Biologia molecolare avanzata I

• FORMAZIONE DEL COMPLESSO CHIUSO

• TRANSIZIONE DA COMPLESSO CHIUSO A COMPLESSO APERTO.

• FASE DI ALLUNGAMENTO con il PROMOTE ESCAPE e in maniera prossimale trascrive il gene.

Il fattore Sigma54 è diverso dal Sigma70 e interagisce diversamente con il promotore. Da ricordare che i fattori Sigma

sono suddivisi in 4 famiglie filogenetiche e raggruppano fattori Sigma che sono responsabili per la trascrizione di classi

specifiche di geni. In particolar modo:

RISPOSTA AGLI STRESS e AGLI SHOCK

 SINTESI FLAGELLARE

 SPORULAZIONE

 Fattore Sigma ECF per la trascrizione di proteine che regolano FUNZIONI DI SUPERFICIE E DI

 TRASPORTO (funzioni extracitoplasmatiche) e controllano dei geni che codificano per OLESINE o

proteine di trasporto superficiali batteriche.

La subunità Sigma70 si trova in tutti i batteri e il Sigma 54 (la sequenza codificante), invece, soltanto nel 60% dei

genomi batterici depositati (quindi solo nel 60% dei batteri).

Allora, il CORE dell’RNApolimerasi è indirizzato su specifici promotori. Allora si ha un meccanismo di regolazione

per cui vengono scelti i geni da esprimere cambiando il tipo di subunità Sigma della RNApolimerasi.

Allora, il fattore Sigma54 fa questa cosa.

C’è una diversa varietà di numero di Sigma54 in ogni cellula batterica, si arriva ad un massimo di 63 subunità Sigma.

Nei micoplasmi ce n’è solo uno e corrisponde alla varietà di ciascuna specie batterica. C’è un legame tra le tante cose

che il batterio può fare e la codificazione.

Il micoplasmi vive in un ambiente limitato e gli basta un solo fattore Sigma. Nello Streptomices, c’è un ciclo vitale

complesso, può formare biofilm e usa 63 fattori Sigma.

Il fattore Sigma54 riconosce dei promotori con delle sequenze conservate in posizione -12 e -24. Invece, il fattore

Sigma70, può legare in posizione -10 e -3.

Il fattore Sigma può legarsi a queste sequenze a prescindere dai promotori e forma un complesso chiuso silente e

posizionato su OFF tutto il tempo e non è attivo trascrizionalmente.

Per il fattore sigma 70, si osservava isomerizzazione spontanea a complesso aperto, senza uso di energia. Per i

promotori riconosciuti dal fattore sigma, invece, ci deve essere un fattore proteico che fornisce energia. Il fattore

proteico a cui si lega Sigma54 è ATPAAA+, che è implicato in diverse attività cellulari. 36

Un’altra caratteristica è che ATPasiAAA+ lavora associato ad EHNANCER e c’è una sequenza genica a monte del

promotore (distante dal promotore anche 150 paia di basi), che è necessaria all’attivazione della trascrizione ed è quella

tipica degli EUCARIOTI. Questo sistema ricorda l’RNA polimerasi eucariotica, allora per quel che riguarda l’attività

della trascrizione.

Il fattore di trascrizione 2H (TFIIH)è un ATPasi che attiva la trascrizione negli eucarioti.

Una volta che ATPasiAAA+ si lega in prossimità del promotore e lo fa diventare aperto, si ha il posizionamento

dell’RNApolimerasi sul sito +1 (siti d’inizio trascrizione) e inizia la trascrizione.

Per quanto riguarda i domini strutturali del fattore Sigma54, sono diversi da quelli che si osservano nel caso del fattore

Sigma70.

Studi genetici e biochimici hanno presentato dei modelli per spiegare i meccanismi di attivazione della trascrizione con

una RNApolimerasi associata al fattore Sigma54.

In altre parole, vediamo un promotore riconosciuto da σ54

La formazione del complesso chiuso CC avviene indipendente da altri fattori.

