Biologia molecolare avanzata I

BIOLOGIA MOLECOLARE AVANZATA I

La trascrizione è il primo evento dell'espressione genica e per ottimizzare la crescita delle cellule batteriche, la

trascrizione deve essere regolata finemente.

Come ben sappiamo la trascrizione si completa di 3 grandi fasi:

• FASE D'INIZIO: l'RNA polimerasi con il fattore sigma riconosce dei promotori con delle sequenze consenso e

si forma un COMPLESSO CHIUSO. Per partire con la trascrizione occorre che avvenga l'isomerizzazione

spontanea a COMPLESSO APERTO.

• FASE D'ALLUNGAMENTO: dove si ha la formazione di legami fosfodiesterei per far allungare i

ribonucleotidi che costituiscono il messaggero.

• FASE DI TERMINAZIONE: La RNA polimerasi riconosce delle sequenze di terminazione sul templato e si

forma una forcina di terminazione che fa allontanare la RNA polimerasi dallo stampo e questa se ne va.

La RNA polimerasi è un polipeptide, nel senso cheè formato da più proteine che, cooperando assieme, danno

l'oloenzima compleso.

In particolar modo quando parliamo di RNA polimerasi parliamo di diverse subunità proteiche che la costituiscono, vale

a dire:

• Due subunità alfa, che formano la cosiddetta cerniera della RNA polimerasi.

• Subunità Beta, che costituisce il soffitto della RNA polimerasi

• Subunità Beta', che costituisce il pavimento della RNA polimerasi

• Subunità Omega, che ha una funzione detta CHAPERON LIKE, una subunità non dispensabile alla vita della

RNApolimerasi, ma che ha l'importante funzione di favorire il legame tra le varie subunità ed è importante per

mantenere l'RNApolimerasi in forma nativa.

• Subunità Sigma, che riconosce il promotore e serve per la FASE DI MELTING, ovvero per il distacco del

filamento stampo dal non stampo (complementari tra di loro).

La RNA polimerasi si lega nel promotore e hanno fatto degli esperimenti sfruttando la cristallografia, per capire dove la

RNA polimerasi lega il DNA. Si è visto che essa lo lega in corrispondenza del PROMOTORE e posso vedere l'attività

enzimatica, dell'RNA polimerasi associata al DNA.

Sebbene il cristallo sia rigido, vedremo come l'RNA polimerasi deve avere una certa flessibilità per poter ancorarsi al

DNA stampo e favorire la crescita del trascritto.

La RNA polimerasi batterica è quella più studiata e i suoi meccanismi molecolari sono validi per tutte le RNA

polimerasi (in particolar modo per la II degli eucarioti -deputata alla sintesi di tutti i messaggeri cellulari- e alla RNA

polimerasi degli archebatteri.

I primi studi sull'RNA polimerasi risalgono alla fine degli anni '60. Hanno condotto importanti esperimenti che hanno

permesso di studiare i meccanismi d'azione della RNA polimerasi, esperimenti poi confermati dagli approcci

cristallografici.

Ma quali sono le caratteristiche delle diverse subunità?

Il polipeptide intero ha un peso molecolare di oltre 400 kD. La subunità omega è formata da 91 amminoacidi e la sua

funzione, nonostante non sia indispensabile per la vita della RNA polimerasi, è necessaria per favorire il legame tra le

varie subunità ed è importante per mantenere l'enzima alla forma nativa. E' una subunità che potrebbe anche non

esserci, che tanto l'enzima continua a fare il suo lavoro.

Il fattore sigma serve per riconoscere il promotore e caratterizza il MELTING, cioè la separazione dei filamenti stampo

e non stampo. La subunità alfa è la parte più flessibile dell'enzima e interagisce con alcuni regolatori e permette

l'assemblaggio del CORE enzimatico della polimerasi.

Le subunità Beta e Beta' servono per legare il DNA e quindi i nucleotidi, per permettere poi la crescita del trascritto

(partecipano all'allungamento dell'RNA), Alla fine degli anni 60 (1969) hanno fatto un esperimento sull'RNApolimerasi

di Coli. Hanno purificato con una colonna cromatografica d'affinità la polimerasi e poi l'hanno fatta correre su gel,

evidenziando bande diverse, che riflettevano le diverse subunità. In particolar modo riuscirono ad identificare le

subunità che costituivano il COR, che sono 4:

Le due subunità alfa, per un peso di 40 kD, le subunità Beta e Beta', dalle funzioni già viste e la subunità omega,

scarsamente visibile sul gel. Si è frazionato l'enzima ulteriormente e hanno visto le due subunità alfa, le due beta e la

subunità sigma, che invece rappresenta una subunità isolata e separata a sé stante.

