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Facendo questa esperienza più volte e variando le condizioni, si è visto che ci sono diversi fattori e condizioni che

influiscono sul passaggio da uno stampo all’altro. Lo stampo secondo è efficace solo se è single strend e a bassa forza

ionica, dal momento che ad alte concentrazioni saline veniva dissociato il legame (legame elettrostatico) che c’era tra la

DNA e l’RNA polimerasi.

Se cambio la salinità nel tubo di reazione i legami elettrostatici si rompono. Si è visto anche che una regione a 9paia di

basi a doppio filamento è in grado di dare legame resistente con la RNA polimerasi anche ad alte concentrazioni saline

ed è una regione che deve mappare a +2 e +11 rispetto al 3’ dell’RNA nascente.

Si tratta di un legame idrofobico e non elettrostatico (poiché la fisica non è un’opinione) e, ad alte concentrazioni saline,

il legame non viene rotto.

Hanno visto che la sequenza a monte del trascritto nascente deve essere lunga almeno 6 nucleotidi per avere un legame

sensibile al sale.

Attraverso gli studi s’è visto che nella reazione d’allungamento si hanno dei complessi terziari, c’è l’RNA nascente, il

DNA e la RNA polimerasi e stanno assieme con un legame sensibile ai Sali (e il legame coinvolge parte del trascritto e

dell’RNA polimerasi) e un legame forte covalente, che forma l’anello di scorrimento del complesso terziario. L’anello

coinvolge DNA, RNA nascente e RNA polimerasi.

Il punto a valle del 3’ è il punto in cui l’RNApolimerasi si aggancia saldamente allo stampo. Allora nella stabilità del

complesso si ha l’interazione debole tra la regione -6 e la +1 tra il DNA e l’RNA polimerasi e poi un legame forte a

valle del trascritto nascente (al 3’), situato tra +2 e +11, riguardante l’interazione tra RNA polimerasi e DNA.

In altre parole:

FATTORI E CONDIZIONI CHEINFLUENZANO IL TEMPLATE JUMP e l’RNA POLIMERASI CHASE

•Stampo secondario a singolo filamento è efficiente solo a bassa concentrazione salina. Ad alte concentrazioni non si

forma il legame DNA-RNAP, ad indicare che il legame ssDNA-RNAP non è stabile ed il

complesso si dissocia;

•Una regione di solo 9bp a doppio filamento è sufficiente per formare un legame resistente a condizioni ipertoniche. Il

doppio filamento deve mappare tra le posizioni +2 e +11 rispetto al 3’ di crescita del trascritto. Il legame è idrofobico e

richiede interazione specifiche tra residui della proteina e basi del DNA;

•Una sequenza di 6 nucleotidi a singolo filamento a monte del trascritto nascente, è sufficiente per avere un legame sale

sensibile. SITI DI LEGAME TRA DNA ed RNA POLIMERASI NEL COMPLESSO TERZIARIO

Ma come hanno fatto i ricercatori a mappare in maniera così precisa?

Usando la tecnica del TRANSCRIPTION RUN OFF a cui hanno aggiunto il trascritto irradiato da Ultravioletti e hanno

fatto partire la trascrizione su un primo stampo e poi ne hanno modificato un secondo con un analogo della TIMINA in

tre posizioni differenti e hanno visto che quando s’irradiava la provetta con UV, si aveva la formazione di legami

crociati di qualcosa che legava le timine modificate.

Hanno eseguito l’esperimento per il secondo stampo, inserendo la timida modificata (5-Iododeoxyuridina) in una

posizione nel primo esperimento, in un’altra posizione nel secondo esperimento e in un’ultima posizione nel caso del

terzo esperimento.

Hanno fatto correre il gel in SDSPage e hanno visto che mettendo la timida modificata in posizione +6, sia la subunità

Beta, che la Beta’ restavano marcate.

Allora hanno corso in contemporanea questo stampo modificato con un marker di pesi molecolari.

Beta e Beta’ hanno un peso molecolare simile tra loro e su gel, dopo autoradiografia, posso vedere 2 bande molto

intense ed indistinguibili e sono coinvolte allora nel legame resistente ai Sali nel DNA di 9bp a doppio filamento. 15

Cross-linking (UV) dello stampo secondario contenente un analogo della timina (5-iododeoxyuridina)

incorporato in posizioni definite (+6, +1, -3); separazione dei complessi per SDS-PAGE e autoradiografia.

Se l’analogo della timina viene posizionato in posizione +1, la subunità prevalentemente marcata è Beta. Se l’analogo è

ancora più a valle, la subunità Beta è la più marcata, ma ho anche la radioattività di Beta’ e hanno mappato queste tre

regioni fondamentali d’interazione del complesso ternario.

LEGAME FORTE che coinvolge Beta e Beta’

 L’analogo della timina legata in posizione +1, fa sì che possa essere messo in evidenza, mediante

 autoradiografia (dopo la corsa su gel) la subunità Beta legata alla sequenza DS contenente +1. Questo ha

confermato quello che si era osservato precedentemente.

Se la Timina viene incorporata più a valle (terzo esperimento analogo), essa viene incorporata non più nella regione del

sito attivo, ma nella regione sensibile ai Sali e sono coinvolte entrambe le subunità Beta e Beta’.

Allora posso trarre le considerazioni secondo cui la subunità Beta lega il DNA SS e DS, mentre la Beta’ lega

maggiormente il DNA DS.

Abbandonando per un istante questi approcci per esperimenti, è curioso vedere come la struttura cristallografica

ottenuta da raggi X cambi nel caso dell’RNA polimerasi OLOENZIMA e nel caso della CORE.

Infatti, dopo la cristallizzazione dell’RNA polimerasi, hanno visto che il legame forte a valle, esercitata dalla porzione

NTD della subunità Beta e dalla regione CTD delle subunità Beta e Beta’ sono quelle che circondano ad anello il canale

centrale ed è l’ANELLO SCORREVOLE.

Questa struttura è definita a CHELA di GRANCHIO, in grado di agganciare il DNA stampo stabilmente.

Il legame forte a valle è esercitato dalle subunità β (-N) e ββ’ (-C) che mantengono la RNAP strettamente legata al

DNA formando un anello scorrevole. Il legame debole a monte è esercitato da β ed interessa il sito catalitico.

Affinché avvenga la fase d’allungamento, appare ovvio che bisogna risolvere la questione che riguarda l’ibridazione tra

catena nascente di RNA e DNA stampo.

Per capire questo meccanismo sono stati eseguiti degli studi di TRASCRIZIONE E PROMOTER WALKING.

Abbiamo un agente crosslinkante, non raggi ultravioletti (irradiazione), ma da SODIOMOLATO e l’URACILE che,

una volta crosslinkato, lega il DNA stampo in maniera coovalentemente stabile.

Allora parto da uno stampo sintetico che producono con la solita macchinetta e di questo stampo di cui conosco la

sequenza, decido di incorporare l’uracile in posizioni precisa: +21 e +45.

Da ricordare che il trascritto nascente lo si marca ad un’estremità (per esempio al 5’ con fosfato32). Lo si fa correre in

gel e si fa un’autoradiografia.

L’esperimento è un WALKING e quindi la RNA polimerasi può procedere fino a punti stabiliti dall’operatore. 16

Ora, se alla miscela di reazione, aggiungo del SODIOMOLATO, viene attivata la modificazione dell’URACILE e può

formare dei legami crociati con lo stampo (RNA + DNA) e la reazione di trascrizione è congelata, poiché l’RNA è

legato al DNA.

Per apprezzare le limitazioni strutturali dell’ibrido DNA-RNA si è isolata la miscela di reazione su gel per poter

discriminare il DNA dall’RNA.

In altre parole: L’RNA è sempre marcato, mentre il DNA, o le

proteine, sono marcati solo quando l’RNA forma

legami covalenti con essi.

Derivato di UMP (U•) incorporato nella catena

nascente di RNA-32P, in posizione +21 o +45. La

trascrizione viene poi diretta in modo da

sintetizzare trascritti con la base modificata

(l’agente cross-linkante) in posizioni diverse

rispetto al 3’ dell’RNA.

I legami crociati con la base appaiata permettono

di caratterizzare l’ibrido RNA-DNA, come pure il

complesso RNA-polimerasi.

Dopo aver corso nel gel, posso cercare di capire, in presenza di un agente denaturante, dove migrano le proteine e dove

migra l’RNA e posso capire dove erano avvenuti i legami DNA-RNA o RNA e proteine.

La metodica, in sintesi, prevede chebloccando la reazione di trascrizione in punti diversi, aggiungendo sodio borato, si

vede che cosa viene marcato. Infatti la marcatura al 5’ dell’RNA, qualora questo venga crosslinkato sullo stampo

mediante azione del SODIOMOLATO sugli URACILE modificati, anche l’RNA apparirà marcato, poiché è legato al

DNA marcato.

Il legame delle proteine e il DNA è necessario affinché la fase di trascrizione possa iniziare. Se non crosslinko la

proteina sul DNA, ma c’è un ibrido DNA ed RNA è perché la trascrizione è già partita e c’è la presenza del trascritto.

L’URACILE modificato è incorporato nel trascritto, e quindi nell’RNA messaggero.

A seconda di quando inserisco il nucleotide uracile modificato nella miscela di trascrizione, vedrò cose diverse: se

faccio in modo che esso venga incorporato quando la trascrizione è in posizione -2,-3,-5 o -7 rispetto al 3’, quello che

risulta marcato, dopo il crosslink mediante sodiomolato, corsa in gel e autoradiografia, è il DNA e un po’ di proteina,

dal momento che la trascrizione non è ancora iniziata (siamo ancora a livello promotoriale). Al contrario, se faccio sì

che l’uracile venga incorporato quando la trascrizione è già molto avanti, vedrei solo la proteina marcata, nonché

l’ibrido DNA-RNA e quindi la regione di circa 9 paia di basi. JULY.

E’ un esperimento che viene fatto per vedere la porzione specifica di legame e per vedere l’associazione tra DNA ed

RNA.

La parte proteica marcata va da -2 a -7, ma il grosso della proteina è il segnale tra -10 e -24. Scompare il segnale

imputabile al DNA stampo marcato e tutto l’RNA è associato alla proteina, perché l’RNA trascritto è già lungo e sta

uscendo dalla polimerasi.

Allora la proteina è più marcata quando l’uracile marcato non è più coinvolto nell’ibrido e quando la RNA polimerasi

non è più coinvolta nell’ibrido e si è spostata avanti.

