Biologia molecolare compito obbligatorio

Le caratteristiche che un vettore deve avere sono:

contenere una origine di replicazione che gli permetta di replicarsi autonomamente una volta

• inserito nella cellula ospite. Alcuni privi di origine di replicazione possono essere utilizzati

nel caso in cui si voglia introdurre DNA esogeno all'interno di quello cellulare;

avere uno o più marcatori di selezione che permettano di individuare le cellule che

• contengono il vettore e qualsiasi frammento di DNA in esso inserito;

contenere il maggior numero possibile di siti di restrizione unici ovvero presenti una sola

• volta nel DNA, in questo modo si possono inserire una varietà di frammenti di restrizione.

→vettori di espressione = sono vettori all'interno dei quali si introduce un frammento di DNA

contenente un gene codificante per una specifica proteina che si intende sintetizzare, che viene

chiamata proteina ricombinante.

→vettori di esposizione = si usano con i fagi filamentosi. La proteina di interesse viene esposta sul

capside del virus.

→ plasmide = è un cromosoma accessorio e quindi non indispensabile e che è dotato di replicazione

autonoma, geni per la resistenza agli antibiotici e siti unici di restrizione, ovvero siti riconoscibili

dagli enzimi di restrizione. Sono tra i vettori di clonaggio più utilizzati, sono costituiti da DNA

circolare a doppio filamento piuttosto piccolo (da 2 a 5 kpb) e molti di quelli presenti in natura

hanno già dei marcatori selettivi come ad esempio la resistenza ad alcuni antibiotici.

Sono stati sviluppati nel corso degli anni plasmidi sempre più sviluppati che utilizzano marcatori di

selezione alternativi. Questo è il caso di pUC19 che ha inserito al suo interno oltre al gene per la

resistenza all'Ampicillina anche un segmento di DNA chiamato MCS (multiple cloning site) che

contiene condensati i siti di restrizione conosciuti di 11 ER. Inoltre tale segmento si trova all'interno

del gene lacZ '5 di E.coli che codifica per l'enzima β-galattosidasi. Cellule che producono un

enzima attivo danno luogo a colonie di colore blu se cresciute in un terreno contenente un substrato

cromogeno di tale enzima, mentre nel caso non sia attivo danno colonie bianche. In realtà all'interno

di tale plasmide è presente solo la porzione 5' del gene mentre al porzione 3' si trova nel genoma di

E.coli. Normalmente tale proteina è inattiva ma se si viene a trovare insieme all'altra porzione si

ottiene una molecola completa, grazie ad un fenomeno detto α-complementazione, che è in grado di

metabolizzare il cromogeno che si chiama X-gal. Tutto ciò è molto utile in quanto se viene inserito

un frammento di DNA nella regione MCS, il gene Lac '5 viene inattivato e le colonie future saranno

facilmente distinguibili dalle altre poiché appariranno bianche. In conclusione le cellule

ricombinanti cresceranno su terreno con ampicillina e quelle con vettori non ricombinante daranno

luogo a colonie blu.

→batteriofago lambda = il genoma di lambda contiene numerosi siti riconosciuti dagli enzimi di

restrizione e pertanto il suo DNA wildtype non si presta ad essere utilizzato come vettore. Per tale

motivo il DNA originale è stato modificato e alcuni di tali siti sono stati tolti. I vettori di lambda

sono divisibili in due categorie: i vettori d'inserzione, che hanno un sito di restrizione unico in cui

inserire un frammento di DNA, e in vettori di sostituzione in cui la porzione di DNA di lambda che

codifica per il ciclo lisogenico è sostituita da DNA esogeno. I vantaggi che si ottengono utilizzando

il genoma di lambda sono molteplici: innanzitutto si può avere l'impacchettamento all'interno del

capside del DNA del fago sia selvatico che ricombinante, inoltre il sistema di impacchettamento si

basa sul meccanismo a testa piena per cui solo molecole delle dimensioni del genoma del virus e

che abbiano sequenze cos alle estremità possono entrare.