Ma che tipo di reazioni catalizzano queste subunità?

Lo posso comprendere con dei saggi di trascrizione in vitro. Metto la RNApolimerasi con del DNA fagico intero - senza

tagli - con dei nucleotidi e vedo che il CORE enzima (due beta e due alfa), hanno un'attività più bassa che se adoperassi

l'oloenzima compleso.

Allora l'OLOENZIMA possiede un'attività 60 volte più efficiente del CORE da solo.

Se prendo un DNA nativo con dei tagli, il CORE aumenta la sua attività rispetto a quando ho del DNA intero fagico

(quello usato in precedenza) e l'OLOENZIMA ha un'attività che comunque resta superiore al CORE da solo di circa il

doppio.

Effettivamente il miglioramento per il CORE enzima si osserva e il DNA frammentato favorisce dei siti d'inizio per la

RNA polimerasi, la quale fa partire la reazione di trascrizione senza svolgere la doppia elica. 1

L'OLOENZIMA, dove c'è il fattore sigma, è più specifico ed efficiente nella trascrizione, dal momento che sigma non è

parte del CORE.

Questo dettaglio è stato dimostrato sperimentalmente con le metodiche di FILTER BINDING e LIGAZIONE

COMPETIZIONE.

Il DNA stampo immobilizzato sul filtro di nitrocellulosa, su un imbuto, lo faccio ibridiare al corrispettivo RNA a

singolo filamento. La nitrocellulosa riesce a tenere su acidi nucleici a singolo filamento (SS) e proteine.

Se filtro la soluzione che contiene DNA, passa tutto. Se ho delle proteine marcate che voglio far passare, queste

vengono trattenute dal filtro. Allora se faccio passare dei complessi DNA-proteine questi verranno trattenuti poiché,

sebbene il DNA sia a doppio filamento, è legato a delle proteine e viene trattenuto. Questo lo spiega la CINETICA di

ASSOCIAZIONE tra proteine e DNA o enzimi e DNA.

Tutto questi è stato fatto per studiare le interazioni tra proteine e DNA o interazioni tra proteine ed RNA.

Un altro tipo di saggio per gli studi di associazione tra DNA e proteine è stato il meccanismo di LIGAZIONE-

COMPETIZIONE basato sul filtro visto prima. Effettivamente la trascrizione in vitro è seguita da IBRIDAZIONE su

filtro. Se ho del DNA a doppia elica e ho due box distinti sul DNA “X” e “Y”, lo denaturo e aggiungo la

RNApolimerasi e i ribonucleotidi marcati e dopo la fase di trascrizione ottengo del trascritto marcato sul fosfato alfa

(per esempio).

Quindi lo passo sul filtro. Ovvio che dove avrò il filamento di DNA fissato sulla nitrocellulosa e complementare

all'RNA marcato complementare, questo si appaierà e non passerà oltre. Questo meccanismo è abbastanza semplice e

riguarda solo la fase di LIGAZIONE. Non c'è nessun altro competitore. Allora potrei avere una CURVA DI

SATURAZIONE e più DNA aggiungo più aumenta la radioattività, dal momento che avrò sempre più molecole di

trascritto radioattivo che possono appaiarsi con il DNA fissato. Mi aspetto di arrivare ad un plateau della saturazione.

Se per contro, l'ibridazione con trascritto radioattivo dovesse avere un competitore (DNA per esempio), è ovvio che il

DNA complementare competitore alla sequenza dello stampo (fissata su nitrocellulosa), fa sì che venga titolato via il

trascritto marcato e passerà oltre il filtro.

La metodica di FILTER BINDING e quella di BINDING COM PETITION hanno stabilito che il fattore sigma

conferisce specificità alla trascrizione.

Possiamo fare un esempio:

Ho il fago T4 che codifica per geni che danno proteine immediate precoci, geni che danno proteine immediate tardive e

geni che codificano per proteine tardive, per lo più a funzione strutturale.

Ora, anche i geni saranno chiamati geni immediati precoci, geni immediati tardivi e geni tardivi.

Se prendo l'RNA di E.coli dopo un minuto d' infezione con fago T4, vedo che questo RNA ibrida i filamenti fissati sul

filtro dei geni immediati precoci del fago T4 e la radioattività associata al filtro è del 50 %.

Si tratta dell'RNA che dovrebbe essere il trascritto dei geni immediati

Dopo 5 minuti d'infezione, prendo l'RNA di coli infettato da T4. Lo passo nel filtro e vedo che, pur mantenendo sempre

fissati la maggior parte dei geni immediati precoci, succede che la radioattività scende AL 25 %, poiché gli RNA

prodotti dal batterio non sono più la maggior parte quelli codificati dai geni immediati precoci, ma ho anche una buona

parte di geni immediati tardivi che cominciano ad essere trascritti.

