Biologia molecolare compito obbligatorio

Biologia molecolare

La biologia molecolare è lo studio delle molecole biologiche ed in particolare della loro struttura, delle loro proprietà e funzioni. Lo studio di tutti i geni prende il nome di genomica, lo studio di tutti gli RNA prende il nome di trascrittomica ed infine lo studio di tutte le proteine prende il nome di proteomica.

Il genoma è tutto il DNA di una cellula e quindi comprende sia geni che regioni intergeniche. Il DNA è il portatore dell'informazione genetica e il gene è una porzione di DNA che codifica per qualcosa.

Vocabolario

Genomica = tutti i geni insieme
Trascrittomica = tutti gli RNA
Proteomica = tutte le proteine
Genoma = tutto il DNA di una cellula, comprende geni e regioni intergeniche
Exon = parte di genoma che codifica per le proteine
Epigenoma = insieme di modifiche ereditabili del materiale genetico che avvengono senza modifiche al DNA.
Gene = una porzione di DNA che codifica per qualcosa

DNA→ RNA→ proteine

DNA→ tRNA

DNA→ rRNA

Storia

• Il gruppo del fago: gruppo di ricercatori di varia origine che scelsero di utilizzare i batteriofagi per studiare il problema della struttura e della funzione dei geni.
• Esperimento di trasformazione batterica operato da Griffith nel 1929 con Streptococcus pneumoniae: utilizzava due ceppi di tale batterio: il ceppo R (rought) e il ceppo S (smooth). Il ceppo R privo di capsula batterica non provoca polmonite nei topi in cui viene iniettato poiché il loro sistema immunitario li difende. Il ceppo S, invece, presenta una capsula polisaccaridica che lo difende dal sistema immunitario e induce la morte, in seguito al manifestarsi della polmonite, nell'animale. Se il ceppo S veniva riscaldato e reso inattivo e inoculato nei topi non mostrava più il suo effetto patogeno. Griffith però notò che se il ceppo S inattivato veniva mescolato con il ceppo R attivo, le cavie morivano e dai loro tessuti si ricavavano batteri del ceppo S attivi. In realtà erano batteri del ceppo R che avevano acquisito la capacità di presentare la capsula e Griffith ipotizzò che tra i due ceppi c'era stato il passaggio di un qualcosa dal ceppo S al ceppo R, che gli conferiva tale capacità. Griffith chiamò tale sostanza "principio trasformante".
• Esperimento di O. Avery con il quale venne identificato il DNA come il responsabile o meglio come l'agente trasformante della trasformazione batterica: ripresero l'esperimento di Griffith e cercarono di capire cosa era il principio trasformante di cui si parlava. Innanzitutto essi introdussero una semplificazione che riguardava l'identificazione dei ceppi patogeni: non iniettavano i batteri per verificare se erano patogeni o meno ma si limitarono ad osservarne la superficie in piastra se appariva ruvida o liscia. Inoltre essi fecero degli estratti dei batteri patogeni e li misero in diverse provette ed in ognuna introdussero un diverso reagente specifico per ognuno dei componenti cellulari: tripsina per le proteine, RNasi per l'RNA, DNasi per il DNA ecc. A tutte le provette poi vennero aggiunti i batteri del ceppo non patogeno in modo da far avvenire la trasformazione. Laddove la trasformazione non sarebbe avvenuta si doveva cercare il principio trasformante che era stato inattivato dal suo specifico reagente. Il DNA risultò essere tale sostanza.
• Esperimento di Hersey e Chase che definì finalmente il DNA come portatore dell'informazione: essi presero in esame i batteriofagi ovvero i virus che infettano i batteri e marcarono radioattivamente il DNA di alcuni fagi con il ³²P e le proteine del capside degli stessi con il ³⁵S. Posero questi fagi insieme a una cultura di batteri ad essi suscettibili e li fecero infettare. In seguito il brodo di cultura in cui erano contenuti i batteri venne frullato in un normale frullatore in modo da provocare il distacco del capside ormai vuoto dal batterio. In seguito il preparato venne centrifugato in modo da separare le due componenti: batteri più pesanti nel pellet e capsidi vuoti nel surnatante. A questo punto si osservò con l'apposito strumento che la quasi totalità della radioattività dello zolfo era ancora presente nei capsidi mentre quella del fosforo era adesso presente nei batteri.
• Esperimento di Meselson e Stahl per capire il metodo replicativo del DNA: essi decisero di utilizzare Escherichia coli come modello sperimentale dato che può crescere facilmente in laboratorio in condizioni di coltura sperimentalmente controllate. Essi fecero crescere molte generazioni di questo batterio in un terreno contenente sali dell'azoto, come NH₄Cl, con azoto pesante, affinché tutte le cellule avessero molecole di DNA contenenti ¹⁵N. A questo punto le cellule sono state raccolte tramite centrifugazione e lavate in modo da togliere ogni traccia del terreno di coltura. Successivamente sono state poste in un nuovo terreno di coltura, contenente ¹⁴N, dove sono rimaste per due generazioni. L'ipotesi dei due scienziati era che se veramente il DNA si replicava in maniera semiconservativa, dopo una generazione tutte le cellule che avevano replicato il loro DNA dovevano avere un filamento marcato con ¹⁵N e uno marcato con ¹⁴N. Tutte le molecole avrebbero dovuto avere quindi una densità intermedia rispetto a quella di un doppio filamento tutto ¹⁵N o ¹⁴N. In ogni caso non si doveva avere sin dalla prima generazione un DNA tutto pesante. Contrariamente se fosse stata vera l'ipotesi conservativa il DNA sarebbe dovuto essere per metà pesante e per metà leggero, ma non si sarebbe mai dovuta avere DNA con densità intermedia.
• Esperimento di Chargaff: organismi di diverse specie possono avere DNA con composizione di basi differente, mentre il DNA estratto da stessi organi o tessuti di organismi della stessa specie hanno sempre la stessa composizione in basi. Inoltre osservò che qualsiasi fosse la fonte del DNA e nonostante la diversa composizione in basi veniva sempre rispettata una regola: la % di A è sempre uguale a quella di T e la % di C è sempre uguale a quella di G.