→cosmidi = sono dei plasmidi che oltre ai tipici marcatori selettivi e a regioni di clonaggio con siti

per ER, contengono un frammento del DNA di lambda con il sito cos. Usando tali siti cos possono

essere impacchettati all'interno di un capside virale e dopo l'infezione di cellule di Coli possono

essere selezionati e mantenuti in esse come dei normali plasmidi.

→fagemidi =sono vettori che posseggono l'origine di replicazione del fago filamentoso ma

mancano dei geni strutturali e richiedono coinfezione con un fago filamentoso helper per la

morfogenesi e la produzione di DNA a singolo filamento. Presentano diversi vantaggi, quali:

1. come i plasmidi danno garanzie di stabilità e di produzione di grande quantità di dna

2. eliminano il problema di riclonare il dna da sequenziare da plasmide a fago

3. date le loro piccole dimensione possono accogliere frammenti di dna sufficientemente

grandi (fino a 10 kb).

4. l'origine di replicazione è stata inserita nelle opposte direzione. Ciò consente la produzione

di dna a singolo filamento corrispondente all'uno e all'altro strand(per il sequenziamento).

→vettori per il clonaggio e l'espressione in cellule eucariotiche = le tecniche che possono essere

utilizzate sono molteplici e variano in base anche al tipo di cellula in questione ovvero eucariotiche

unicellulari come nel caso dei lieviti o pluricellulari animali o vegetali. L'introduzione di DNA

esogeno in cellule di lievito prende il nome di trasformazione ed è sostanzialmente simile a quello

che avviene nei batteri, ma la procedura è diversa poiché devono essere alterate sia la membrana

che la parete. Quando il DNA esogeno è invece inserito in cellule animali si parla di trasfezione in

quanto il termine trasformazione è utilizzato per le cellule tumorali. Se poi il DNA non si integra

all'interno del genoma cellulare si parla di trasfezione transiente ed esso verrà mantenuto per poche

divisioni cellulari. Nel caso in cui invece si integri nel genoma si parla di trasfezione stabile e la sua

integrazione avviene a caso secondo meccanismi di ricombinazione non omologa o illegittima.

I meccanismi con i quali si può introdurre DNA in cellule animali e vegetali sono molteplici:

introduzione diretta mediante meccanismi di endocitosi favoriti dalla precipitazione del

• DNA con sali di calcio.

Trasfezione mediata da vescicole lipidiche

• elettroporazione

• microiniezione diretta del DNA

• microsfere che assorbono il DNA e poi vengono sparate all'interno delle cellule.

•

→vettori di lievito = questi vettori differiscono per i marcatori utilizzati, per la presenza o assenza

di origini di replicazione e di altre sequenze come centromeri e telomeri che influenzano

profondamente la stabilità dei vettori, ed infine le dimensioni degli inserti. I marcatori utilizzati

sono marcatori metabolici come geni codificanti per enzimi richiesti per la sintesi di un particolare

aa o di una base azotata. I vettori di lievito si dividono in 4 categorie: Yip (yeast integrating

plasmid), YRp (yeast replicative plasmid), YEp (yeast episomal plasmid) ed infine YCp (yeast

centromeric plasmid). Tutti hanno un marcatore, ma YIp non ha un'origine di replicazione. Gli altri

che hanno tutti l'origine ne hanno una corrispondente a un'origine cromosomica o all'origine di un

episoma di lievito chiamato 2μ. Gli YIp si perdono dopo un certo numero di replicazioni dato che

non sono in grado di duplicarsi a meno che non si integrino da qualche parte. Ai vari tipi di vettore

di lievito vengono quasi sempre aggiunti marcatori che possono essere selezionati in cellule di Coli

e un'origine di replicazione che funziona nei batteri: prendono il nome di shuttle vector o vettori

navetta.

Esistono anche vettori chiamati YAC o Yeast Artificial Chromosome che permettono il clonaggio di

frammenti molto grandi fino a 500-1000 kpb.

