Appunti di Biologia Molecolare Avanzata

FRET)

Fluorescence resonance energy transfer (FRET): is a mechanism describing energy transfer

between two light-sensitive molecules (chromophores). A donor chromophore, initially in its

electronic excited state, may transfer energy to an acceptor chromophore through

nonradiative dipole–dipole coupling. The efficiency of this energy transfer is inversely

proportional to the sixth power of the distance between donor and acceptor, making FRET

extremely sensitive to small changes in distance. Measurements of FRET efficiency can be used

to determine if two fluorophores are within a certain distance of each other.

• Biotinilazione dei residui di lisina - gruppo biotinile (Biotinil CoA i cui livelli sono variabili in

base alla dieta)

HCS (olocarbossilasi sintetasi)

Modifica post-traduzionale rarissima (0,0001%) ed è a carico soprattutto del tetramero H3-H4

→

e risiede nell'eterocromatina repressione trascrizionale (un nucleosoma wild-type se è

soggetto a biotinilazione tende ad incrementare la interazioni intranucleosomali che sono

favorevoli all'ottenimento di strutture cromatiniche di ordine superiore; H4K16bio e

H4K12bio)

• Fosforilazione dei residui di serina, treonina, tirosina e istidina - gruppo fosforico (ATP)

Chinasi → → →

Es. H4H18 (coda N-terminale) interazioni internucleosomali H4H18ph rilassamento

cromatinico

→ → →

Es. H4H75 interazione intranucleosomale con H2BE90 (acido glutammico) H4H75ph

rilassamento cromatinico

L'istidina presenta nella sua componente penta atomica eterociclica 2 atomi di azoto entrambi

suscettibili di fosforilazione ma non simultaneamente (N1 e N3) e a queste due varianti della

stessa modificazione è stato attribuito un significato funzionale differente. Entrambe sono

→

presenti nella cromatina in attiva proliferazione ma in 2 contesti diversi: N1 fosforilato

→

rigenerazione compensativa del fegato (evento fisiologico) mentre N3 fosforilato epato

carcinoma (evento patologico).

Es. H3Y41ph si accumula in maniera specifica in corrispondenza del promotore basale e del

TSS (questo aspetto vale per un migliaio di geni ma ce ne sono circa una quarantina che

accumulano la fosforilazione in tutta la struttura del gene come i marcatori del

differenziamento eritroide).

Lezione 7

• Glicosilazione dei residui di serina e treonina - UDP-β-N-acetilglucosammina (deriva

→ →

principalmente dal glucosio la sua abbondanza è sinonimo di ricchezza energetica se

→

variano i suoi livelli varierà la possibilità di imporre questa modifica post-traduzionale è

influenzata dalla dieta)

O-glicosilazione (se il ricevente è un atomo di ossigeno; serina e treonina istonici)

○ OGT e OGA (O = O-glicosilazione, G = acetilglucosammina e T/A =

transferasi/amminidasi)

L'acetilglucosammina viene trasferita per O-glicosilazione all'unico atomo di ossigeno

libero da legami peptidici

Es. H2BS36 (contrae un'interazione diretta col DNA nucleosomale; superficie laterale; la

sua O-glicosilazione non si sa se è un marcatore positivo o negativo), H2AT101 (zona

d'interfaccia d'interazione tra l'emitetramero e l'eterodimero; se glicosilato favorisce la

trascrizione) e H4S47 (non interagisce direttamente con il DNA in quanto è interposta

→

una molecola d'acqua; superficie laterale; se glicosilato inibisce la trascrizione) dalla

O-glicosilazione di questi residui si ottengono output differenti anche se tutte e tre le

modifiche comportano la decondensazione cromatinica.

Es. H3S10 può essere sia fosforilato che glicosilato (le due modifiche sono in continua

competizione e si escludono a vicenda). Gli enzimi coinvolti nell'aggiungere e nel

rimuovere entrambe le modifiche fanno parte dello stesso complesso tetramerico: OGT,

OGA, Aurora-B (chinasi) e TP1 (fosfatasi). La loro attività infatti è regolata in maniera

reciproca (è regolata durante il ciclo cellulare in risposta alla concentrazione dei donatori

di entrambe le modifiche ovvero ATP e UDP-β-N-acetilglucosammina). Associazione di

OGT e TET1, -2 e -3 [demetilazione del DNA delle isole CpG e glicosilazione dei residui

→ →

istonici (H2BS112gli H2B120ub H3K4me3) = insieme di cross-talk favorenti

l'attivazione trascrizionale = effetto concorde]. In base alla dislocazione delle isole CpG si

distinguono 2 possibilità:

§ Isole CpG che ricadono all'estremità 5' del gene (promotore basale, TSS, primo

esone, ecc.) ed è la categoria più rappresentata

§ Isole CpG che ricadono altrove lungo il gene (a monte, dentro o più a valle rispetto

alla struttura del gene) ed è la categoria meno rappresentata

N-glicosilazione (se il ricevente è un atomo di azoto; questa modifica viene utilizzata per

○ altri bersagli proteici)

• Crotonilazione dei residui di lisina - gruppo crotonilico (Butirril CoA)

HAT, HDAC3 (Classe I) e SIRT3 (Classe III o delle sirtuine)

Diversi residui possono essere crotonilati o acetilati, altri invece possono essere

esclusivamente crotonilati o acetilati. La crotonilazione è maggiormente distribuita a livello del

→

promotore e negli enhancer attivazione trascrizionale (come ad es. H3K18) ed in particolare

se un residuo è crotonilato questo sarà associato ad una trascrizione più forte rispetto ad una

condizione di acetilazione. Questa modifica è influenzata dai livelli di crotonil CoA che tra

→

l'altro, essendo un componente acilico, dipende dalla dieta la cellula è in grado di captare i

→

livelli di acetil CoA e di rapportarli a quelli di crotonil CoA normalmente la concentrazione di

acetil CoA è maggiore (anche perché è un intermedio metabolico usato molto più

frequentemente) di quella del crotonil CoA ma quando sussiste un evento

fisiologico/patologico o dipendente dalla dieta a da uno scompenso metabolico che comporta

un aumento di crotonil CoA il rapporto cambia fino a raggiungere la stessa concentrazione (in

questo caso il crotonil CoA prende il sopravvento).