Metodi fisici per introdurre il DNA nelle cellule

La trasfezione è il trasferimento di DNA esogeno in cellule eucariotiche. Si usa questo termine in quanto la parola trasformazione è usata in campo oncologico.

• Microiniezione: con una pipetta sottile si introduce il DNA nel nucleo.
• Microproiettili: la cellula viene bombardata con particelle di tungsteno o oro rivestite di DNA.

La biologia molecolare nasce nel 1953

Gli acidi nucleici, DNA e RNA, sono costituiti da catene polinucleotidiche. Un nucleotide è formato da un gruppo fosfato, uno zucchero a 5 atomi di carbonio e un anello contenente azoto, ovvero una base azotata. Le basi azotate sono divise in purine, formate da due anelli eterociclici, e in pirimidine formate da un singolo anello eterociclico. Le purine comprendono adenina e guanina, mentre le pirimidine comprendono citosina, uracile e timina. La differenza tra timina, presente nel DNA, e uracile, presente nel RNA, è la presenza in quest'ultima di un gruppo metilico in posizione C₅ nell'anello pirimidinico. Il legame che c'è tra lo zucchero e la base azotata è un legame β-N-glicosidico. Lo zucchero nel DNA è rappresentato dal deossiribosio mentre nel RNA è rappresentato dal ribosio e questi due differiscono tra di loro per la posizione di un gruppo OH sul C₂ che è presente nel ribosio e assente nel deossiribosio. Tale differenza è molto importante in quanto conferisce instabilità alla molecola di RNA e questo determina poi la struttura complessiva della catena che può essere assunta. Infine il gruppo fosfato che si lega ai nucleosidi è importante in quanto conferisce alla molecola una valenza acida ed esso può trovarsi legato o al carbonio 5' o al 3' dello zucchero.

Nucleosidi e nucleotidi

Un nucleoside è dato da una base azotata e dallo zucchero a 5 atomi di carbonio.

• Adenosina: acido adenilico
• Guanosina: acido guanilico
• Citidina: acido citidilico
• Timidina: acido timidilico
• Uridina: acido uridilico

Nella catena, ciascuna base è legata alla posizione 1' dello zucchero grazie a un legame β-N-glicosidico che interessa o l'N1 delle pirimidine o l'N9 delle purine. Poi ogni zucchero forma un legame estere con un gruppo fosfato legato in posizione 5' e uno con un gruppo fosfato legato in posizione 3'. Tale legame è chiamato fosfodiesterico. Per convenzione le sequenze degli acidi nucleici si scrivono in direzione 5'→3', ovvero dall'estremità libera a sinistra all'estremità libera a destra. Il dogma centrale della biologia molecolare è DNA (replicazione)→ mRNA (trascrizione) → proteine (traduzione).

La doppia elica

Le proprietà che il materiale genetico doveva avere erano due: la capacità di trasmettere informazioni e la capacità di replicarsi.