→YAC=sono vettori che permettono il clonaggio di molecole molto grandi e si replicano nei lieviti.

Sono formati da: una sequenza corrispondente a un centromero di lievito, hanno sequenze

corrispondenti ai telomeri di lievito, un'origine di replicazione cromosomica, il gene SUP4 che

codifica per un tRNA soppressore, i geni TRP1 e URA3 ed infine geni per la selezione e

propagazione in cellule batteriche.

→BAC = sono vettori che permettono il clonaggio di molecole molto grandi, sono molto stabili.

Sono formati dai plasmidi F dei batteri. Sono superavvolti, stabili e facili da usare. Contengono le

sequenze per distinguere le colonie bianco/blu.

→vettori per il trasferimento genetico in cellule animali = la replicazione autonoma dei plasmidi

ovviamente non funziona in cellule di mammifero ma alcuni vettori sono in grado di replicarsi in

maniera plasmil-simile se contengono l'origine di replicazione di un virus. Uno svantaggio è dato

però dal fatto che l'integrazione nel genoma avviene in modo incontrollato e ciò può comportare

mutagenesi insersionale.

→vettori per il trasferimento di DNA nei vegetali = è possibile manipolare cellule singole per

cercare di creare piante intere con particolari proprietà. Inoltre il plasmide batterico Ti di

Agrobacterium tumefaciens può essere utilizzato per introdurre DNA esogeno nei vegetali. Dopo

l'infezione una parte del plasmide chiamata T-DNA si integra nel genoma della pianta in modo

apparentemente casuale ed esso contiene una serie di geni in grado di indurre tumore nella pianta.

Ovviamente questa è la parte che viene eliminata al posto della quale si introducono altri geni.

Inoltre vengono usati dei marcatori selettivi di cui il più usato è quello che offre resistenza alla

kanamicina.

Metodi alternativi prevedono la trasformazione di protoplasti o l'introduzione di DNA con tecniche

biolistiche tramite l'utilizzo di microsfere di oro o tungsteno. Infine anche virus dei vegetali possono

essere utilizzati per introdurre il DNA come ad esempio il virus del mosaico del cavolfiore che è

contenuto all'interno del capside con lo stesso meccanismo di lambda.

SELEZIONE

1. per inattivazione inserzionale ovvero quelle cellule che sono divenute ricombinanti hanno

introdotto il vettore in una sequenza interropendo un gene e quindi possono essere

selezionate verificando o meno l' espressione di tale gene. Ad esempio nel caso in cui il

vettore si inserisca nel plasmide al livello del gene che codifica per la resistenza alla

teraciclina: se piastrate su terreno con tetraciclina tali cellule moriranno.

2. Per colore delle colonie come nel caso della degradazione di X-gal. Su un plasmide pUC8 è

presente la porzione 5' del gene che codifica per la βgalattosidasi e se avviene la

ricombinazione l'inserto va ad inattivare questa porzione del gene. Plasmidi che hanno

l'inserto e che vengono a trovarsi dentro a delle cellule daranno colonie bianche in quanto

incapaci di idrolizzare X-gal mentre, quelle che presenteranno il plasmide senza l'inserto,

daranno luogo alla βgalattosidasi funzionale per αcomplementazione e quindi colonie blu.

3. Ibridazione con sonde

4. ibridazione su colonia o su placca

5. Chromosome walking = è un'analisi comparata di vari cloni che si sovrappongono

parzialmente. È un metodo sistematico che permette di muoversi lungo il cromosoma a

partire da un punto noto. Si parte da una sequenza nota che verrà usata come sonda. Viene

fatta ibridare con cloni della genoteca dell'organismo di interesse. Una volta identificato il

frammento che si è parzialmente legato ad essa, si identifica la sequenza di un tratto

adiacente e si usa questo come sonda nell'esperimento successivo ripetendo il procedimento

da capo.

