecola di DNA ricombinante

viene inserito nell'organismo.

FRAMMENTAZIONE DEL DNA

→meccanica o sonificazione= il DNA purificato viene fatto passare attraverso un filtro e i

frammenti del filamento vengono recuperati al di là di esso.

COSTRUZIONE DEL DNA RICOMBINANTE

→ enzimi di restrizione = sono enzimi che riescono a rompere il legame fosfodiesterico e sono

altamente specifici. Sono endonucleasi che tagliano il DNA all'interno e riescono a riconoscere le

sequenza sul DNA interagendo con gli atomi esposti della doppia elica. In particolare capiscono se

l'atomo è un atomo di H, un gruppo metilico o un donatore/accettore di elettroni ed in questo modo

capiscono con quale base stanno interagendo. Spesso sono dimerici, lavorano cioè come coppie e

tagliano quasi contemporaneamente sui due filamenti di DNA. In particolare riconoscono la

sequenza e stabiliscono contatti con più basi, l'idrolisi poi avviene in due tappe prima viene tagliato

uno e poi l'altro filamento. Le basi che si trovano vicine alla sequenza, chiamata contesto,

influenzano la velocità e la scelta del primo filamento da tagliare. Sono stati scoperti in seguito a

esperimenti su di un certo batteriofago che determinava la lisi delle cellule batteriche che infettava

con percentuali diverse da un ceppo all'altro. In particolare la capacità di un ceppo batterico di

prevenire la replicazione del batteriofago era stata chiamata restrizione dell'ospite e che questa non

era assoluta. Venne osservato che il genoma del batteriofago era stato segmentato in molti pezzi e ne

era stata quindi impedita la replicazione, proprio grazie a questi enzimi. Il DNA del batterio non

subiva tale processo perché era metilato e lo stesso accadeva nel caso di virus che fossero in grado

di portare a termine l'infezione.

Esistono enzimi di restrizione di tipo I e II e questi ultimi sono i più usati in laboratorio. Quelli di

tipo I riconoscono specifiche sequenze e tagliano in siti non specifici mentre quelli di classe II

riconoscono anch'essi specifiche sequenze, siti di taglio, ma tagliano all'interno di esse in punti

specifici. Quelli della classe II sono metalloproteasi ed agiscono solitamente con due o tre ioni in

2+

genere di Mg . Inoltre gli enzimi di restrizione possono essere divisi in isoschizomeri, ovvero

quelli che hanno la stessa sequenza di riconoscimento, e isocaudameri, ovvero quelli che

riconoscono sequenze bersaglio diverse ma tagliano producendo sequenze idetiche. Un esempio di

questi ultimi sono BamHI e Sau3A, il cui contesto è GATC. Essi generano estremità compatibili. La

maggior parte degli enzimi di restrizione riconosce le sequenze palindromiche sul DNA. Inoltre

possono tagliare in modo da ottenere estremità piatte se tagliano su entrambi i filamenti nello stesso

punto, oppure appiccicose se operano un taglio obliquo.

→mappe di restrizione = si ottengono dalla combinazione delle lunghezze dei frammenti generati

per digestione totale o parziale di una molecola di DNA con uno o più enzimi di restrizione.

L’elettroforesi su gel di agarosio dei frammenti ottenuti consente di contarne il numero, valutarne la

lunghezza e determinare le posizioni relative dei siti sulla base delle loro distanze. Talvolta è però

necessario ricorrere ad una digestione parziale, per ottenere frammenti non completamente digeriti

per discriminare tra mappe alternative, egualmente possibili.

→ Unità = 1 U di enzima taglia 1 microgrammo di DNA in 1 ora a 37 °C.

→trasformazione = è un processo mediante il quale del DNA esogeno penetra all'interno di una

cellula batterica. Le cellule di E.coli non son