Tra -10 e -24 scompare il segnale nel gel che corrisponde al DNA, allora ho trascritto abbastanza lungo associato alla

proteina, poiché sta uscendo.

L’RNA che sta trascrivendo è associata al DNA.

Se voglio che la trascrizione venga bloccata in corrispondenza della sequenza -21, posso aggiungere il

SODIOMOLATO.

Se voglio che invece continui un po’, gli aggiungo i substrati di cui essa ha bisogno e poi induco l’attività cross-linkante

aggiungendo SODIOMOLATO in un tempo più avanzato e vedo le modifiche (l’URACILE viene modificato) e posso

mappare in un determinato punto.

Mettiamo l’URACILE in corrispondenza di +21 e +45 e vediamo che cosa succede.

Questo mi permette di vedere la posizione dell’RNA polimerasi rispetto allo stampo di DNA e si voleva vedere che

cosa formava l’ibrido DNA-RNA nella fase di trascrizione.

Fermando la reazione di trascrizione, quando essa arriva in prossimità della sequenza -7 rispetto al 3’, si vede che si ha

un ibrido DNA-RNA di 9 paia di basi. Da ricordare che non si tratta di una sequenza di 9 paia di basi conservata, ma

può variare. L’ibrido di 9 paia di basi non è sempre lo stesso, poiché, così come l’RNA polimerasi si sposta, si sposta

anche la sequenza ibrida di 9 paia di basi. Effettivamente la trascrizione è un processo continuo e c’è sempre un ibrido

RNA–DNA e un anello che tiene stretto il DNA.

Nelle diverse fasi c’è sempre un ibrido RNA–DNA e l’anello scorrevole.

L’ibrido RNA–DNA, quindi, cambia man mano che l’RNA polimerasi procede. Questo esperimento lo si fa per vedere

come formare l’ibrido RNA–DNA durante la trascrizione.

Nel trascritto viene messo dell’URACILE modificato: quindi la trascrizione procede; se è presente SODIOMOLATO,

l’uracile viene modificato e la trascrizione si blocca nel punto in cui esso viene incorporato. In base ai trascritti che

otteniamo si può capire se è presente il legame RNA–DNA o RNA–proteina. 17

Abbiamo considerato il complesso ternario dal punto di vista della proteina e dello stampo in questo esperimento.

Ma come interagisce il complesso ternario?

Innanzitutto si tratta di un esperimento di trascrizione in vitro e anche nel template jumping si voleva vedere

l’interazione tra RNA e stampo.

In questo caso, invece, si vuole studiare l’interazione tra stampo ed RNA polimerasi.

Dopo aver capito le interazioni coinvolte nel complesso ternario, posso fare un complesso sintetico d’allungamento.

Ho un filamento di DNA e ci aggiungo la CORE polimerasi e non c’è bisogno del promotore e aggiungo dei primer, per

la reazione di innesco della reazione di trascrizione.

Aggiungo dei frammenti complementari allo stampo e il complesso ternario che si forma catalizza la trascrizione solo se

i primer sono lunghi almeno 9 nucleotidi, tutto questo affinché possa formarsi l’ibrido RNA–DNA necessario

all’attivazione dell’RNA polimerasi, che inizia il processo di trascrizione.

Per avere il complesso d’allungamento, è necessario disporre dello stampo, la CORE polimerasi, l’RNA come primer,

che siano complementari allo stampo, affinché possa essere catalizzata la reazione di trascrizione. Quindi si aggiungono

dei frammenti di RNA complementare allo stampo e si forma un complesso ternario di allungamento che deve formare

un ibrido DNA–RNA di almeno 9 nucleotidi per avviare la trascrizione.

INTERAZIONI TRA RNA POLIMERASI E PROMOTORE

Abbiamo già visto più volte che si osserva l’isomerizzazione dal complesso chiuso al complesso aperto e,

conseguentemente, si ha un complesso d’allungamento che catalizza la formazione del trascritto.

La struttura dell’RNA polimerasi è stata risolta. Abbiamo già visto come le sia stato anche attribuito un nome curioso

che riflette la sua struttura: CHELA DI GRANCHIO.

In questa chela è presente la subunità Beta che costituisce il tetto del canale centrale e la subunità Beta’, che costituisce

il pavimento del solco centrale. La chela è in grado di agganciare il DNA doppio filamento. Da ricordare la presenza

anche delle due subunità Alfa (che formano la cerniera della chela).

E’ stato possibile risolvere il sito attivo e cosa c’era per renderlo attivo. Hanno visto che c’era del Magnesio coordinato

da tre residui di aspartato (questo all’interno della sequenza conservata dell’RNA polimerasi).

Mutazioni nei residui di aspartato sono letali e non si riesce più a catalizzare la sintesi di RNA, mentre resta comunque

in grado di dare l’isomerizzazione da complesso chiuso a complesso aperto.

Dal momento che non sono ancora disponibili dei cristalli del complesso ternario, sono stati proposti dei modelli

speculativi dove c’è la MASSA dell’RNA polimerasi con un CANALE PRIMARIO e un CANALE SECONDARIO di

uscita. Se scoperchiassi la struttura, si può cercare di posizione sito catalitico verso la subunità Beta’, che possiede il

magnesio e subunità Beta, che contiene la tasca per la RIFAMPICINA.

In presenza di RIFAMPICINA si ha un blocco dell’inizio della trascrizione e quindi della fase d’allungamento. Questo

è spiegato dal fatto che questo antibiotico è in grado di posizionarsi all’interno del sito catalitico dell’RNA polimerasi

contattando dei residui amminoacidi e non si può avere uscita del trascritto. C’è un ingombro sterico e il trascritto non

riesce fisicamente ad uscire dal foro secondario e si ha il blocco dell’inizio di trascrizione.

REAZIONI DI ALLUNGAMENTO e TOPOLOGIA del DNA 18

Come si muove la RNA polimerasi sullo stampo?

Ci sono due possibili meccanismi alternativi:

• La RNA polimerasi si muove girando

attorno al DNA, seguendo l’andamento

dell’elica. In questo caso il trascritto

resterebbe attorcigliato attorno al DNA.

• La RNA polimerasi catalizza lo svolgimento

del DNA a monte e riavvolge a valle, e il

___________ del DNA a valle e la RNA

polimerasi si può muovere sullo stampo e

rilasciare l’RNA che trascrive.

Nel caso della prima modalità, i superavvolgimenti del trascritto sul DNA vengono rilassati mediante

TOPOISOMERASI, così, praticando dei tagli, il DNA può rilassarsi dopo il passaggio dell’RNA polimerasi.

Interessante è ricordare che ci sono delle attività di PAUSING e di PROOFREADING della RNA polimerasi.

La velocità di allungamento della polimerasi non è sempre costante, poiché deve indietreggiare e controllare quello che

ha trascritto e intervengono Cre A e Cre B (proteine ancillari o ausiliatrici) e tolgono nucleotidi sbagliati quando la

RNA polimerasi ne ha incorporato uno errato (sono proteine che, in altre parole, stimolano l’attività RNAasica della

RNA polimerasi).

Sono delle proteine che aiutano la RNA polimerasi nella fase di PROOF READING.

Sperimentalmente si è visto che la sequenza per la terminazione viene trascritta e ci sono due modalità di terminazione

per la trascrizione:

• RHO INDIPENDENTE (grazie ad una struttura secondaria intronica e si origina una struttura a forcina con

una coda di POLIURIDINE). La terminazione RHO (ρ) indipendente avviene mediante una struttura

secondaria caratteristica ricca in GC, seguita da poli-U.

• RHO DIPENDENTE: c’è una sequenza ricca di citosine e c’è un LOADING SITE, nonché un sito di

caricamento per la proteina RHO. Il LOADING SITE segue la sequenza del terminatore ricca in citosine ed è

costituita da tre basi altamente conservate definite CUU. La terminazione RHO (ρ) dipendente avviene

mediante il sito terminatore che possiede prevalenza di C (>40%) seguite da “CUU”.

Vediamo un esempio della terminazione RHO INdipendente illustrata anche dal prof Zappavigna:

COME TERMINA LA TRASCRIZIONE?

Prima di parlare di questo, è bene fare qualche cenno. Nei procarioti non c’è il nucleo, e la trascrizione è abbinata solo

ad un processo di trascrizione. C’è colinearità tra sintesi dell’mRNA e produzione di proteine (sintesi proteica)

Possiamo vedere questa cosa al microscopio elettronico.

L’asse centrale è DNA; i filamenti periferici sono i filamenti di mRNA e le palline alla fine sono i ribosomi.

La trascrizione e la traduzione sono contemporanee, proprio perché il DNA sta nel citoplasma.

Negli eucarioti, invece, abbiamo una membrana nucleare che delimita un nucleo. Il nucleo e il DNA che sta nel nucleo

prima è uno strascritto primario, poiché l’mRNA prodotto inizialmente deve maturare e subirà alcune modificazioni nel

nucleo, prima di essere esportato al citoplasma per il processo di sintesi proteica.

Una grossa differenza con le cellule batteriche, dove l’RNA è usato tale e quale immediatamente prodotto, mentre negli

eucarioti deve maturare.

Un’altra differenza per quanto riguarda l’espressione genica tra procarioti ed eucarioti, è che nei procarioti i geni sono

riuniti tra loro a formare degli operoni (piccoli raggruppamenti di geni) regolati in maniera regolata ( o tutti o nessuno-

effetto ON/OFF).

Ma che tipo di mRNA si forma nei procarioti?

C’è un mRNA detto POLICISTONICO e contiene l’informazione per fare più di una proteina. E’ un lungo mRNA che

abbraccia tutto l’operone. Il mRNA POLICISTONICO serve per fare un certo numero di proteine.

I 3 geni dell’Operone lac sono trascritti da un unico mRNA. Negli eucarioti ogni gene ha il proprio mRNA, che produce

una proteina soltanto. Si definisce mRNA MONOCITONICO (e contiene l’informazione per dare una sola proteina).

Esistono dei raggruppamenti genici negli eucarioti (molto vicini sul DNA tra loro riuniti in CLASTER), però anche in

questo caso non c’è mai un unico mRNA che li comprenda tutti, ma ogni gene ha il proprio mRNA diverso dall’altro e

regolato in maniera anche diversa.

Abbiamo visto quali sono invece che portano all’inizio della trascrizione e quali sono i MARCATORI del punto

d’inizio. Però nel processo di trascrizione è importante avere anche una TERMINAZIONE della trascrizione.