BANCHE DI DNA

→le librerie o banche o genoteche sono collezioni di DNA clonati in uno specifico vettore di

clonaggio nella quale l'insieme di tutti i cloni rappresenta l'intero genoma dell'organismo da cui il

DNA è stato isolato. Per costruire una libreria genomica si deve decidere innanzitutto quale vettore

di clonaggio usare dato che vettori diversi hanno proprietà diverse. Poi si deve frammentare il DNA

genomico nelle dimensioni prescelte e per farlo ci sono diversi modi: si può frammentarlo

casualmente facendolo passare più volte attraverso l'ago di una siringa o trattandolo con ultrasuoni.

Più i frammenti saranno piccoli più la loro dimensione rappresenterà una distribuzione gaussiana la

cui media può venire determinata mediante elettroforesi su gel. È importante inoltre generare

frammenti parzialmente sovrapposti in modo da poterli allineare in modo contiguo l'uno all'altro e

per ottenere tale risultato spesso si usano enzimi di restrizione ma avendo anche l'accortezza di

ottenere una digestione parziale del DNA.

Un parametro importante per valutare una libreria è la sua rappresentatività ovvero la probabilità di

trovarvi un clone contenente un gene di interesse o meglio il numero minimo di cloni affinché tutto

il contenuto del genoma sia ben rappresentato. In una collezione di frammenti casuali più grande e

completa è la libreria maggiore è la sua rappresentatività.

→le librerie di cDNA (coding DNA) sono fatte a partire dagli mRNA estratti dalle cellule di

interesse e da essi poi si ottiene il DNA che codifica per tali RNA. Ne deriva che nelle librerie di

questo tipo mancheranno le sequenze che codificano per gli introni e analogamente mancheranno le

sequenze regolatrici come enhancer e promotori. Inoltre bisogna ricordare che tali librerie sono

diverse a seconda del tessuto dal quale deriva la cellula delle quale si è estratto l'mRNA.

La procedura di base che viene utilizzata per costruire le librerie di cDNA è la seguente:

1. purificazione degli mRNA dalle altre forme di RNA, che sono di solito più abbondanti,

presenti nelle cellule in esame. Negli eucarioti si sfrutta la presenza in posizione 3'OH

della coda poliA per identificarli;

2. si usa poi la trascrittasi inversa per copiare il filamento di mRNA in un filamento di DNA.

Per potersi legare però essa ha bisogno di un innesco in posizione 3'OH e quindi si usano

come inneschi delle molecole di oligo-dT che possono appaiarsi alla coda poliA;

3. il filamento ibrido così ottenuto viene degradato in ambiente alcalino o utilizzando le

RnasiH e i singoli filamenti di DNA tendono a formare strutture come le hairpin;

4. la DNA-polimerasi a questo punto si può legare all'estremità 3'OH e duplicare l'altro

filamento.

5. A questo punto la molecola presenta ad una estremità un'ansa, quella della forcina, che

deve essere risolta e per tale scopo si usa una nucleasi chiamata S1 che ha la proprietà di

tagliare il DNA a singolo filamento.

6. Le molecole di DNA così ottenute possono essere clonate attaccando con la DNAligasi

alle loro estremità corte molecole di DNA chiamate adattatori o giunti che sono formati da

sequenze comparabili a quelle riconosciute dagli enzimi di restrizione.

→screening dei cloni presenti nelle librerie:

funzionale mediante complementazione di uno specifico fenotipo = si costruisce una banca

• genomica del fenotipo selvatico in un vettore capace di replicarsi nell'organismo di

interesse. In seguito si prende l'organismo mutato e in esso si fa avvenire la trasformazione.

Si selezionano grazie al marcatore le cellule che hanno introdotto il ricombinante e da queste

poi si selezionano quelle che, per complementazione, hanno reso inefficace la mutazione

inizialmente presente. In questo modo si risale al gene presente nel vettore e si sa per cosa

codifica.