Mentre un attivatore è richiesto per l’isomerizzazione a complesso aperto.

Enhancer >>150 bp a monte o a valle del promotore.

FlgR H. pylori biogenesi flagello.

Nel complesso aperto, si ha separazione locale dei filamenti e il posizionamento

del +1 nel sito attivo della polimerasi per iniziare la sintesi.

Nell’immagine qui sopra vediamo le regioni del fattore Sigma e si vede il dominio carbossi terminale (per l’interazione

con il promotore del DNA). Poi vediamo una regione intermedia che contiene dei residui che sono necessari

all’interazione con la RNA polimerasi CORE enzima e vediamo la regione AMMINOTERMINALE, che è una regione

che agisce con l’interattore ATPasico (ATPasiAAA+), che si unisce alla RNA polimerasi mediante interazioni deboli.

La RNA polimerasi interagisce, a sua volta, con la sequenza -12 del promotore. 37

Vediamo schematizzati i vari passaggi da complesso chiuso a complesso aperto e si vede il fattore sigma associato al

CORE e si attacca al promotore e, in risposta a stimoli ambientali, ATP AAA+ si lega agli EHNANCER e crea legami

anche con il promotore e con il fattore Sigma associato alla RNApolimerasi.

Il processo è dinamico e si ha la fase di BENDING, poiché l’EHNANCER è distante dal promotore e subentrano anche

altre componenti proteiche.

IHF è una proteina associata al NUCLEOIDE BATTERICO (nonché alla cromatina batterica) ed è presente quando ci

sono questi rimodellamenti del genoma.

Ciò che si viene a verificare da questo bending sono degli intermedi ad alata energia:

EHNANCER + FATTORE SIGMA 54 + ATPasiAAA+

 IDROLISI dell’ATP e viene fornita energia al sistema

 TRANSIZIONE da complesso chiuso a complesso aperto, con apertura dei due filamenti stampo e non stampo

 nel promotore e la RNApolimerasi si posiziona nel sito d’inizio della trascrizione (sito +1) e inizia la fase di

trascrizione.

Vediamo un modello ipotetico dell’intermedio tra i due complessi e l’attivatore ATPasico contatta il promotore dalla

parte opposta di dove contatta il fattore Sigma54. Fig. 3. A model of a putative

intermediate promoter complex

en route to the Es54-OC was

built using the T. thermophilus

EsA structure (1IW7) and the

cryo-electron microscopy (EM)

reconstruction of the model

activator ATPase, the E. coli

Phage shock protein F (PspF), in

complex with σ54. The model is

in agreement with the view that

the activator ATPase approaches

the Eσ54-CC from the unbound

face of the DNA. The enhancer

DNA (to which the activator

ATPase is bound) and the

intervening DNA between the

promoter and the enhancer DNA

are indicated by a dashed line

(yellow). The β′ upstream clamp

module is highlighted (orange).

SECONDA REVIEW

6S RNA: A REGULATOR OF TRANSCRIPTION

L’autrice è una donna, chiamata Wasserman. Nel ciclo della trascrizione abbiamo detto che il fatto che il fattore Sigma

resti attaccato alla RNA polimerasi può essere per il fatto che regola la trascrizione.

Il 6S ha come bersaglio di regolazione l’RNA polimerasi OLOENZIMA. L’RNA regolatore in questione è stato trovato

negli anni ’60, come un’RNA contaminante nel purificato della RNA totale di E.coli. Se si deleta la sequenza

codificante per gli RNA6S, i ceppi deleti per 6S non avevano dei fenotipi evidenti e non potevano essere visti e per

questo è stato sconosciuto per molto tempo. Li si sono scoperti verso la fine degli anni ’90 e i laboratori che lavoravano

su altre cose, hanno trovato casualmente dei piccoli RNA a basso peso molecolare e con un diminuito coefficiente di

sedimentazione. Si scoprì che avevano delle funzioni regolatrici. Gallo e un collaboratore vinsero il Nobel per aver

scoperto dei piccoli RNA.