Se in Escherichia coli la trascrizione comincia nel promotore dell’operone lac e non termina, la RNA polimerasi

continuerebbe a trascrivere fino ad entrare in altri operatori e creando una situazione di non controllo, producendo

mRNA non desiderati e quindi proteine non necessarie. Ci deve essere una barriera alla fine e ci sono dei meccanismi di

terminazione della trascrizione, per evitare quanto detto.

Sia negli eucarioti che nei procarioti il processo deve essere regolato.

Nei procarioti ci sono due meccanismi fondamentali di arresto della trascrizione: 19

RHO DIPENDENTE

 RHO INDIPENDENTE

 MECCANISMO RHO INDIPENDENTE

E’ il meccanismo più diffuso di terminazione e segnalano uno STOP all’attività della RNApolimerasi.

Funziona attraverso la formazione di una struttura ad ansa-stelo in coda all’operone che non viene tradotta in proteina e

la struttura che può assumere ha un piccolo tratto che è complementare a sé stesso e forma un breve tratto a doppia elica

(cosa strana per quanto riguarda l’RNA) e grazie a questa complementarietà si forma. Compare anche un ansa non

appaiata.

L’appaiamento è ricco in citosina e guanina ed è seguito da un tratto ricco in uracile.

Il segnale è visto dalla RNApolimerasi come terminatore. Quando lo trova l’RNApolimerasi si stacca dal temprato di

DNA e smette di trascrivere. E’ una struttura che fa da terminatire della trascrizione.

Il meccanismo è basato sul fatto che l’uracile con l’adenina forma soltanto 2 legami a idrogeno e la struttura è

d’interazione debole fra DNA che ha fatto da temprato e RNA nascente e favorisce il distacco grazie a questa proprietà

strutturale.

Molti operoni batterici hanno un segnale alla loro estremità 3’ (RHO indipendente).

La terminazione della trascrizione può essere sfruttata per motivi di regolazione nella trascrizione genica.

Abbiamo anche visto l’ATTENUAZIONE GENICA:

L’attenuazione non e’ un controllo di tipo “tutto o nulla” come quello esercitato dal repressore trp ma permette una

regolazione piu’ fine dell’attività’ dell’operone. L’attenuazione come la terminazione si basa sulla formazione di

strutture “stem-loop”. L’attenuatore e’ una sequenza di DNA dove la RNApol fa la scelta tra terminazione o

prosecuzione della trascrizione.

In alcuni casi (come nel caso dell’operone triptofano), in caso di presenza di triptofano (nel caso in cui sia nel terreo di

cultura in cui crescono i batteri), questo operone è spento e allora se normalmente, in assenza di triptofano l’operone si

accende, quello che si è visto è che se c’è triptofano viene prodotto mRNA però è una sua struttura differente da quella

dell’mRNA prodotto rispetto a quello prodotto quando il triptofano è assente nel terreno di cultura.

Se è presente triptofano viene prodotto mRNA corto che abbraccia soltanto la regione iniziale, che comprende

operatore, promotore e una regione L (LEADER), che viene trascritta, ma non codificata per nessuna proteina

dell’operone triptofano.

C’è una piccola zona che viene trascritta anche se c’è triptofano. E tolgo triptofano dal mezzo la sequenza viene estesa e

tutto l’operone viene trascritto.

Un amento della concentrazione di triptofano, permette allo trascritto di esserci, ma si ferma prematuramente e

viceversa.

La terminazione dunque è regolata.

Ma perchè se c’è un aumento di triptofano succede questo evento?

In corrispondenza della fine della zona L c’è una struttura che è molto simile alla struttura del terminatore ed è una

struttura ad ansa e stelo simile a quella di prima.

Questo piccolo RNA contiene varie regioni che possono formare vari appaiamenti 20

Cosa succede se ci sono appaiamenti fra le rgioni 3 e 4?

C’è una struttura tipica di un terminatore (stem-loop) ed è un segnale per la RNApolimerasi di terminazione.

Se invece la regione 3 forma un appaiamento con la regione 2, la 4 è lasciata libera e il segnale non è di terminazione e

la RNApolimerasi non lo riconosce.

Cos’è che crea un’alternativa tra le due conformazioni?

La fa una struttura che è il RIBOSOMA (costituito da una subunità minore ed una maggiore) all’interno del breve

mRNA formato c’è una piccola sequenza codificante e c’è un segnale d’inizio della trascrizione che serve al Ribosomi

per capire dove deve cominciare la traduzione dell’RNA in una proteina piccola che contenga dei residui di triptofano.

C’è una certa influenza tra la presenza o l’assenza del triptofano.

Quando il triptofano è presente nel terreno di cultura ovviamente sarà facilitato la formazione di tRNA abbinata al

triptofano (poiché c’è nel terreno di cultura). I tRNA che lavorano nel ribosoma possono codificare per questa piccola

proteina e il ribosomi può transitare in queste varie regioni e impedisce l’appaiamento tra la regione 2 e la regione 3 e

favorisce l’appaiamento tra 3 e 4 con la formazione della struttura che causa la terminazione.

Se la concentrazione del triptofano è bassa, il ribosomi nel momento in cui arriva nella tripletta che dice di mettere un

amminoacido triptofano, non essendoci nel terreno di cultura, il ribosomi si blocca in questa regione 1 e lascia libera la

regione 2 che si può appaiare con la regione 3 e la formazione del segnale non è di terminazione e la trascrizione può

continuare a trascrivere e tutto l’mRNA dell’operone triptofano viene tradotto.

Quando ci sono alte concentrazioni di triptofano il ribosomi supera la regione vista e quindi facilita l’appaiamento fra 3

e 4. OPERONE TRPTOFANO (PER L’ENNESIMA VOLTA)

L’OPERONE del triptofano contiene una serie di enzimi che servono per produrre il triptofano e questa è una serie di

geni controllata dall’unico operone per la sintesi del triptofano.

Se nel terreno di cultura c’è il triptofano, i batteri non hanno necessità di produrlo e l’operone è silente poiché c’è un

repressore che lo spegne.

Tuttavia, c’è anche un’altra forma di regolazione non basata sul tutto o nulla, ma sensibile ai livelli di triptofano che il

batterio trova nel terreno di cultura sul quale deve crescere. Si parla di un’ATTENUAZIONE e l’operone triptofano in

presenza di elevate concentrazioni di triptofano, va comunque a produrre un piccolo mRNA, quindi un trascritto corto

di messaggero che non comprende tutti i geni dell’operone e termina precocemente.

E’ un mRNA che porta solo la regione “L” cosiddetta, nonché regione LEADER (vedi grafico pagina 63) –che sarebbe

la sequenza rossa-

Questa sequenza L è lunga circa 140 basi (non parlo di paia di basi perché l’mRNA è a singolo filamento). Quando il

triptofano diminuisce di concentrazione nel terreno di cultura in cui cresce il batterio in esame, si ha la produzione

dell’mRNA completo, che abbraccia tutti i geni dell’operone per la sintesi del triptofano.

Ma cosa succede di preciso tra una situazione di trascritto terminato precocemente e l’altro?

Non è un controllo a livello trascrizionale, poiché comunque è sempre trascritto. O poco o tutto comunque è trascritto.

Questa regolazione è un esempio di REGOLAZIONE POST-TRASCRIZIONALE e l’mRNA prodotto non è

funzionale, poiché non va a copiare tutti i geni dell’operone. Tuttavia la trascrizione comincia lo stesso (termina solo

precocemente).

Siccome c’è una REGOLAZIONE POST-TRASCRIZIONALE come funziona il processo?

In alcuni casi infatti c’è tutto l’mRNA, altre volte questo viene terminato precocemente (e.. daglielo… O.o).

Esiste un segnale di terminazione nella breve sequenza di RNA (zona rossa) ed è un terminatore costituito da una

struttura a STEM-LOOP (ANSA-STELO) ed è presente anche una struttura ricca in URIDINA.

Per quale motivo questo terminatore a volte funziona e a volte no? 21

Per capire per quale motivo questo terminatore si comporta in questo modo, dobbiamo fare un salto in avanti. Gli

mRNA sono definiti tali poichè al loro interno ci sono delle sequenze codificanti che vengono interpretate e tradotte dai

ribosomi.

Sono delle strutture costituite da rRNA e proteine (è un macchinario per la sintesi delle proteine). E’ ovvio che servirà

anche il tRNA.

Cosa fanno questi?

Partecipano alla sintesi delle proteine nella TRADUZIONE e i tRNA legano direttamente gli amminoacidi che

andranno a costituire la proteina. Non fanno altro che trasportare gli amminoacidi al sito in cui avverrà la sintesi. In

altre parole, possiamo dire che i tRNA vanno ad interagire con i RIBOSOMI e gli amminoacidi si allineano tra loro a

costituire la proteina. I tRNA sono carichi e trasportano gli amminoacidi.

Ma torniamo al triptofano:

Tornando al discorso che facevamo precedentemente (nel discorso dell’ATTENUAZIONE), c’è una piccola sequenza

rossa (sempre prodotta anche con basse concentrazioni di triptofano) che presenta al suo interno una sequenza

codificante che può essere riconosciuta dai ribosomi (è appunto la sequenza leader) e il ribosomi inizia a sintetizzare la

proteina codificante nella sequenza LEADER. Nei batteri c’è, abbiamo già detto, una colinearità tra trascrizione e

traduzione poiché non abbiamo una differenza tra nucleo e citosol, come invece c’è negli eucarioti. Il ribosomi si

attacca subito e l’attenuazione funziona grazie a questo.

Facciamo un esempio:

All’interno della sequenza codificante ci sono due segnali, che servono per incorporare del triptofano nella piccola

proteina codificante della sequenza LEADER (è come se ci fossero due sequenze di triptofano).

Il ribosomi si attacca alla sequenza e inizia a produrre la proteina. Ora siamo però in condizioni di bassa concentrazione

di triptofano e sono pochi i tRNA che portano il triptofano (appunto! Ce n’è poco…dove lo trovano?) e quando il

ribosoma arriva nella tripletta dell’mRNA che prevede l’incorporazione di un amminoacido triptofano, in presenza di

basse concentrazioni di questo amminoacido nel terreno di cultura, il ribosomi si blocca nella regione 1. Oltre la

sequenza codificante (dietro alla regione codificante), ci sono le regioni 2, 3 e 4, che possono fare una struttura ad

ANSA-STELO formando degli appaiamenti.