Con sonde di acidi nucleici = il DNA estratto da cellule di mammifero se lo si taglia con ER

• permette di ottenere frammenti di diverse dimensioni e così numerosi che non sono

osservabili come frammenti distinti dopo corsa elettroforetica. Allora i frammenti così

ottenuti, in seguito alla corsa vengono trasferiti mediante capillarità o attraverso l'azione di

un campo elettrico su di un filtro di nitrocellulosa o nylon in cui il DNA rimane intrappolato

e può essere denaturato in situ. In seguito il filtro può essere immerso in una soluzione

contenente molecole di DNA note marcate con isotopi radioattivi. Questi sono le sonde che

ci permetteranno di identificare i frammenti con la stessa sequenza. Ovviamente sia il DNA

che la sonda devono essere denaturati per far avvenire l'appaiamento. In seguito si effettuano

una serie di lavaggi per eliminare la sonda non ibridata e il filtro viene posto su di una lastra

a raggi X. Gli elettroni emessi dalla sonda impressionano la lastra e il filamento di DNA dà

così origine ad un segnale che corrisponde ad una banda scura.

Mediante l'utilizzo di anticorpi = si usano degli anticorpi che si legano a particolari proteine

• per identificare se queste sono state prodotte. In particolare si parla di ibridazione su placca

e l'individuazione dei fagi ricombinanti che producono la proteina di fusione è possibile

grazie agli anticorpi appunto. Filtri di nitrocellulosa vengono stesi sulle piastre e le proteine

presenti in corrispondenza delle placche di lisi rimangono ancorate ad essi. I filtri vengono

incubati con gli anticorpi che si legano alla proteina presente. Le proteine sono messe poi in

evidenza grazie ad un secondo anticorpo marcato a fluorescenza o radioattivo.

ESPERIMENTO ARBER

SISTEMA IMMUNITARIO MICROBICO

il DNA batterico è modificato, in particolare presenta delle basi metilate che gli permettono di non

venir degradato dalle endonucleasi di restrizione che usa per proteggersi dalle infezioni fagiche.

ENZIMI UTILI

-T4 polinucleotide chinasi=serve per marcare il filamento. Il fosfato in posizione gamma di un

nucleotide trifosfato viene aggiunto al frammento. In caso un gruppo fosfato fosse già presente

verrà prima rimosso attraverso una fosfatasi alcalina.

-Taq polimerasi = deriva da un batterio estremofilo che vive in sorgenti termali con temperature

altissime. Gli enzimi di questi ultimi non si degradano con le alte temperature. Grazie alla loro

scoperta Mullis riuscì a rendere efficiente la PCR. Tale tecnica permette di selezionare e

amplificare, a partire da una soluzione eterogenea, un particolare tratto di interesse. In questo modo

si possono ottenere numerose copie di DNA senza dover ricorrere al clonaggio.

PCR

Le fasi della PCR sono 3: denaturazione, appaiamento e allungamento. Nella prima fase si

raggiungono temperature molto alte in modo che l'energia termica così prodotta aumenti il moto

delle molecole. I legami che stabilizzano la doppia elica si rompono e si ottengono filamenti singoli

di DNA. Per sapere quando il DNA è denaturato si ricorre alla spettrofotometria: i filamenti singoli

infatti assorbono maggiormente la radiazione rispetto a quelli doppi, in particolare le basi riescono a

assorbire intorno ai 260 nanometri. In questo modo è stata stabilita la temperatura di fusione del

DNA, indicata con Tm, che è influenzata dalla presenza di legami G-C, dalla lunghezza del

filamento, dalla concentrazione salina e dal pH. Nella seconda fase i primer, di 15/25 pb, disposti in

soluzione si allineano ai filamenti di DNA a essi complementari. La terza fase poi è data da una

reazione catalizzata dalla DNA-polimerasi termostabile che, in presenza di dATP, dCTP, dGTC e

dTTP, aggiunge nucleotidi ai primer fino a completare il segmento.

Il procedimento della PCR è ripetuto n volte ed in questo modo si creano molte copie di DNA

amplificato, che poi vengono messe in gel di agarosio. Tutti questi passaggi sono effettuati in

piccoli strumenti, chiamati termostati, nei quali è possibile far avvenire i vari cambiamenti di

temperatura necessari alle varie fasi della PCR.