Es. di geni soggetti a crotonilazione è stato offerto da uno studio del percorso differenziativo

della linea germinale maschile che contempla la riduzione meiotica durante la transizione da

→

spermatogoni a spermatociti configurazione aploide definitiva degli spermatozoi.

L'espressione di questi geni (dovuta alla crotonilazione) si verifica esclusivamente dopo la

riduzione meiotica. Dopo aver condotto uno studio su topo (mediante immunoistochimica) si è

riscontrato un picco di crotonilazione subito dopo la riduzione meiotica e subito il livello di

crotonilazione scende nuovamente per poi risalire in maniera più marcata negli stadi di

differenziamento più avanzati (ipercrotonilazione). La prima crotonilazione discreta interessa il

set di geni espressi nel genoma appena divenuto aploide mentre la seconda ondata di

crotonilazione è estesa indiscriminatamente a tutta la cromatina (e si è potuta riscontrare

questa caratteristica in seguito ad analisi di immunocitochimica con fluorofori).

Cromocentro: ammasso di eterocromatina presente nel nucleo delle cellule non in mitosi, che

si distingue dai nucleoli per il suo contenuto di DNA. Sia acetilazione che crotonilazione

determinano normalmente decondensazione cromatinica e provocano ipertrascrizione ciò

però non significa che gli spermatozoi in fase di differenziamento terminale inizino a

trascrivere qualsiasi sequenza e a decondensare tutta la cromatina al contrario la cellula sta

→

andando incontro ad un ipercompattamento della cromatina paradosso? No in realtà

l'ipercondensazione cromatinica gestita dall'ipercrotonilazione e dall'iperacetilazione

permette che la cromatina venga resa superaccessibile non perché rimanga talema per

favorire l'estirpazione degli ottameri istonici preesistenti e fare in modo che essi vengano

→

sostituiti dalle protammine (massima decondensazione massima condensazione).

• Propionilazione e butirrilazione dei residui di lisina

HAT e HDAC

Modifiche aventi rispettivamente 3 e 4 atomi di carbonio nell'unità trasferita. In moltissimi casi

lo stesso residuo di lisina (che si può trovare nella coda N-terminale o nel core nucleosomale)

può andare incontro ad acetilazione, propionilazione, butirrilazione o crotonilazione a seconda

del contesto o del momento cellulare. Esistono ovviamente le eccezioni (H4K20 può essere

solo acetilato e sono presenti residui che possono essere solo propionilabili e butirrabili e

queste 2 modifiche si ritrovano in coppia e sono scambievoli tra loro). Esistono casi intermedi

che vedono l'associazione della butirrilazione accoppiata alla propionilazione o con

l'acetilazione o con la crotonilazione.

• Formilazione dei residui di lisina

Non richiede enzimi e non può essere rimossa da nessun enzima (l'istone in cui è avvenuta

questa modificazione deve essere sostituito). →

Si ritrova in lisine di nucleosomi presenti in tratti di DNA danneggiati per ossidazione 5'-

→ →

ossidazione formilfosfato (potentissimo elettrofilo) gruppo amminico della lisina

→

(nucleofilo a cui si lega il formilfosfato) fintanto che rimane questo gruppo formilico il →

residuo di lisina è bloccato ed è refrattario a qualsiasi altra modificazione post-traduzionale

scopo: bloccare questa configurazione e permettere al sistema di riparazione del DNA di

recuparare il danno. Si ritrova esclusivamente in residui di lisina istonici.

• Isomerizzazione dei residui di prolina

PPIasi suddividibili in 3 categorie: parvuline, ciclofiline e FKBP (che si distinguono in base al

bersaglio proteico, in base alla sequenza amminoacidica riconosciuta all'interno del bersaglio

proteico e in base alla posizione della prolina all'interno del bersaglio). PPIasi istoniche: Fpr4

(FKBP) e ciclofilina 71 (che agisce su H3).

Alterazione stereochimica del residuo rispetto a quelli che lo fiancheggiano, e in particolare in

relazione ai residui che lo precedono. Infatti la prolina in un contesto polipeptidico forma un

legame con l'amminoacido che la precede che è suscettibile di rotazione cosicché per mezzo

giro di rotazione è possibile distinguere 2 configurazioni:

Cis in cui i sostituenti che si hanno a carico delle 2 estremità di questo legame peptidico

○ si trovano tutti sulla stessa parte di un piano ipotetico

Trans in cui i sostituenti sono disposti su versanti opposti

○

Le 2 configurazioni in natura, si trovano in equilibrio tra loro ma esiste una predominanza della

configurazione trans (perché non avvengono repulsioni elettrostatiche o collisioni per

ingombro sterico).

Le code N-terminali di H3 e di H4 condividono una sequenza amminoacidica