Se il ribosomi è bloccato in 1 (nel caso in cui ci sia poco triptofano nel terreno di cultura), la regione 2 e 3, che sono

complementari, sono in grado di formare un appaiamento e dare una struttura ad ANSA-STELO.

Ma la struttura non è vista come di terminazione e l’RNApolimerasi continua nella sintesi dell’RNA e quindi in

presenza di basse concentrazioni di triptofano, i geni dell’operone triptofano sono trascritto con la produzione di

triptofano.

Quando la concentrazione di triptofano è alta, sono abbondanti i tRNA del triptofano e il ribosomi può passare

transitoriamente su 1 e su 2 (e la regione 2 non può più fare una struttura a STEM-LOOP con la regione 2. Si viene

quindi a formare una struttura ad ANSA-STELO tra le regioni 3 e 4, seguito da una sequenza di URIDINA; che viene

riconosciuto come un segnale di terminazione dal ribosoma, che si blocca e termina la trascrizione.

Questo è un TERMINATORE e la RNApolimerasi smette di fare il trascritto e la molecola che si è prodotta è quella

piccola “L”, in base allo stampo di DNA.

L’alternanza tra le due situazioni è un fatto in cui il segnale di terminazione si forma solo quando c’è alta

concentrazione di triptofano nel terreno di cultura e il ribosoma può passare in queste regioni.

Quando invece la concentrazione di triptofano è bassa, il ribosoma si blocca dalla regione 1 e a questo punto 2 e 3 si

appaiano in modo ANSA-STELO, senza che vi siano sequenze di URIDINA e che per l’RNApolimerasi non ha alcun

significato e continua per la sua strada continuando a produrre mRNA.

La regolazione vista è molto fine e non è del tipo O TUTTO O NULLA (riferito all’mRNA), poiché il processo parte

sempre con un po’ di trascrizione.

Le piccole variazioni della concentrazione di triptofano fanno sì che l’mRNA possa essere terminato precocemente o

prodotto del tutto.

Questa parte della regolazione è accoppiata con la TRADUZIONE ed è basata sul fatto che nella sequenza LEADER ci

sono due segnali necessari per dare 2 amminoacidi triptofano.

Diciamo che un aumento del triptofano da un’elevata ATTENUAZIONE, mentre una bassa concentrazione di triptofano

dà una bassa attenuazione.

Il fenomeno dell’ATTENUAZIONE è un meccanismo di regolazione POST-TRASCRIZIONALE comune a diversi

operoni. Operoni che possono dare la sintesi di diversi amminoacidi come VALINA; ISOLEUCINA, ISTAMINA,

LEUCINA.

Questi operoni servono per fare produrre degli amminoacidi all’interno della cellula.

Oltre alla repressione con l’intervento di repressori c’è anche questo fenomeno di attenuazione. L’operone lac può

essere sia regolato sia con repressore o con attenuazione

TERMINAZIONE RHO DIPENDENTE DI COLI

All’interno di E.Coli c’è un altro tipo di fattore che è basato sul fattore RHO (RHO Dipendente Factor) ed è stato

scoperto studiando il fago lambda. Il fago inietta il proprio DNA nel batterio, dopo che ha colliso sulla membrana

citoplasmatica di esso. Una volta che il patrimonio genetico è entrato si va ad integrare nel cromosoma batterico

(genoma batterico). 22

Curioso è da dire che in una certa regione del genoma del fago lambda, ci sono 2 promotori che controllano

l’espressione dei geni che intervengono nella fase precoce dell’infezione. I geni sono trascritti da un promotore sinistro,

che viene detto PL e un promotore a destra che viene detto PR.

A partire da questi due promotori sono prodotti degli trascritti e, all’inizio dell’infezione sono molto piccoli e sono

terminati a livello dei siti di terminazione sempre in corrispondenza del promotore PL e PR.

Quello che succede nelle fasi tardive dell’infezione è che questa terminazione non esiste più e ci sono due trascritti a

partire da PL e PR che sono più lunghi di quelli visti prima (terminati) e non sono più terminati sempre al loro livello,

ma si hanno due mRNA lunghi.

Ma che differenza c’è tra il caso precedente (mRNA corti) e quello appena visto (mRNA lunghi)?

Per capirlo si è cercato di capire come funziona la trascrizione non solo in vivo, ma anche in vitro Si prende il DNA del

fago lambda e si cerca di effettuare una trascrizione in provetta all’esterno del batterio. In vivo, quello che succede è

che c’è una terminazione nelle fasi iniziali del ciclo vitale del fago. In vitro non c’è una TERMINAZIONE e il trascritto

è SEMPRE LUNGO e va oltre il sito di terminazione (in corrispondenza di PL e/o PR) e quindi in provetta manca un

fattore, che è invece presente nei batteri (nonché contesto naturale).

I ricercatori hanno cercato di isolare il fattore che dava la TERMINAZIONE. Questo fattore prese il nome di RHO ed è

una proteina non poco importante nel processo di TERMINAZIONE degli trascritti che si formano durante le prime fasi

dell’infezione da parte del fago lambda.

Questa proteina tuttavia è nei batteri, ma viene utilizzata dal fago per terminare precocemente i suoi trascritti dei geni,

che daranno le proteine di origine virale.

La proteina RHO interviene nei normali processi di TERMINAZIONE del trascritto nei batteri e non solo per la

terminazione del trascritto del fago lambda. Serve infatti come terminatore per la terminazione di circa il 50% della

trascrizione dei geni di E. coli. Quindi ha un ampio spettro di lavoro.

Ma come funziona più precisamente la proteina RHO e il suo processo di terminazione?

Innanzitutto diciamo che non funziona come unico monomero, ma si deve unire a formare un esamero (6 unità)

formando un grosso complesso che copre una zona compresa tra una settantina (70) e un ottantina (80) di basi sull’RNA

e si avvolge intorno ad esso.

Il fattore RHO si può muovere lungo l’RNA idrolizzando ATP (che idrolizza per spostarsi) e difatto possiede un’attività

elicasica. E’ in grado di separare ibridi DNA-RNA (prodotti nella trascrizione).

Ma come termina la trascrizione?

E’ stato proposto un modello per il funzionamento del fattore RHO, basato sulla competizione tra RHO stesso e la

RNApolimerasi all’atto della trascrizione sul filamento di DNA.

L’RNApolimerasi viaggia sul DNA copiando il templato in un filamento di mRNA.

RHO scorre sull’RNA di neosintesi . Se questo fattore riesce ad attaccarsi alla RNApolimerasi la fa staccare e quindi

termina la trascrizione.

Se l’RNApolimerasi è veloce, RHO non la raggiunge e si ha la sintesi di un messaggero di RNA.

Se l’RNApolimerasi incontra dei segnali sul DNA e rallenta la sua attività, viene raggiunta dal fattore RHO esamerico,

che ne stimola il distacco dal DNA.

C’è quindi una VELOCITA’ DIFFERENZIALE tra le due attività enzimatiche. Il rallentamento della polimerasi è un

fattore importante per avere la terminazione RHO dipendente.

Torniamo alla Romagnoli:

Cosa c’è di importante nella CODA CON POLIURIDINE?

Se si modificano i siti terminatori, si è visto che la forcina e la coda di poliuridina non sono indispensabili, ma rendono

più efficiente la terminazione. Più che altro è la pausa che la RNA polimerasi ad essere indispensabile. La polimerasi

alla fine dello stampo da trascrivere si ferma comunque, ma se c’è il terminatore si ferma più efficacemente.

Si sono fatti degli esperimenti con un frammento di DNA contenente 2 siti terminatori e se si aggiungeva la RNA

polimerasi, se si mutavano i due siti terminatori e se si rimuoveva un EMISITO, ovvero metà della palindrome del sito

terminatore, non si poteva più formare la struttura a forcina.

Allora lo stampo presenta la sequenza genica con due siti terminatori deleti entrambi per metà (TR2 e T82) ed è

riportata la sequenza dei terminatori deleti per metà e la palindrome non ha più basi complementari e non si forma più

completamente.

Quello che si osservava era la formazione di tre trascritti di lunghezza diversa. Ecco perché abbiamo detto che se c’è la

sequenza del terminatore completa il processo di terminazione è più efficiente, perché otterrei un trascritto di una sola

lunghezza.

Se, ora, aggiungessi alla miscela di trascrizione una palindrome che mima il terminatore, si verificherebbe una

terminazione più marcata e si potrebbe appaiare con l’emipalindrome rimasta sullo stampo.

L’RNA polimerasi trascrive e se aggiungo i ribonucleotidi la RNA polimerasi continua a trascrivere, avvicinandosi al

sito di terminatore ricostituito, qualora questo riesca a riconoscere le basi complementari per riformare la struttura a

forcina. A questo punto la RNA polimerasi smette di trascrivere in modo efficace.

Abbiamo dedotto che la struttura a forcina non è fondamentale.

Sono stati proposti due meccanismi alternativi per capire come avviene la fine della trascrizione. 23

1) TRASLOCAZIONE IN AVANTI: Dopo la formazione della struttura a forcina con la coda di poliuridine, la

RNA polimerasi si ferma sullo stampo e senza fare più trascritto si muove in avanti. La CORE POLIMERASI

si sposta sullo stampo ma non lo trascrive.

2) MODIFICAZIONE ALLOSTERICA DELL’RNA POLIMERASI: ci deve essere una incursione della

forcina nell’RNA polimerasi e detta promuoverebbe un cambiamento conformazione tale per cui l’enzima

cesserebbe la fase di trascrizione. Meglio definito è il modello della terminazione RHO

DIPENDENTE e coinvolge la proteina RHO.

L’esamero di proteine RHO forma un anello che rincorre

la RNA polimerasi nel MODELLO

DELL’INSEGUIMENTO.

La proteina RHO viene caricata a 70 nucleotidi a monte

del sito di terminazione, si forma la forcina e la RNA

polimerasi rallenta e la RHO esamero può raggiungerla e

ne promuove il distacco del trascritto.

La proteina RHO ha la funzione di elicasi e la funzione

ATPasica RNA dipendenteper muoversi sul trascritto.

La RNA polimerasi fa una pausa di microsecondi e la

proteina RHO precedentemente caricata sul trascritto

nascente raggiunge la polimerasi e ne promuove il

distacco.

Il sito in cui viene si lega RHO è il LOADING SITE e la

polimerasi fa una pausa poiché c’è la formazione di una

forcina di pausa (che non è quella di terminazione) sul

trascritto. La forcina sul trascritto si forma a prescindere

dalla presenza di RHO, ma siccome RHO è presente,

questa riesce a raggiungere l’enzima e a promuovere il

distacco dallo stampo.