I parametri cruciali di questa reazione sono molteplici: il disegno dei primer, che non devono creare

appaiamenti interni; la temperatura di appaiamento che deve essere altamente specifica ed infine i

tempi ovvero il numero di cicli sufficienti per creare la quantità di DNA desiderata (in genere ne

bastano 30).

Questa tecnica ha anche dei limiti infatti non è adatta per dare una misura della quantità della

sequenza che si vuole amplificare ed inoltre è facilmente soggetta al rischio di contaminazioni.

→RT-PCR = è una variante che viene utilizzata per studiare l'espressione genica. Consta di due

passaggi:partendo da una preparazione di mRNA viene innanzitutto sintetizzato il cDNA attraverso

l'uso della trascrittasi inversa e questo successivamente viene utilizzato come materiale di partenza

per una normale PCR.

DETERMINAZIONE DELLA SEQUENZA NUCLEOTIDICA

ci sono due tecniche che permettono di determinare la sequenza dei nucleotidi ed entrambi hanno lo

stesso principio di base: si parte da un filamento di DNA di circa 40 nt, poi per determinare la

presenza di un nucleotide in particolare, ad esempio delle G, si inizia con il generare l'insieme dei

frammenti che si estendono dalla estremità 5' fino a ciascuna delle G interne. I frammenti tronchi

così ottenuti vengono separati su un gel di poliacrilammide con un sistema di elettroforesi ad alto

voltaggio che permette di dividere frammenti che differiscono anche per un solo nt. La posizione

delle bande del voltaggio ci permette di stabilire la posizione delle G nella sequenza di partenza.

I frammenti possono essere generati con due metodi:

1. metodo chimico = si basa sul taglio del frammento di DNA mediante specifiche reazioni

chimiche che permettono di modificare alcune basi e di tagliare là dove le basi sono

modificate. Poi per poter identificare i filamenti mediante elettroforesi è necessario marcare

con fosforo radioattivo la prima base al 5'. Tale procedimento viene fatto con tutte le basi. I

frammenti vengono poi fatti correre su un gel di poliacrilammide che viene preparato per

polimerizzazione di una soluzione di un monomero monofunzionale, ovvero l'acrilammide,

e uno bifunzionale, la N,N'-metilen-bis-acrilammide.

2. metodo enzimatico o Sanger = implica la sintesi dei frammenti tronchi da parte di una DNA-

polimerasi che utilizza come stampo il DNA del quale si vuole determinare la sequenza. La

DNA-polimerasi che viene utilizzata in particolare deve avere una elevata processività, una

bassa attività esonucleasica 5'→3' e 3'→5'. La DNA-pol I è poco adatta poiché il frammento

KLENOW ha una bassa processività, si usa perciò la sequenasi che ha una alta processività

ed inoltre virtualmente non ha un'attività esonucleasica 3'→5'.

Il DNA di interesse è prima clonato in un vettore a singolo filamento. Si crea poi un primer

marcato che sia complementare alla sequenza già nota del vettore e non adiacente alla

sequenza da analizzare. In particolare lo stampo a filamento singolo viene prodotto

seguendo le seguenti fasi: utilizzo di un fago filamentoso come M13 per la produzione della

forma a singolo filamento, utilizzo di un fagemide, utilizzo della PCR ed infine

denaturazione. A questo punto si aggiunge il primer marcato che si lega alla sequenza

complementare. È da notare che i primer aggiunti nelle varie provette contenenti i vari

ddNTP sono marcati diversamente per poterli riconoscere. Per arrestare la duplicazione nel

punto in cui è presente il nucleotide di interesse si aggiunge alla soluzione un nucleotide che

presenta dideossiribosio che manca del 3'OH necessario per l'allungamento. Quando viene

incorporato, 1 volta su 500, la sintesi si arresta. Un problema che si può incontrare con tale

metodo è l'arresto improvviso della sintesi dovuta a forcine che si possono formare sul

filamento stampo.