• Diffrattometro a raggi X: è presente una sorgente di raggi X che emette un fascio primario di raggi X. Questi passano attraverso un sistema di specchi che concentrano e focalizzano il fascio. Il fascio viene poi mirato verso un circolo Chi nel quale si trova un cristallo in grado di dividere il fascio. Questi singoli raggi poi vanno ad incontrare un apposito rilevatore. Le molecole che possono essere osservate con questo strumento devono essere sotto forma di cristalli e ciò non è possibile per il DNA. Quest'ultimo però può essere ridotto in fibre in cui le lunghe molecole di DNA sono orientate più o meno le una parallelamente alle altre.
• La struttura a doppia elica che trovarono Watson e Crick prevede che le basi siano legate tra di loro al centro dell'elica, in modo planare, e che in particolare A si leghi a T con due legami a H mentre G si leghi a C con 3 legami a H. Questi legami, anche se sono deboli, tutti insieme contribuiscono notevolmente alla stabilità della struttura. La sequenza completa può essere facilmente trovata poiché se si conosce un filamento si conosce anche l'altro dato che sono complementari. L'elica individua due solchi diversi poiché gli zuccheri si legano leggermente inclinati alle basi e perché presenta asimmetria originata dal fatto che data la direzione opposta dei due filamenti i due atomi di zucchero si vengono a trovare dallo stesso lato. I due solchi sono uno minore ed uno maggiore, il quale è importante in quanto in esso si legano spesso le proteine che legano il DNA. L'ampiezza del solco maggiore è di 22 angstrom mentre il minore misura 12 angstrom.
• La doppia elica di questo modello in particolare si chiama doppia elica di tipo B: ha una struttura regolare, è destrorsa, compie un giro completo ogni 34 angstrom che sono 10,5 paia di basi e ha un diametro di 19/20 angstrom. L'elica presenta un'asimmetria dovuta alla posizione degli zuccheri che si vengono a trovare dallo stesso lato a causa della disposizione antiparallela dei due filamenti. Viene purificato non come cristallo ma come fibre legate a proteine.

Strutture alternative del DNA

Nella struttura dell'elica si vengono ad individuare vari parametri che descrivono come le basi sono disposte:

• Twist: è l'angolo tra le due coppie di nucleotidi rispetto all'asse della doppia elica.
• Roll: è l'inclinazione, dovuta alle forze di repulsione tra le due coppie di nucleotidi rispetto all'asse della coppia AT o CG.
• Tilt: è l'angolo che si forma per repulsione rispetto all'asse dello scheletro zucchero-fosfato.

Altre forme dell'elica:

• Doppia elica di tipo A: la ritroviamo nel RNA a singolo filamento in quelle zone dove si formano dei ripiegamenti chiamati a forcina. L'OH presente in posizione 2 infatti gli conferisce una minore stabilità, le basi sono qui leggermente inclinate e il solco maggiore diviene più profondo e meno accessibile.
• Doppia elica di tipo Z o a zig-zag: non si sa bene a cosa serva tale struttura, si ritrova ad esempio nel DNA a tripla elica in cui il terzo filamento è formato da sole pirimidine.

Il meccanismo con cui il DNA si replica è di tipo semiconservativo e ciò fu dimostrato da Meselson e Stahl nel 1958. La doppia elica di tipo B non è l'unica esistente, infatti questa è la forma che la molecola di DNA assume in condizioni di alta umidità e quindi corrisponde alla forma in vivo. Tra le altre forme che può assumere troviamo la forma A e la forma Z. La prima, che viene assunta dal DNA in condizioni di più bassa umidità, è destrorsa, le basi hanno un'angolatura maggiore rispetto al piano perpendicolare all'asse della doppia elica, ci sono 11 coppie di basi per ogni giro dell'elica e sostanzialmente l'elica appare più tarchiata rispetto alla forma B con il suo diametro di 23 angstrom e il passo di 25. Tale forma può essere assunta in vivo da due filamenti di RNA o da un filamento di DNA appaiato ad uno di RNA. Questo perché la posizione dell'OH in 2' del ribosio non permette la formazione dell'elica di tipo B. La struttura Z invece è sinistrorsa, ha un diametro di 18 angstrom, un passo di 46 e quindi ha una forma un po' più allungata rispetto alla B. Tale forma è tipica di DNA sintetici che sono ricchi in C e G e si trova raramente anche in vivo. La sua formazione è dovuta alla rara presenza di basi che invece di assumere la forma "anti" si trovano in forma "syn" e ciò provoca un cambiamento di orientamento del legame glicosidico.