MECCANISMI DI ATTIVAZIONE DELLA TRASCRIZIONE

Come interagiscono le proteine con i promotori?

Da ricordare che per avere una regolazione della trascrizione, i promotori devono essere deboli e non costituitivi, infatti

se tutti i promotori fossero forti con sequenze consenso per la RNA polimerasi altamente conservata sarebbero un

disastro per la cellula, perché la conseguenza starebbe nel fatto che quel gene sarebbe sempre acceso.

Ma se abbiamo un promotore con elementi consenso deboli, la presenza di attivatori della trascrizione o repressori, fa sì

che, a seconda della modalità di crescita, i promotori stessi possano essere modulati.

Il meccanismo per attivatore o reprimere dipende da attivatori e/o repressori.

Viene reclutata la RNA polimerasi sul promotore genico e si ha la formazione del complesso chiuso. Quindi segue

l’isomerizzazione verso il complesso aperto.

I regolatori della trascrizione spesso sono dei dimeri e questo fa sì che possano essere riconosciuti da sequenze

palindromiche, cosicché la simmetria della proteina si rifletta sulla simmetria del DNA. Sono proteine allosteriche e

sono in grado di legare effettori fisicamente, modificandone la conformazione e permettendo che il loro legame al DNA

sia facilitato.

CRP o CAP (cAMP Receptor Proteine o Catabolite Activator Protein) è responsabile della CATABOLITE

EXPRESSION, fondamentale per l’operone lac. Il glucosio in E.coli è la fonte prediletta di energia, poiché è un’ottima

fonte di carboni e di energia. La presenza del glucosio reprime dei geni per l’espressione di una fonte alternativa di

energia e carboni. In particolar modo si ricordi l’operone ara, l’operone gal e l’operone lac.

C’è il trasporto nella cellula del glucosio mediante un sistema detto PTS (Phosphoenolpiruvato Transfert System) ed è

costituito da proteine; da ricordare:

1. PROTEINA 2A: Quando da essa è rimosso il gruppo fosfato si attiva e va fosforilare il glucosio o altri

zuccerhi e fa sì che il sistema PTS (un complesso tetramerico) internalizzi il glucosio e blocchi la traduzione

del lattorio e il promotore dell’operone gal resta represso.

2. Al contrario, se 2A resta fosforilato,si favorisce dell’adenilatociclasi e si produce il cAMP. Allora c’è un

meccanismo antagonista tra cAMP e Glucosio. Se aumenta la concentrazione del cAMP significa che c’è poco

glucosio, se il cAMP e basso o nulla presenza, significa che c’è glucosio nella cellula. Si tratta di un sistema a

feedback.

Vediamo gli appunti del prof Zappavigna a riguardo.

CONTROLLO DELL’ESPRESSIONE GENICA NEI PROCARIOTI 24

Abbiamo detto che il passaggio dell’informazione genetica va dal DNA all’RNA e quindi si porta in una proteina, intesa

come il prodotto finale del processo di TRASCRIZIONE che vede, appunto, il passaggio dell’informazione genetica.

La molecola di mRNA è una molecola, che potremmo definire intermedia.

Si parla di espressione genica, poiché un gene viene espresso come una proteina attraverso la formazione di una

molecola intermedia di RNA messaggero, copia con sequenze complementari (UACG) a quelle del DNA (ATGC).

Ovviamente un processo così importante DEVE essere controllato.

Si tenga presente che in una cellula umana ci sono circa dai 30.000 ai 40.000 geni e questi non sono mai espressi

completamente. Sono geni la cui attività è controllata in riposta alle necessità della cellula o dell’organismo, e questi

geni, vengono chiamati: GENI REGOLATI.

Un organismo possiede anche un gran numero di geni i cui prodotti sono essenziali per il normale funzionamento della

crescita della cellula e della divisione, quali che siano le condizioni in cui vive. Questi geni sono sempre attivi nelle

cellule in crescita e sono detti geni costitutivi (housekeeping genes); ricordiamo per esempio quei geni che codificano

per enzimi necessari alla sintesi proteica e per il metabolismo del glucosio.

Tutti i geni però sono regolati a qualche livello. Se, per esempio, l’ambiente improvvisamente diviene inadatto per un

normale funzionamento della cellula, l’espressione di tutti i geni, inclusi quelli costitutivi sarà ridotta da meccanismi di

regolazione. Quindi la distinzione tra geni regolati e costitutivi, sarà ridotta da meccanismi di regolazione. Quindi la

distinzione tra geni regolati e costitutivi è, in qualche misura, arbitraria.

Se i 30.000-40.000 geni di una cellula fossero espressi contemporaneamente si avrebbe un grande caos all’interno della

cellula, per questo motivo è bene capire il processo di espressione genica a partire da una sequenza di DNA.

I geni che ci sono nel genoma non sono sempre trascritti con copia di mRNA e possono essere accesi o spenti (trascritti

o non trascritti).

Come dicevo precedentemente, ci sono molti livello per regolare l’espressone di un gene e il primo livello è il controllo

della trascrizione, ma ce ne sono ovviamente altri a valle di questo, e l’espressione di un gene può essere controllata

anche nella proteina, vale a dire nel prodotto finale dell’espressione genica. Ecco perché si dice che il GENOMA è

costante, al contrario del TRASCRITTOMA.

Ma cos’è il genoma e cos’è il trascrittoma?

Il genoma è l’insieme dei geni di un organismo. Il TRASCRITTOMA è il pull dei geni che sono trascritti in una data

cellula e può variare nelle diverse cellule. Per esempio, una cellula nervosa produce proteine diverse da una cellula

muscolare.

Com’è possibile ottenere una regolazione nella trascrizione differenziale, per quanto riguarda l’espressione

genica?

Ci avvaliamo del solito E. coli ed è un batterio con una parete esterna di origine molto complessa, avvolta quindi dalla

membrana plasmatica e, come tutti i procarioti, non ha un nucleo e il depositario dell’informazione genetica si trova

all’interno del citoplasma connessa alla membrana plasmatica.

E’ stato scoperto che operone lac è controllato anche in maniera positiva e non solo negativamente (infatti, ben

ricorderemo che in assenza del repressore è attivo).

C’è la regolazione positiva dell’operone.

Ma cosa vuol dire quanto appena enunciato?

L’operone è attivato da un attivatore e non solo dall’assenza del repressore ed è in base a cosa succede in

corrispondenza dell’operone lac quando c’è glucosio. Abbiamo già detto che il glucosio è lo zucchero di gran lunga

preferito dai batteri. Se c’è nel terreno di cultura, i batteri prediligono di gran lunga il glucosio ( e quindi consumano

prima questo), terminato il glucosio, se eventualmente sono presenti altri zuccheri, iniziano a metabolizzare anche gli

altri. Ma se è presente lattosio e glucosio, i batteri danno assoluta preferenza al lattosio.

Ma cosa succede quando le concentrazioni di glucosio nel terreno di cultura calano?

Quello che avviene all’interno della cellula batterica è una sorta di allarme, nonché un segnale intracellulare, che si

attiva in seguito all’abbassamento delle concentrazioni di glucosio. Il segnale è dato da AMP ciclico (cAMP).

Il glucosio fosforilato forma un legame fosfodiestereo con un altro atomo di carbonio, che fa parte del cAMP (o

ADENILATOCICLASI CICLICO).

Quindi all’interno della cellula aumenta la concentrazione di cAMP ed è un segnale che dice che esternamente alla

cellula, la quantità di glucosio si è abbassata.

Ma cosa succede alla β-galattosidasi (enzima codificato dal lac Z dell’operone lac)?

Aumenta il livello di questo enzima.

Sembra un controllo che non passa per il controllo del repressore, ma passa direttamente attraverso il segnale e i

ricercatori anno cercato di capire chi fa il segnale e chi è in grado di leggerlo.

Questo tipo di studio è stato associato alla genetica, inducendo delle mutazioni per generare il segnale o fare interpretare

questo segnale. Di queste mutazioni ne sono state trovate di due fondamentali tipologie:

MUTAZIONI A CARICO DELL’ADENILATOCICLASI: nonché l’enzima che genera il messaggio in

 conseguenza della scarsità di glucosio.

 MUTAZIONI CHE CADONO IN CORRISPONDENZA DEL GENE CHE PRODUCE LA PROTEINA CRP

O (sinonimo) CAP. Questi due acronimi inglesi o americani sono l’equivalente per esteso di “cAMP Receptor

(

Protein” o in italiano “Proteina Recettrice del cAMP”) e la seconda equivale a Catabolite Activator Protein.

25

Questa proteina fa da recettore del cAMP, che si lega ad esso e la proteina CAO (o CRP) è in grado di interpretare il

segnale).

Queste due mutazioni non solo influiscono sull’operone lac, ma su una serie di operoni che servono per metabolizzare

zuccheri ed è un meccanismi trasversale per diversi zuccheri; è un segnale generale quello dato dall’adenilatociclasi

ciclico.

La proteina CAP è in grado di agire su molti operoni. Con la DNAasi potevamo vedere il FOOTPRINTING in

corrispondenza dell’operone e del promotore. FUNZIONI DALLA CAP

La RNA polimerasi lega il DNA in una regione che abbraccia molto il promotore e l’operatore (si veda la figura).

Questa proteina CAP ha un’impronta adiacente a dove la RNA polimerasi lega l’operone e questo è il punto di attacco,

presente a monte di dove la RNA polimerasi si attacca.

Ma cosa fa la proteina CAP sul contesto dell’operone lac?

Ebbene , ci sono tre situazioni diverse se consideriamo il glucosio nel nostro sistema.

PRENSENZA DI GLUCOSIO MA ASSENZA DI LATTOSIO: il repressore è funzionante, si lega al DNA e

 blocca l’operone lac.

Cosa succede con la proteina CAP che lega il cAMP?

Siamo in condizioni in cui ci sono alte concentrazioni di glucosio e la CAP in condizione di assenza di cAMP

non è in grado di legarsi al DNA (poiché c’è tanto glucosio)

DIMINUISCE LA PRESENZA DI GLUCOSIO E AUMENTA QUELLA DI LATTOSIO: CIRCA STESSA

 QUANTITA’: il lattosio può legarsi al repressore lac e ne causa il distacco dall’operone lac (del repressore).

Cosa succede però?