Tutto questo preludio per dire che se l’RNA 6S è stato trovato, sì, venti anni fa ormai, ma soltanto ora hanno capito

come funziona.

Presenta una struttura secondaria caratteristica, dove si forma una bolla centrale, che può ricordare il complesso aperto

(i filamenti di DNA promotoriale si aprivano – formazione bolla – e la RNApolimerasi poteva posizionarsi nel sito +1).

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Fig. 1. Illustration of E. coli 6S RNA in a secondary structure supported by phylogenetic and experimental analyses (see

Barrick, 2005; Trotochaud and Wassarman, 2005). The red arrow marks the location where RNA synthesis using 6S

RNA as a template initiates, and the yellow shading indicates the region of 6S RNA that is complementary to the full-

length product RNA (pRNA) of 20 nucleotides long. In the inactive M5 RNA, nucleotides 42–58 are replaced by CAC,

resulting in a smaller single-stranded bulge. M5 RNA does not bind s70-RNAP in vivo or in vitro, and does

not function in vivo for 6S RNA-mediated changes in transcription or cell survival (Wassarman and Storz, 2000;

Trotochaud and Wassarman, 2004; 2005; 2006).

Dopo che la struttura secondaria dellRNA 6S fu risolta, si vide che la RNApolimerasi OLOENZIMA è un bersaglio di

questo piccolo RNA regolatore 6S.

Il 6S compete con il fattore Sigma70 per il legame alla CORE polimerasi e c’è associato o il fattore Sigma oppure

l’RNA6s, poiché i legami sono mutamente esclusivi e la struttura secondaria dell’RNA 6S ha fatto capire che

l’inibizione della trascrizione sfrutta il MIMETISMO molecolare, cioè, mimando la struttura dei trascritti e facendo

pensare alla polimerasi di star già sintetizzando, così essa viene fermata.

Allora l’RNA 6S stimola l’inibizione della trascrizione. Esso camuffa il promotore aperto e la rende silente.

Ma qual è il significato di tutto ciò?

Hanno scoperto l’RNA 6S quando ci si è accorti che l’RNA 6S dentro possiede una sequenza codificante e in vitro, se

metto un eccesso di ribonucleotidi, si osserva la trascrizione di un trascritto corto 22 nucleotidi, detto piccolo RNA

(pRNA) e si ritiene che il trascritto di 22 ribonucleotidi sia il segnale che indica alla RNApolimerasi di rilasciare l’RNA

6S. Allora è come un interruttore per sganciare l’RNA 6S dalla RNApolimerasi. Allora, mettendo un eccesso di

ribonucleotidi, significa che si sta ritornando alla fase esponenziale di crescita e l’RNA 6S inibitore deve essere

rilasciato.

Allora, nella fase stazionaria, il 6S lega l’RNApolimerasi e la blocca. Quando si torna in fase esponenziale di crescita

(quando ricomincia un nuovo ciclo cellulare) l’eccesso di ribonucleotidi fa sì che venga prodotto un trascritto lungo 22

nucleotidi e l’RNA 6S si stacca e riprende il normale ciclo di trascrizione dei geni.

TERZA REVIEW

H-NS: UN REGOLATORE UNIVERSALE PER UN GENOMA DINAMICO

Cosa significa questo titolo?

Con genoma dinamico allude al NUCLEOIDE, nonché il cromosoma batterico associato a proteine.

Abbiamo le HISTON LIKE PROTEIN, poiché hanno carica positiva (cationiche) e hanno un basso peso molecolare. 39

Legano il genoma batterico e non hanno

nessuna omologia con gli istoni

eucariotici.

Hanno la funzione di compattare il

genoma in risposta a stimoli esterni.

H-NS significa proteina che struttura il

NUCLEOIDE ed è stabile al calore.

Hanno solo un’analogia funzionale con

gli istoni eucariotici.

Ma come funzionan