Dopo 17 minuti d'infezione, la radioattività scende allo 0%, dal momento che aumenta la quantità di RNA trascritto

sulla base dei geni virali tardivi e non s'appaieranno più con il DNA dei geni immediati che ci sono sul filtro.

Da questo possiamo dedurne che il fattore sigma conferisce specificità di espressione nella trascrizione.

Il fattore sigma garantisce un legame forte e duraturo con il promotore. Lo stesso approccio è usato per fare in modo

che sia dimostrato che sigma dia un legame stabile e forte nel tempo.

Il DNA competitore usato in questo caso è freddo (non radioattivo) e lo uso poiché la RNA polimerasi libera e non

legate vengono rubate dal DNA competitore. Per l'OLOENZIMA (ovvero il CORE più la subunità sigma) si ha una

costante di dissociazione molto alta, nonché tra 30 e 60 ore e si è visto che la costante di dissociazione per il CORE

senza sigma, la costante di dissociazione è di un solo minuto e anche meno.

Si è visto che la costante di dissocazione per la RNA polimerasi senza CORE è inferiore al minuto, allora la CORE ha

un legame con il DNA instabile.

Un altro aspetto interessante è che la temperatura gioca un certo ruolo in tutto questo. L'RNA oloenzima e DNA con

alte temperature sono ben uniti, vale a dire che l'associazione tra Promotore ed RNA polimerasi è molto stabile nel

tempo a 37 °C, ma instabile a 15 °C.

Proprio perché la RNA polimerasi favorisce il MELTING e la separazione deve essere molto stabile e la RNA

polimerasi si deve legare stabilmente sul promotore e questo favorisce anche il MELTING. 2

Le sequenze consenso rappresentano una probabilità e difficilmente sono sempre uguali e dappertutto in natura, poiché

il promotore, altrimenti, sarebbe sempre acceso e darebbe sempre trascrizione continua nel tempo. E’ un andamento che

non c’è in natura, poiché in natura si vuole far sì che l’espressione genica sia regolata in relazione alle condizioni

esterne e alle esigenze.

Quello che abbiamo descritto è un promotore semplice, che ha dei siti a -10 e a -35 più o meno conservati.

C’è anche il promotore cosiddetto COMPLESSO, con sequenza consenso e possiede dei BOX per regolare

l’espressione genica. E’ presente l’UP ELEMENT tra -40 e -60 e che viene direttamente contattato dalla subunità α

della polimerasi. Su questo promotore ci sono dei siti di legame per FIS (un attivatore della trascrizione). La struttura

vista è tipica di uno dei sette geni che codificano per l’RNA ribosomiale di E.coli e i promotori di questi geni sono i

primi che sono stati studiati, che hanno permesso di studiare la regolazione della trascrizione e hanno permesso, inoltre,

di capire il meccanismo di trascrizione.

Come si studiano le interazioni tra proteine e DNA e come si possono trovare le zone di legame sul DNA per le

proteine stesse (tra cui anche la RNA polimerasi) e come vengono contattate le basi. Come posso trovare basi

che, nonostante non siano contattate dalla proteina, comunque vengono modificate dal legame che la proteina

origina con il DNA in un altro punto?

Si procede con la metodica del MAPPING mediante esonucleasi 3 e c’è un filamento di DNA marcato ad un’estremità.

Devo studiare un promotore e aggiungo alla miscela per il saggio di trascrizione in vitro la RNA polimerasi, che può

quindi legarsi col promotore.

Aggiungo l’esonucleasi 3, che ha la caratteristica di tagliare l’estremità di DNA a partire dal 3’, per cui dopo che

l’esonucleasi ha agito e tolgo la RNA polimerasi, sono in grado di vedere la regione del DNA che la polimerasi ha

protetto. Saranno state tagliate le basi che la RNA polimerasi contatta, ma che non copre.

Essendo comunque una zona del DNA a doppio filamento ( quella protetta dalla RNA polimerasi), i due filamenti

digeriti da 3’ restano comunque uniti assieme nel punto di Double Strenght e ne deriva che la marcatura di anche un

solo filamento (al 5’ per evitare che venga distrutto dall’azione dell’esonucleasi) consente di evidenziare in un gel per

elettroforesi il peso molecolare corisspondente ai filamenti di DNA e alla RNA polimerasi legata ad esso.

Un altro tipo di esperimento per mappare il legame dell’RNA polimerasi con il DNA è adoperare RNAasi 1/2

FOOTPRINTING.

C’è sempre il DNA marcato all’estremità 5’ e se l’RNA polimerasi è legata stabilmente al DNA, la RNAasi 1, che è in

grado di tagliare DNA SS, si ferma laddove trova la RNA polimerasi sul DNA e ottengo la protezione dei filamenti

dove si lega.