Si attiva un po’ d trascrizione e un po’ di mRNA viene prodotto (una piccola quantità), poiché non c’è più il

repressore e la RNA polimerasi può agire. Però non è prodotta a livello massimo, ma minimo (intende la

trascrizione dell’operone lac).

ASSENZA O QUASI ASSENZA DEL GLUCOSIO E AUMENTO O SOLO PRESENZA DI LATTOSIO:

 La trascrizione dell’operone lac è più potente rispetto a prima.

Cosa accade?

A causa della scarsità di glucosio, si è attivato l’adenilatociclasi ciclico e ha legato la proteina CAP. Questa

proteina, la quale è legata al cAMP, può ora legarsi al DNA dell’operone lac stabilmente e stimola l’azione

della RNA polimerasi, nonché il processo di trascrizione.

Possiamo dire che abbiamo un doppio controllo:

POSITIVO: CHE STIMOLA LA TRASCRIZIONE

NEGATIVO: BASATO SULLE CONCENTRAZIONI DI LATTOSIO. 26

La cellula per funzionare metabolizza glucosio, poiché quando è presente l’operone lac non funziona tanto bene,

quando il livello di glucosio scende, si ha la produzione dei 3 enzimi dell’operone e il batterio può cominciare a

metabolizzare lattosio con i 3 enzimi prodotti dalla trascrizione dell’operone lac.

Diciamo che un’elevata quantità di glucosio fa sì che vi sia una bassa quantità di cAMP e di β-galattosidasi, ma una

bassa quantità di glucosio fa sì che vi sia un’elevata quantità di cAMP e un aumento di β-galattosidasi.

Ma come fa la proteina ad attivare la trascrizione?

Il meccanismo di trascrizione da parte del repressore è complicato.

La proteina CAP legata al cAMP, è in grado di legarsi al DNA e può facilitare l’aggancio della RNA polimerasi sul

Promotore e quindi c’è un certo effetto cooperatore e viene quindi favorito il legame contemporaneo di queste due

proteine sul DNA. L’una favorisce il legame sull’altro, ecco cos’è quell’effetto coopertaivo di cui parlavo.

Questo processo avviene sia nei procarioti, ma anche negli EUCARIOTI. Questo è uno dei meccanismi tipici attraverso

cui si ha lo stimolo della trascrizione.

Il CAP ha un ruolo nel processo di trascrizione ed è un FATTORE DI TRASCRIZIONE che favorisce la produzione di

mRNA da parte della RNApolimerasi, che si attacca stabilmente sul filamento di DNA per cominciare la trascrizione.

STRUTTURA DELLA PROTEINA CAP

Così come faceva il repressore, la CAP non lega il DNA a molecola singola, ma si unisce in forma dimerica, con due

CAP che legano il DNA.

Quando abbiamo parlato della RNApolimerasi e delle sue subunità abbiamo parlato della subunità sigma (σ).

La sua funzione era quella di permettere alla RNApolimerasi di legare il DNA e collocarsi sul promotore, poiché la

subunità σ è in grado di riconoscere i siti che si trovano a -10 e a -35.

La peculiarità è che molti fattori sigma sono controllati da una serie di fattori di trascrizione (come CAP) i quali legano

il dna in prossimità del punto di attacco dell' RNA polimerasi al dna stesso. Ne consegue che i fattori di trascrizione

siano in grado di stimolare o comunque di agire sull’attività dell'RNA polimerasi

Torniamo alla Romagnoli:

il cAMP viene formato dall’ADENILATOCICLASI, partendo da ATP e a partire da fosfati, forma il legame

fosfodiesterei 5’-3’ dello zucchero.

cAMP va ad attivare il fattore di trascrizione CAP, una proteina attivatrice dei cataboliti o recettore del cAMP.

Gli effetti di CAP su particolari bersagli genici, possono essere studiati dalla funzione di Betagalattosidasi, che viene

prodotta quando l’operone lac è attivo.

Allora, se si andava a mettere CAP in un estratto di E.coli, si vedeva che l’attività della Beta galattosidasi aumentava.

Se, al contrario, non andavo a mettere CAP in un estratto batterico di E.coli, non si osservava l’aumento dell’attività

della Beta galattosidasi, che restava bassa.

Questo meccanismo fu identificato da un gruppo di ricerca. Più o meno contemporaneamente, un altro gruppo di ricerca

hanno trovato CAP come proteina in grado di legare il cAMP.

Effettuando diversi studi genetici sul gene lac, si è visto che diverse mutazioni, mappanti nell’operone lac, abolivano

l’effetto di CAP (l’effetto di CAP è di legare il cAMP) e si è pensato che CAP si leghi sul promotore dell’operone lac.

Allora hanno identificato il sito di legame di CAP sul promotore lac e si è visto che può legarsi, inoltre, ad altri 100

promotori di diversi geni.

Allora come fa ad attivare il processo di trascrizione? 27

Ho il promotore del gene lac (supponiamo), forniamo la RNA polimerasi OLOENZIMA in vitro e la facciamo legare al

promotore dell’operone lac. Aggiungiamo la RIFAMPICINA e i RIBONUCLEOTIDI e non vedo la formazione del

trascritto (la trascrizione non ha inizio). Effettivamente, la presenza di RIFAMPICINA blocca la reazione di

trascrizione.

Se invece con la RNA polimerasi aggiungessimo CAP e cAMP, vedrei che, in seguito all’aggiunta di nucleotidi e

RIFAMPICINA, avrei il trascritto.

Per quale motivo?

Perché la presenza di CAP legata a monte del promotore, stimola il complesso aperto da parte della RNA polimerasi.

Allora, se metto assieme la proteina CAP e la RNA polimerasi, che possono unirsi entrambe al promotore, si osserva la

formazione del complesso aperto in modo molto veloce e stericamente i nucleotidi raggiungono il sito attivo (già

competente) alla fase della trascrizione e, anche se c’è RIFAMPICINA in soluzione, il suo arrivo sul complesso aperto

è lento e la trascrizione non viene inibita. Praticamente è stata stimolata la formazione del complesso aperto prima che

potesse impedirlo la RIFAMPICINA; tutto dovuto alla velocità che hanno i nucleotidi di entrare nel sito attivo e,

soprattutto, alla capacità che ha CAP (legata a cAMP) di attivare efficacemente la trascrizione.

Allora CAP può interagire con la RNA polimerasi nel corso della trascrizione e recluta la RNA polimerasi sul

promotore e, inoltre, può avere l’attività di BENDING e rappresenta il vantaggio di posizionare la RNA polimerasi in

modo ottimale rispetto alle sue sequenze consenso.

Allora la proteina CAP aumenta l’efficienza di trascrizione con il reclutamento dell’RNA polimerasi.

Reclutando la RNA polimerasi sul promotore, viene ottimizzata la transizione da complesso chiuso a complesso aperto.

CAP influenza la Ka della RNA polimerasi (valore di completa associazione) e la isomerizzazione da complesso chiuso

a complesso aperto (Kf).

In presenza di cAMP, l’RNA polimerasi e la CAP sedimentano e possono essere cross-linkate sul promotore (dal

momento che precipitano assieme alla sequenza promotoriale cui sono strettamente a contatto) e possono essere cross-

linkate sul promotore.

Se consideriamo il footprinting, si vedrebbe che il legame di CAP e della RNA polimerasi è adiacente (lievemente

sovrapposto) affinché non siano antagonisti l’uno dell’altra.

Se si mutasse la regione AR1 di CAP, si vedrebbe un abbassamento dell’attivazione della trascrizione, ma non

cambierebbe l’affinità di CAP per il suo sito di legame; allora CAP comunque lega il DNA ma non attiva la trascrizione

(dal momento che le proteine sono modulari con domini diversi).

Facendo studi di mutagenesi si è visto che regioni della RNA polimerasi che legano AR1 (regione di CAP) mappano

nella coda carbossi terminale della subunità ALFA.

Allora hanno mappato le regioni della proteina che legano AR1 di CAP e la coda carbossi terminale della subunità alfa.

Si è considerato l’effetto della proteina CAP su altri promotori:

PROMOTORE P per il gene B codificante per l’RNA ribosomiale di coli (rrnB P1) sensibile alla presenza di CAP e un

PROMOTORE INSENSBILE alla presenza di CAP.

Si è preso in considerazione l’rrnB P1 e il promotore lac UV5 mutato che non risponde più alla proteina CAP.

Si vede l’effetto combinato della proteina CAP e della mutazione a livello della coda carbossi terminale della subunità

alfa (che dovrebbe interagire con l’estremità amino-terminale dei fattori di trascrizione, tra cui anche CAP).

In assenza di CAP (in condizioni WT) e senza cAMP, l’attivazione del promotore assume un valore 46. Se considero

presenza di cAMP , posso vedere un aumento dei valori a 625.

Se invece facciamo lo stesso mettendo RNA polimerasi, che ha deleto parte della coda carbossi terminale, vediamo

come l’attivazione non ha più luogo. Allora il bersaglio di CAP e la coda carbossi terminale della subunità alfa.

CAP + cAMP + coda carbossi terminale della subunità alfa concorrono alla forte attivazione del promotore P1 WT.

Questo effetto non c’è se proviamo l’esperimento con il promotore lac UV, che è insensibile a CAP e resta comunque

alta la trascrizione (sia che ci sia CAP, sia che non ci sia, sia che ci siano delle delezioni sulla coda carbossi terminale

della subunità alfa).

Allora, se consideriamo che un dimero di CAP si lega su un sito attivatore ed interagisce fisicamente con la coda della

subunità alfa, capiamo che c’è un legame forte tra RNA polimerasi e il promotore, e un legame forte tra CAP ed RNA

polimerasi.

Si vede il sito attivatore dove si lega CAP, a monte della sequenza a -35. Anche se CAP riconosce tre tipi differenti di

siti di riconoscimento. Il pentamero TGTGA può essere all’interno di sequenze consenso più o meno conservate (per il

legame di CAP), ma esso c’è sempre. Ciò che può cambiare è la posizione del pentamero nella sequenza consenso.

Possiamo definire i tre siti di riconoscimento con tre nomi diversi:

• TIPO I: dove TGTGA è a -61 (a monte del promotore)

• TIPO II: il sito di legame è parzialmente sovrapposto alla sequenza promotoriale. Infatti si trova a -41, molto

vicino alla sequenza promotoriale.

• TIPO III: presenta il sito di legame per CAP distale dal promotore e mappano a livello della base in posizione

-92.

Nel caso del promotore dell’operone lac troviamo un sito di riconoscimento di TIPO I.