Oltre a queste forme ne esiste un'altra che è formata da 3 filamenti: in particolare un filamento deve essere formato da sole pirimidine, l'altro da sole purine e il terzo composto da sole pirimidine può essere accolto nel solco maggiore di tale struttura. I legami a H che si vengono a formare tra le due pirimidine e la purina sono legami che prendono il nome di appaiamenti di Hoogsteen. In natura non è ancora stato identificato ma si pensa possa essere usato per bloccare la funzione di geni specifici.

Un'altra interessante struttura si può formare tra 4 tratti di DNA o RNA a singolo filamento che contengono 3 o più G consecutive. In questo modo i 4 tratti di DNA si affiancano a formare una struttura a quartetto in cui le G sono legate da legami a H che anche in questo caso sono appaiamenti di Hoogsteen. Questa struttura in natura si trova nel RNA ma anche nel DNA e infatti è stato suggerito che tale forma si trovi nei telomeri.

Nel DNA si possono trovare, adiacenti o a brevi distanze, due copie della stessa sequenza ma con orientamento opposto e tali sequenze vengono chiamate sequenze invertite. Se sono adiacenti costituiscono una sequenza palindromica che ha particolari proprietà strutturali e funzionali.

TGCGATATCGCAACGCTATAGCGT → sequenza palindromica

TGCGATACTCATCGCAACGCTATGAGTAGCGT → sequenza ripetuta e invertita separata da 4 bp

La struttura dovuta alla presenza di una sequenza ripetuta e invertita può essere quella cruciforme in cui ciascun filamento di una delle due sequenze ripetute trova una regione a cui appaiarsi adiacente nello stesso filamento. Le basi che non possono appaiarsi formano le anse di tali strutture. Nel caso del RNA a singolo filamento che presenta le medesime caratteristiche si ha la struttura a forcina dato che è formato da un unico filamento.

Laboratorio

Tecniche spettrofotometriche per l'analisi della denaturazione e riassociazione del DNA

• Spettro di assorbimento: i legami della doppia elica sono legami deboli, in particolare legami a H e interazioni idrofobiche tra le basi, che possono facilmente essere spezzati con alte temperature, alto pH e alcuni agenti chimici come l'urea. Tale processo si chiama denaturazione del DNA ed è un processo reversibile. Il DNA poi, come anche l'RNA, non assorbe radiazioni nell'intervallo di lunghezza d'onda del visibile ma assorbe la luce ultravioletta con un picco caratteristico a 260 nm. Con lo spettrofotometro si può misurare l'assorbanza e questa ci permette di capire la concentrazione di DNA in soluzione. È stato determinato infatti che per una misura di Assorbanza=1 si hanno in soluzione circa 50 μg/mL di DNA nativo a doppio filamento. L'assorbanza inoltre aumenta di circa il 40% quando il DNA viene denaturato, dato che sono le basi ad assorbire la radiazione e se la doppia elica si apre esse sono più esposte e possono assorbire più radiazione. Tale effetto si chiama ipercromico. Queste informazioni ci permettono di conoscere la concentrazione di DNA una volta conosciuta la sua assorbanza.

Si definisce temperatura di fusione, Tm, la temperatura a cui è avvenuta metà transizione ipercromica e quindi metà denaturazione del DNA. Tale temperatura dipende da molti fattori come ad esempio la forza ionica ed il pH e per questo la misura della Tm in laboratorio viene fatta in condizioni standardizzate: NaCl 0,15 M; Na citrato 0,015 M e pH 7,0. È stato così possibile capire che DNA ricchi in C-G hanno una Tm più alta rispetto a DNA ricchi in A-T. In particolare fino a poco tempo fa, grazie alla scoperta che c'è una relazione lineare tra Tm e presenza di C-G, si usava tale metodo per determinare la composizione in basi del DNA.

Una volta denaturato il DNA tende a riformare la doppia elica tramite il processo di riassociazione o annealing. Lo stesso può accadere tra un filamento di DNA e uno di RNA se ci sono sequenze nucleotidiche complementari ed in questo caso si parla di ibridazione. Anche nel caso in cui due filamenti di DNA, che inizialmente non erano uniti, si parla di ibridazione ed è proprio ciò che accade quando si usano delle sonde.

Sonda = molecola di DNA marcata con sequenza complementare a quella che stiamo cercando.

Sintesi di DNA in vitro = è sempre necessario il filamento stampo.