Con la metodica vista, l’eventuale attacco dell’RNA polimerasi al promotore del gene per RNA ribosomiale di E.coli,

consente la protezione del filamento in corrispondenza del promotore (dove si lega la polimerasi) e in una eventuale

corsa su gel non vedrei le bande che vedrei se facessi lo stesso esperimento in assenza di RNApolimerasi. Infatti se

l’enzima non è presente, la digestione dei filamenti SS può avvenire e avrò delle bande diverse e più leggere (c’è meno

DNA che rimane).

Allora l’RNA polimerasi si lega al promotore e il legame può essere studiato e mappato mediante i metodi visti.

Come si studia la isomerizzazione spontanea da complesso chiuso ad aperto?

Si può fare un esperimento che sfrutta il fatto che i residui di azoto sulle basi azotate possono essere mutilati da DMS

(DIMETILSOLFATO).

Se ho delle adenite e delle timine su un promotore che si parono grazie al MELTING promosso dalla RNA polimerasi,

il residuo di azoto dell’adenina viene esposto ed è suscettibile a mutilazione in presenza di DMS. Se dovesse essere

presente, la mutilazione dell’adenina renderebbe poi impossibile la successiva fase di appaiamento con la corrispettiva 3

timida e la regione del promotore vista resterebbe aperta. Un punto del DNA DS non si richiude, all’uscita della RNA

polimerasi.

Possiamo fare anche un altro esempio:

Il seguente esperimento fu utilizzato per mappare la BOLLA, il cosiddetto LOCAL MELTING, che avviene,

banalmente, a livello del promotore.

Abbiamo il solito DNA marcato all’estremità 5’ e c’è il promotore. Se l’RNA polimerasi catalizza il MELTING, avrei

delle adenite che verrebbero esposte e sarebbero suscettibili alla mutilazione. Se aggiungessi DMS, pertanto, esse

verrebbero mutilate.

Quindi c’è la separazione dei filamenti e vengono mutilati. Se togliessi la RNApolimerasi, non avrei più appaiamento

dei due filamenti e se aggiungessi S1, che è in grado di tagliare i singoli filamenti, andrei a digerire parte del DNA.

Ciò che si otterrebbe sarebbe una popolazione di singoli filamenti di DNA e se andassi a correre questa popolazione di

filamenti su gel vedrei dei frammenti diversi. Questo esperimento, come già dett, lo si utilizza per vedere la separazione

del filamento stampo dal non stampo, catalizzata dall’RNA polimerasi a livello del promotore. Quindi vado ad

osservare la formazione del complesso aperto in vitro.

Un esperimenti condotto nel 1972 e confermato nel 2004 ha studiato dove mappava la zona del MELTING

promosso dall’RNA polimerasi. Da questo esperimento si vede che la RNA polimerasi è in grado di catalizzare il

MELTING

Si è adoperata come sonda il promotore A3 del fago T7, a cui è stato aggiunta la RNA polimerasi. Hanno visto con

elettroforesi la presenza di uno smeare esteso che corrisponde alle basi comprese tra -9 e +3 e indica che l’RNA

polimerasi separa il DNA a livello del promotore tra queste regioni.

Lo smeare si ha poiché la separazione a livello del LOCAL MELTING previene la riassociazione tra i due filamenti. Lo

smeare è dato da popolazione di filamenti decompattati che danno una banda molto grande. Facendo correre a parte

diverse regioni del promotore, si è potuto paragionare lo smeare esteso alle bande che riflettono l’intervallo -9 e +3 del

promotore.

Furono Gilbert e Sanger ad utilizzare un metodo per capire questo dettaglio. L’esperimento prevede un trattamento

chimico seguito dal taglio con un enzima specifico, che riconosce specifiche basi azotate.

Per sapere che lo smeare osservato nel gel effettivamente fosse compreso tra -9 e +3 del promotore, hanno eseguito un

trattamento chimico che producesse tagli specifici sulla regione promotoriale e fa sì che possano ottenersi dei frammenti

per questo promotore. Dopo migrazione dei frammenti del promotore, riesco a comparare la banda dello smeare con

l’intervallo promotoriale nel quale esso può essere spiegato (lo smeare si ha poiché la separazione a livello del LOCAL

MELTING previene la riassociazione tra i due filamenti).

Un altro esperimento che mi consente di capire dove avviene la formazione del LOCAL MELTING, è lo studio

delle BASI DISTORTE, nel senso che il legame della proteina enzimatica (polimerasi) con il DNA provoca un non

corretto appaiamento delle basi, che si spostano e, venendo esposte, in presenza di DMS, sono suscett