Nel caso del promotore P1 dell’operone gal, troviamo un sito di riconoscimento per CAP di TIPO II.

Nel caso del promotore P1 dell’operone ara, troviamo un sito di riconoscimento per CAP di TIPO III. 28

Si vede la struttura risolta di CAP,

complessato al DNA e l’sempio si riferisce

a promotori di classe I e vedo un dimero di

CAP e in rosso c’è il sito di legame del

cAMP e sono evidenziate le diverse

regioni attivatici di CAP:

AR1 interagisce con la coda carbossi

terminale della subunità alfa della RNA

polimerasi (nella porzione C terminale di

CAP vicino al dominio H+H, ma non ha

acun effetto sull’interazione della proteina

e del DNA.

La regione AR2 non influenza il legame

della proteina al DNA, ma compromette il

legame di CAP con la porzione

amminoterminale della subunità alfa e

allora, anche questa regione è in stretto

contatto con la RNApolimerasi.

La regione AR3, contatta

elettrostaticamente con il DNA e se si

mutagenizza una lisina (K) in questa regione e si mette un altro amminoacido (o carico negativamente o neutro),

aumenta il legame elettrostatico tra DNA e proteina. Questo succede dal momento che viene modificata la

conformazione della proteina, poiché non è un solo residuo che interagisce con il DNA.

Ogni cAMP lega un monomero di CAP, ma due molecole di CAP legate a due molecole di cAMP si legano al DNA.

La simmetria delle molecole che devono legare il DNA, riflette la simmetria delle sequenze palindromiche del DNA.

Il contatto tra RNA polimerasi e CAP è asimettrico.

CAP riconosce la sequenza sul DNA, ma AR1mutata non va ad interferire con il legame. E’ adiacente al motivo elica-

turn-elica. Se ci fossero delle mutazioni nella regione AR1 di CAP, la proteina si legherebbe bene sul promotore, ma

essa non interagirebbe bene con la subunità alfa della RNBA polimerasi.

PEZZO MANCANTE JULY????

Il sito di legame al DNA è, infatti, elica-curva-elica e i residui che formano la regione AR1 sono fuori da questa

struttura.

La regione AR1 mutata, influenza il legame con la polimerasi.

La regione AR3 mutata è una mutazione non nativa, poiché viene creata artificialmente. 29

Da ricordare che il legame di CAP al promotore fa curvare il DNA.

Di contro, CAP attiva P ara legando un sito distale.

Il legame di CAP-cAMP induce un bending nel DNA (anche in lac)

Il ripiegamento del DNA permette un legame cooperativo.

L’anello che si crea viene chiamato anche LOOPING o LARIATO e deve avere un legame cooperativo della proteina

sul DNA e suoi siti di legame devono essere sulla stessa faccia del DNA, perché se introducessi 5 basi

(ingegnerizzando), avrei una curvatura della proteina e verrebbe sfasato il sito di legame.

Se mettessi 10 o 20 basi, i siti di legame sarebbero “in registro” e sempre sulla stessa faccia del DNA e ci sarebbe un

legame cooperativo proteina-DNA.

Ma come hanno capito che CAP, legandosi sul DNA, può indurre il bending?

Ovviamente sono ricorsi a tecniche elettroforetiche adoperando il complesso DNA e proteine.

Si prende un frammento che contenga all’interno un sito di legame per CAP e all’interno ci sono 4 siti di taglio per 4

enzimi di restrizione diversi.

Se tagliassi questo frammento di DNA 4 volte, ogni volta con un solo enzima di restrizione, otterrei 4 combinazioni

diversi, ma tutti con lo stesso peso molecolare.

Se aggiungessi delle proteine, il profilo di mobilità elettroforetica sarebbe diverso completamente per le varie

combinazioni.

Ciò che cambia nei diversi 4 frammenti è la posizione di legame per le 2 proteine CAP. Se taglio con l’enzima di

restrizione 3, si forma un frammento lineare sul quale non si può più legare la proteina. Si tenga in considerazione che

nel frammento azzurro nell’immagine (con la sequenza rossa al centro), i quattro enzimi di restrizione (1,2,3 , 4 e 1)

tagliano in questo ordine a partire da sinistra. Ora se andassi a tagliare con l’enzima di restrizione 3, esso taglia al centro

della sequenza che dovrebbero riconoscere le 2 proteine CAP. 30

Se andassimo a tagliare con gli enzimi di restrizione 2 o 4, il sito di legame per le 2 CAP, si troverebbe alle estremità

(estremità di sinistra se taglio con 2 o estremità di destra se taglio con 4).

Se andassi a tagliare con l’enzima 1, il frammento sarebbe più ritardato negli altri nel saggio di mobilità elettroforetica,

poiché il legame della proteina sul bersaglio è fisiologico e la proteina legata lo ritarda.

Se io tagliassi con l’enzima 3, il frammento correrebbe più velocemente, perché la proteina CAP non si lega più..

Se ora andassi a misurare le distanze e facessi un’analisi degli angoli di individuazione sulla corsa in gel, vedrei che

CAP aggiunge, nel sito del DNA dove si lega, una curvatura di 90°.

Questo effetto lo vediamo nella struttura a raggi X di CAP per il suo legame sul DNA.

CRISTALLOGRAFIA A RAGGI X CAP-cAMP e DNA

Sostituzione del sito di legame di CAP con un DNA naturalmente

piegato attiva la trascrizione di lac 10 volte.

Quindi, bending e CAP attiverebbero l’RNAP sia

aumentando il legame con il P, sia posizionandola correttamente

per l’inizio della trascrizione.

Questo effetto di curvatura del promotore in vivo, determinato dal

legame di CAP, posso rifarlo in vivo sostituendo questo

frammento di DNA per il legame di CAP con un DNA

naturalmente piegato, in grado di attivare la trascrizione di lac 10

volte. Quindi il bending e CAP attiverebbero la RNA polimerasi

sia aumentando il legame con il fosfato sia posizionandola

correttamente per l’inizio della trascrizione.

Allora vediamo indirettamente l’effetto della proteina CAP sul

DNA, ovvero che aumenta la trascrizione. Ma io voglio studiare

l’effetto della curvatura.

CAP interagisce sia con l’RNApolimerasi, favorendo la

transizione a complesso aperto e come conseguenza del bending,

si vede che la CAP è in grado di posizionare correttamente la

RNA polimerasi in base al sito d’inizio della trascrizione.

Quanto appena detto della posizionatura, lo si vede quando si

considera il REGULONE mal (maltosio).

Un regalone rappresenta un insieme di geni inter-dispersi nel

genoma e regolati in maniera analoga dallo stesso regolatore

(regolati in maniera coordinata).

Appunto noi vediamo l’esempio applicato al regalone per il

metabolismo del maltosio.

Abbiamo MalT (regolatore T), che è in grado di cambiare

conformazione quando il trioso maltosio lo attiva (MalT è un regolatore allosterico). MalT richiede ATP e l’induttore

maltotriosio.

I promotori in questione sono malE e malK e richiedono CAP e MalT per essere attivati.

Altri promotori, pulA, pulC e malP, richiedono solo MalT.

Al contrario, Il promotore di malT, richiede solo CAP.

CAP ha un effetto indiretto sulla trascrizione del regalone, poiché attiva MalT.

Vedo che in alcuni casi, CAP e MalT sono necessari e in altri caso c’è il solo bisogno di MalT.

Considerando il promotore malE e malK, essi sono su una regione del DNA di 500 paia di basi, ma sono divergenti,

perché il gene per malK e il suo promotore viene trascritto verso destra. Il gene per malE e il suo promotore sono

trascritti, invece, verso sinistra. C’è una regione intergenica di 370 paia di basi che ospita 8 diverse sequenze bersaglio,

di cui 5 sono siti di legame per MalT e 3 sono siti di legame per CAP.

Se prendo, ad esempio, l’attività del promotore del gene malK, in un contesto WT, si ha un’attività trascrizionale di

MalK di 285, se invece considero il contesto deleto, l’attività trascrizionale scende a 2 per MalK.

Quando poi si è andati a vedere bene il promotore di MalK, si è visto che ci sono 3 siti di legame sfalsati.

Hanno fatto il footprinting e si è visto che le regioni protette si spostano di tre basi. Facendo degli esperimenti di DMS

footprinting sul promotore di MalK, si è visto che le regioni protette da questa proteina si spostavano di 3 paia di basi a

seconda che ci fosse o meno CAP.

Insomma, si vede come la presenza di CAP con cAMP sposta la regione protetta da MalT di 3 paia di basi e si vede

come questo effetto influenza la trascrizione.

Questo perché CAP, spostando di 32 paia di basi il sito di legame per MalT sul promotore, posiziona meglio la RNA

polimerasi sul DNA rispetto al sito d’inizio (+1) e l’effetto finale di trascrizione è forte, dal momento che si ha

un’interazione forte delle tre proteine. 31

CAP riposiziona MalT sui siti di legame per attivare la trascrizione dei promotori divergenti malE e malK

OPERONE ARA

Il fattore di trascrizione AraC, controlla la trascrizione dell’operone ara.

Il legame della proteine regolatoria AraC sui due siti sulla stessa faccia del DNA, favorisce il ripiegamento della

regione di DNA interposta ai siti di legame.

Se sono distanziati di 250 paia di basi, il legame della proteina fa sì che le due sequenze consenso riconosciute si

avvicinino.

Se andassi ad introdurre per mutagenesi mezzo giro d’elica, un sito di legame per AraC si ritroverebbe sulla faccia

opposta del DNA e in mezzo il DNA non potrebbe ripiegarsi, poiché c’è una costrizione sterica della proteina sul DNA.

Allora, abbiamo un promotore che regola l’espressione di AraC.

Anche in questo caso abbiamo due promotori divergenti:

PROMOTORE che controlla l’espressione di AraC, che controlla la trascrizione della proteina (controlla la

 propria espressione, come i geni dell’operone bad) 32

PROMOTORE dell’operone bad (Pbad).

Inoltre ci sono anche dei siti di legame per CAP.

Il primo dei due promotori detti ponanzi, è il promotore per l’espressione di AraC. E’ un operone complesso che ha tre

diversi promotori che possono essere legati dalla proteina AraC e un sito di legame per CAP.

Sono stati mappati i promotori. Il promotore AraO2, mappa a -280 paia di basi a monte del promotore P1 dell’operone

bad.

ARAO1 mppa a -130 paia di basi e ARA I a -57 paia di basi.