VALUTAZIONE DELL'ESPRESSIONE DI UN GENE

northern blot = misura il livello globale del trascritto di un gene. Molecole di varia misura di RNA

sono separate mediante elettroforesi in gel di agarosio e trasferite su filtri di nitrocellulosa. Il filtro

viene poi incubato con una sonda di DNA radioattivo che può ibridare una molecola di RNA. Le

molecole poi vengono visualizzate con la stessa tecnica del southern.

Western blot = misura il livello di proteina del gene. Se si dispone dell'anticorpo che lega la proteina

di interesse, le proteine possono essere separate mediante elettroforesi SDS-page e trasferite poi su

un foglio di nitrocellulosa e da qui possono poi essere incubate con l'anticorpo e poi con un

anticorpo secondario marcato che ne rende possibile l'identificazione.

→primer extension = permette di stabilire il punto di inizio della trascrizione a livello nucleotidico.

Se il gene in esame codifica per una proteina si parte dalla purificazione degli mRNA del quale,

tramite Northern, si sa che l'espressione di quel gene è molto alta. Alla miscela di tutti gli mRNA si

aggiunge un primer radioattivo complementare a una regione vicina all'inizio della regione

codificante. Si forma quindi un ibrido DNA/RNA di cui il 3' può essere allungato fino alla 5' se

vengono aggiunti i 4dNT e la trascrittasi inversa. A questo punto bisogna capire di quanto il primer

è stato allungato e dove si trova il 5' del trascritto e per farlo lo si fa correre in gel assieme al primer

iniziale. Stabilito il 5' del trascritto si cerca di localizzare il promotore e lo si fa grazie ai geni

reporter. Questi codificano per proteine di cui è facile misurare la quantità e l'attività e uno di essi è

ad esempio la β-galattosidasi o la GFProtein o la luciferasi (la proteina responsabile della luce delle

lucciole). Con tecniche di DNA ricombinante si introduce la sequenza che si pensa sia il promotore

su questi geni e se ne osserva l'espressione.

NOTA BENE: il frammento di Klenow deve il suo nome al suo scopritore che capì che la DNA-

polimerasi I può essere divisa in due frammenti di cui uno più piccolo che ha attività esonucleasica

5'→3' e l'altro, che è quello di Kleonow, ha sia attività polimerasica che esonucleasica di

proofreading 3'→5'.

RNA

L'RNA oltre ad avere al posto della timina l'uracile, oltre ad avere l'OH in posizione 2' sullo

zucchero può anche avere molte basi modificate. La struttura che assume è un'elica di tipo A, dove

il solco maggiore è più profondo e meno accessibile ed il solco minore è più largo e accessibile. La

presenza dell'OH inoltre rende la molecola di RNA molto reattiva perché il gruppo ossidrilico tende

a fare un attacco nucleofilo sullo scheletro zucchero-fosfato degli acidi nucleici ed è per questo che

l'RNA ha funzioni catalitiche.

La struttura secondaria dell'RNA è resa più o meno stabile a seconda dell'energia libera necessaria

per gli accoppiamenti tra le basi. Alcune strutture, come le anse, in genere destabilizzano la struttura

secondaria ma possono anche essere molto stabili grazie alle interazioni idrofobiche come nel caso

del tetraloop GC-UGUU-GU. Gli appaiamenti tra le basi poi possono essere anche in posizioni non

contigue dando vita agli pseudonodi che si formano quando un segmento di RNA che ha già

formato un'ansa in una regione si ripiega e i nucleotidi dell'ansa interagiscono con quelli di una

regione vicina al filamento in seguito alla formazione di una seconda torsione. La telomerasi umana

presenza un ripiegamento di questo tipo.

Un altro tipo di ripiegamento e di interazione che si può trovare nel RNA è il motivo A-minore che

si trova per esempio nei ribozimi (RNA+enzima, sono RNA con funzione catalitica) di gruppo I e

negli RNA ribosomali. In particolare alcune adenosine possono interagire con i nucleotidi del solco

minore di RNA a doppia elica attraverso legami di Wan der Waals e stabilizzare così l'intera

struttura.