La proteina AraC è una proteina allostericache, a differenza di CAp, lega il proprio sito anche senza ARABINOSIO e

AraC, forma un LOOP di repressione sul promotore di Pbad attraverso l’emisito I1 e l’operone O2 (quello che viene

definito NUCLEO DI REPRESSIONE).

Se aggiungessi ARABINOSIO il LOOP di repressione viene rotto e AraC organizza il proprio legame sul promotore,

occupando soltanto il sito araI (1 e 2). Ciò favorisce il legame della RNA polimerasi e può avvenire la trascrizione.

EVIDENZE SPERIMENTALI CHE HANNO PERMESSO DI VEDERE QUESTI MECCANISMI

COMPLESSI

Hanno usato un MINICIRCOLO e ho un piccolo DNA circolare ( 85 paia di basi, dove c’è all’interno l’operatore O2 e

l’operatore I complesso.

Devo fare un’analisi sia nel contesto WT che in quello mutato per studiare gli effetti sulla proteina AraC mutando i due

operatori.

Se aggiungo AraC al MINICIRCOLO, senza ARABINOSIO, ho un LOOP sul DNA supercoiled per cui il complesso

DNA-proteine migra più velocemente nel gel.

Si osserva che c’è una lent5a dissociazione delle proteine dal MINICIRCOLO se il contesto è WT. Il LOOP che si

forma è stabile (il loop si forma in seguito, ovviamente, al legame della proteina AraC).

Se, invece, andessi a correre il MINICIRCOLO senza proteine (senza AraC), non avrei il loop e avrei un certo peso

molecolare.

Se aggiungessi la proteina AraC e corressi i miei campioni complessati a proteine in tempi diversi, vedrei delle bande

che corrono nel DNA più velocemente ed è stabile. Dopo un ora e mezza (90’) dall’aggiunta di AraC si vede ancora la

proteina legata al DNA, poiché le bande che corrispondono al MINICIRCOLO LOOP, rispetto al non LOOP sono più o

meno in equilibrio e la costante di dissociazione di questi legami è di circa 90’.

Ho il DNA circolare che entra nel gel e ha il profilo di migrazione che porta il DNA ad un certo livello. Se aggiungessi

la proteina, si formerebbe il loop.

Se al superavvolgimento del DNA aggiungessi un LOOP in più, avrei che una molecola di DNA si restringerebbe e

potrebbe correre più velocemente (poiché la proteina introduce un loop). 33

Allora correndo a tempi diversi, posso comprendere la stabilità dell’associazione.

Tutto questo in un contesto WT. Se considerassi dei contesti MUTATI, e andassi a mutare le sequenze degli operatori I

(I1 e I2) e O2, vedrei che la dissociazione tra DNA e proteine è più veloce, poiché il DNA che corrisponde all’anello

scompare e il legame della proteina è instabile e se ne va in fretta e vedo la banda del DNA non inanellato.

Allora le sequenze mutanti per l’operatore O2 e I1 hanno un effetto sul legame con la proteina AraC e capisco che le

sequenze sono coinvolte con il legame per essa.

Per stabilire che la stabilità del legame di AraC sul DNA dipende dal loop hanno aggiunto Arabinosio, poiché se

aggiunto in soluzione, esso rompe il loop. 34

Allora devo considerare le bande del gel nella LANE 1 2 e 4. Senza AraC ho solo il DNA non inanellato. Se aggiungo

AraC, si forma il loop e la banda migra più velocemente.

Se aggiungessi anche Arabinosio, il loop non si forma e l’arabinosio rompe i punti di repressione, poiché modifica la

conformazione di AraC, che complessata con arabinosio, riconosce operatori diversi su altri promotori.

L’arabinosio può essere aggiunto anche durante la corsa e riesce a perforare il gel e a complessarsi con AraC per

rompere il NUCLEO DI REPRESSIONE.

Se la miscela di legame viene diluita in presenza di Arabinosio, il loop di repressione si può formare poiché quando il

complesso DNA-proteina viene diluito con l’ARABINOSIO, questo viene perso per strada e il loop si può riformare.

L’operatore I, è diviso in due elisiti (alla buon ora!!!!) (I1 e I2). Una porzione funziona nel loop e l’altra non è

interessata nel LOOP (I2). Quando hanno fatto esperimenti di elettroforesi di MINICIRCOLI MUTATI per l’emisito I2

si è visto che questo non era coinvolto nel loop ed esso avveniva comunque, poiché fondamentale è l’emisito I1.

La costante di dissociazione di esperimenti fatti con MINICIRCOLO WT e MINICIRCOLO MUTATO per l’EMISITO

I2, hanno dato risultati simili.

L’emisito I2, si è capito, che non è legato alla formazione del nucleo di repressione e quindi non è legato da AraC e che

questo emisito non è coinvolto nella formazione del loop di repressione. Ma per confermare questo dato hanno eseguito

un altro esperimento.

Facendo questi esperimenti in presenza di Arabinosio (che impedisce la formazione del loop da parte di AraC) in un

contesto WT, hanno visto che si aveva la comparsa in una corsa in gel di frammenti lineari ritardati e li ottengo

se prendo dei promotori che abbiano l’emisito dell’operatore I2 mutato.

Sul promotore lineare, l’emisito I2 è contattato da AraC.

Senza Arabinosio, AraC si lega come dimero sull’operatore I (uno sull’emisito I1 e un altro sull’emisito I2). E si forma

un nucleo di repressione, perché, comunque, l’emisito I1 prende parte alla formazione del loop. Ne consegue la NON

TRASCRIZIONE. AUTOREGOLAZIONE DI AraC

Senza arabinosio, AraC si lega come dimero sul promotore direttamente a O2 e all’emisito I1 dell’operatore AraI. La

proteina si lega e si forma il loop (formando il NUCLEO DI REPRESSIONE), per cui la RNA polimerasi non riesce a

legare e non si ha trascrizione.

Con Arabinosio, AraC si modifica e lega come dimero il promotore a livello dell’operatore AraO1 e i siti di legame

sono adiacenti. AraC in presenza di Arabinosio non funziona più da repressore, ma da attivatore della trascrizione,

poiché la polimerasi può legarsi e attivare la trascrizione del gene araC. 35

PRESENTAZIONE DELLE REVIEWS

PRIMA REVEW

MODALITA’ DI FUNZIONAMENTO DELL’RNAPOLIMERASI ASSOCIATA ALLA SUBUNITA’ SIGMA 54

Modus operandi of the bacterial RNA polymerase containing the σ54 promoter-specificity factor

Sulla base della sequenza primaria, dei promotori riconosciuti e delle proprietà funzionali e di regolazione, si

distinguono due classi di fattori sigma: σ70, con 4 sottofamiglie filogenetiche (stress, heat shock, sintesi flagello,

sporulazione, ECF –funzioni di superficie e di trasporto-) e σ54 presente in 60% dei genomi batterici depositati.

σ70 utilizzato per l’espressione dei “geni di mantenimento” (housekeeping).

Fattori sigma alternativi indirizzano il core enzima su specifici promotori: si formano quindi più polimerasi con diverse

attività Eσ54 controlla l’espressione di geni con funzioni diverse senza un tema comune.

Mycoplasma genitalium =1 fattore sigma

Streptomyces coelicor = 63 fattori sigma

Quando parliamo di subunità sigma 70 e sigma54, ci riferiamo al peso molecole che, per convenzione, va a dare il nome

alla specifica subunità sigma.

Il fattore Sigma70 riconosce elementi in corrispondenza delle sequenze consenso promotoriali -10 e -35, e la RNA

polimerasi inizia a trascrivere.

Si ricordano le solite quattro fasi:

• FASE DI ATTACCO

• FORMAZIONE DEL COMPLESSO CHIUSO

• TRANSIZIONE DA COMPLESSO CHIUSO A COMPLESSO APERTO.

• FASE DI ALLUNGAMENTO con il PROMOTE ESCAPE e in maniera prossimale trascrive il gene.

Il fattore Sigma54 è diverso dal Sigma70 e interagisce diversamente con il promotore. Da ricordare che i fattori Sigma

sono suddivisi in 4 famiglie filogenetiche e raggruppano fattori Sigma che sono responsabili per la trascrizione di classi

specifiche di geni. In particolar modo:

RISPOSTA AGLI STRESS e AGLI SHOCK

 SINTESI FLAGELLARE

 SPORULAZIONE

 Fattore Sigma ECF per la trascrizione di proteine che regolano FUNZIONI DI SUPERFICIE E DI

 TRASPORTO (funzioni extracitoplasmatiche) e controllano dei geni che codificano per OLESINE o

proteine di trasporto superficiali batteriche.

La subunità Sigma70 si trova in tutti i batteri e il Sigma 54 (la sequenza codificante), invece, soltanto nel 60% dei

genomi batterici depositati (quindi solo nel 60% dei batteri).

Allora, il CORE dell’RNApolimerasi è indirizzato su specifici promotori. Allora si ha un meccanismo di regolazione

per cui vengono scelti i geni da esprimere cambiando il tipo di subunità Sigma della RNApolimerasi.

Allora, il fattore Sigma54 fa questa cosa.

C’è una diversa varietà di numero di Sigma54 in ogni cellula batterica, si arriva ad un massimo di 63 subunità Sigma.

Nei micoplasmi ce n’è solo uno e corrisponde alla varietà di ciascuna specie batterica. C’è un legame tra le tante cose

che il batterio può fare e la codificazione.

Il micoplasmi vive in un ambiente limitato e gli basta un solo fattore Sigma. Nello Streptomices, c’è un ciclo vitale

complesso, può formare biofilm e usa 63 fattori Sigma.

Il fattore Sigma54 riconosce dei promotori con delle sequenze conservate in posizione -12 e -24. Invece, il fattore

Sigma70, può legare in posizione -10 e -3.

Il fattore Sigma può legarsi a queste sequenze a prescindere dai promotori e forma un complesso chiuso silente e

posizionato su OFF tutto il tempo e non è attivo trascrizionalmente.

Per il fattore sigma 70, si osservava isomerizzazione spontanea a complesso aperto, senza uso di energia. Per i

promotori riconosciuti dal fattore sigma, invece, ci deve essere un fattore proteico che fornisce energia. Il fattore

proteico a cui si lega Sigma54 è ATPAAA+, che è implicato in diverse attività cellulari. 36


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in biologia molecolare e cellulare
SSD:
Università: Bologna - Unibo
A.A.: 2016-2017

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher paolo.morandi.1987 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biologia Molecolare Avanzata I e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Bologna - Unibo o del prof Biologia Prof.

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