L'RNA poi può avere la struttura ribose zipper domain che si forma quando in un ripiegamento di

una lunga regione a doppia elica due solchi minori si trovano in contatto e il 2'OH di un'elica

interagisce con l'O 2 di una base pirimidinica o con l'N 3 di una purina.

Gli RNA vengono definiti aptameri proprio perché sono in grado di adattarsi ed interagire con un

grande numero di molecole diverse.

→ tRNA = ha una struttura a trifoglio, la quale presenta poi ripiegamenti ulteriori in modo da

appaiare le anse distanti e formando così una L. Tutti i t-RNA maturi assumono tale forma e sono

lunghi 73-92 nucleotidi e presentano molte basi modificate. Tali modificazioni svolgono diverse

funzioni come quelle presenti sull'anticodone che regolano l'efficienza della traduzione e la crescita

cellulare, le modificazioni del corpo centrale che modulano la struttura secondaria, la terziaria e la

loro stabilità ed infine alcune modificazioni sono importanti per determinare l'identità e la

specificità del tRNA. In alcuni casi la mancanza di tali modificazioni può addirittura avviare vie

degradative. I motivi strutturali comuni a tutti i tRNA sono le anse che contengono le basi

modificate come: l'ansa D che contiene la diidrouridina, l'ansa T-Ψ-C che contiene la pseudouridina

ed infine la sequenza CCA all'estremità 3' della molecola. Inoltre in tutti i tRNA avviene una

rotazione dei nucleotidi nella regione dell'anticodone in maniera da essere esposti all'esterno. Inoltre

un'altra importante caratteristica è data dall'impilamento coassiale dei bracci che si impegnano in

interazioni con regioni non direttamente contigue come ad esempio il braccio accettore che si impila

sul braccio dell'ansa T-Ψ-C.

Può accadere tuttavia che non sempre la forma più stabile sia anche quella ritrovata in vitro e che di

conseguenza la forma biologica funzionale non corrisponda alla forma più favorevole

energeticamente. Infatti si trovano spesso delle proteine, appartenenti alla famiglia delle hnRNP

(ribonucleoproteine nucleari eterogenee), che consentono all'RNA di assumere le forme biologiche

di interesse e che gli impediscono di assumere la forma energeticamente più vantaggiosa. Un altro

2+

fattore che aiuta ad assumere il corretto ripiegamento è il Mg .

→ rRNA= in seguito alla sua sintesi e al suo processamento mediante tagli endonucleolitici la

maturazione degli rRNA prosegue nel nucleolo con una serie di modificazioni, le cui principali sono

la 2'-O-metilazione, ovvero la metilazione dei ribosi in posizioni 2', e la pseudourilidalazione,

ovvero la conversione da uridine a pseudouridine. Tali modificazioni sono guidate da due classi di

snoRNA: C/D guidano la O-metilazione e H/ACA dirigono la modificazione delle uridine. Essi

sono poi aiutati da delle proteine snoRNP.

filamento senso = è il filamento codificante, corrisponde all'RNA che si formerà.

Filamento stampo = può avere anch'esso dei geni per cui codifica. Esistono casi in cui entrambi i

filamenti sono codificanti.

→ pseudonodi = fanno assumere all'RNA forme simili a quelle delle proteine.

→ RNAasi = si usano per riconoscere la struttura: esistono quelle specifiche per RNA a singolo

filamento e specifiche per regioni a singolo o a doppio filamento.

→ unità di trascrizione = è tutto il DNA da trascrivere.

→ pre-mRNA =è un filamento di RNA che contiene sia introni che esoni.

→ splicing = processo di maturazione del mRNA.

→ splicing alternativo= processo mediante il quale a partire da un unico pre-mRNA si possono

ottenere mRNA diversi.

Nota bene =

-gli intorni sono più lunghi degli esoni