Appunti di Biologia Molecolare Avanzata

Lezione 1: Epigenetica

Definizione di epigenetica

Epigenetica: Branca della biologia molecolare che si occupa dello studio dei meccanismi preposti a modificare il DNA e dunque il genoma di un organismo, influenzandone l'espressione genica prima e il fenotipo in ultima analisi, in risposta a stimoli ambientali senza alterare la composizione qualitativa e quantitativa del DNA.

Filtro epigenetico

Utilizzo selettivo dell'informazione porta a un patrimonio trascrittomico e proteomico diversificato, con conseguenti fenotipi diversi (esempi: linfocita paragonato al neurone e delle farfalle).

Parametri che caratterizzano l'epigenoma

• Modificazioni biochimiche (DNA, RNA e istoni)
• Modifiche post-traduzionali
• Varianti istoniche
• Arrangiamento spaziale all'interno del nucleo
• Posizionamento del nucleosoma
• Organizzazione della cromatina
• Informazione posizionale
• ncRNA

Clonazione

Clonazione: Processo, naturale o artificiale, che porta all'ottenimento di cellule, individui o geni, tutti identici fra loro (cloni). Nel caso della riproduzione asessuale (agamica o vegetativa) degli organismi, gli individui multicellulari o unicellulari originatisi per moltiplicazione sono geneticamente uguali dato che il processo mitotico è di tipo conservativo.

SNT (trasferimento nucleare somatico) - John Gurdon e Ian Wilmut

Riprogrammazione

È una procedura di biologia molecolare che comporta un intervento specifico sul programma biologico di base che è il DNA. Tale intervento consiste nel riportare il nucleo di cellule somatiche differenziate a una condizione indifferenziata, senza intaccarne le potenzialità. Le modificazioni epigenetiche del genoma sono generalmente stabili nelle cellule somatiche di organismi pluricellulari. Nelle cellule germinali e negli embrioni ai primi stadi di sviluppo, tuttavia, la riprogrammazione epigenetica si verifica sull'ampia scala genomica e include meccanismi di demetilazione del DNA e rimodellamento degli istoni e loro modifiche.

Il termine riprogrammazione sottintende un evento di programmazione già avvenuto:

• Spermatozoi: Pronucleo con un grado di compattazione estremamente elevato (protammine 95% e nucleosomi 4-5%, con varianti istoniche specifiche per la linea germinale maschile come H2AL1/L2); DNA altamente metilato.
• Oociti: Pronucleo con un grado di compattazione relativamente basso (nucleosomi canonici con varianti istoniche specifiche per la linea germinale femminile come H1oo, dove le due "o" stanno per "oogenesi"); i nucleosomi presenti sono suscettibili alle modifiche post-traduzionali come H4deac; DNA metilato.

Prima che il pronucleo maschile penetri nel citoplasma dell'oocita (fecondazione) devono essere abolite queste differenze che si sono venute a creare tra linea germinale maschile e la linea germinale femminile (riprogrammazione = evento fisiologico). Pur essendo un evento fisiologico, negli esperimenti di clonazione è un evento forzato che:

• Fallisce nel 25-30% dei casi;
• Si verifica ma in maniera aberrante nel 70% dei casi (ciò porta ad aborti spontanei preparto o morte della progenie entro i primi 2 giorni);
• Si verifica in maniera pseudo-normale nel 1-5% dei casi (pecora Dolly - Ian Wilmut).

Imprinting genetico

Indica l'espressione differenziata di materiale genetico a seconda dell'origine parentale. È un meccanismo di regolazione genica che riguarda circa un centinaio di geni conosciuti, dato che molti di questi hanno un ruolo rilevante nel differenziamento e nello sviluppo. Nella spermatogenesi parliamo di imprinting paterno, mentre nell'oogenesi di tipo materno. La differente metilazione di un determinato locus genico costituisce una sorta di "impronta", la quale impone l'espressione di uno solo dei due alleli di quel determinato locus genico, ossia quello della madre o quello del padre.

Epigenetic differences in monozygotic twins

Monozygous twins share a common genotype. However, most monozygotic twin pairs are not identical; several types of phenotypic discordance may be observed, such as differences in susceptibilities to disease and a wide range of anthropomorphic features. One possible explanation for these observations is the existence of epigenetic differences. To address this issue, we examined the global and locus-specific differences in DNA methylation and histone acetylation of a large cohort of monozygotic twins. We found that, although twins are epigenetically indistinguishable during the early years of life, older monozygous twins exhibited remarkable differences in their overall content and genomic distribution of 5-methylcytosine DNA and histone acetylation, affecting their gene-expression portrait. These findings indicate how an appreciation of epigenetics is missing from our understanding of how different phenotypes can be originated from the same genotype.

Isole CpG

Regione di almeno 200 bp con una percentuale di GC maggiore del 50% e con un rapporto di CpG osservati/attesi maggiore del 60%. Nei genomi dei mammiferi, la lunghezza di un'isola CpG è generalmente compresa tra le 300 e le 3.000 paia di basi. Si trovano all'interno e nelle vicinanze di circa il 40% dei promotori dei geni di mammifero. Nell'uomo, approssimativamente il 70% dei promotori ha un alto contenuto di CpG. Data la frequenza di GC comunque, il numero di dinucleotidi CpG è molto più basso del previsto. La "p" nella notazione CpG si riferisce al legame fosfodiesterico tra la citosina e la guanina.

Bisulfite treatment

Converts cytosine residues to uracil, but leaves 5-methylcytosine residues unaffected. Thus, bisulfite treatment introduces specific changes in the DNA sequence that depend on the methylation status of individual cytosine residues, yielding single-nucleotide resolution information about the methylation status of a segment of DNA. Various analyses can be performed on the altered sequence to retrieve this information. The objective of this analysis is therefore reduced to differentiating between single nucleotide polymorphisms (cytosines and thymidine) resulting from bisulfite conversion.

Amplification of differentially methylated sites (AIMS)

AIMS is based on the differential cleavage of isoschizomers with distinct methylation sensitivity (i.e., SmaI and pspA1). Specific adaptors are ligated to the methylated ends of the digested genomic DNA. The ligated sequences are purified and amplified by PCR using adaptor specific primers extended at the 3' end with two to four arbitrarily chosen nucleotide residues to reduce the complexity of the product. To be amplified, a sequence must fulfill two requirements: (i) to contain two closely spaced methylated SmaI sites and (ii) to show homology to the nucleotides extended at the 3' end of the primer. PCR products are resolved in denaturing polyacrylamide sequencing gels generating fingerprints that consist of multiple anonymous bands that represent the DNA methylome of the cell. These bands are DNA fragments flanked by two methylated sites and can be individually isolated and characterized. The usefulness of AIMS lies in two properties of the method: the generation of a high number of sequences representing two close methylated CpGs and the feasibility of reducing the complexity of the product to obtain readable fingerprints.

Comparative genomic hybridization (CGH)

CGH is a molecular cytogenetic method for analysing copy number variations (CNVs) relative to ploidy level in the DNA of a test sample compared to a reference sample, without the need for culturing cells. The aim of this technique is to quickly and efficiently compare two genomic DNA samples arising from two sources, which are most often closely related, because it is suspected that they contain differences in terms of either gains or losses of either whole chromosomes or subchromosomal regions (a portion of a whole chromosome). This technique was originally developed for the evaluation of the differences between the chromosomal complements of solid tumor and normal tissue, and has an improved resolution of 5-10 megabases compared to the more traditional cytogenetic analysis techniques of giemsa banding and fluorescence in situ hybridization (FISH) which are limited by the resolution of the microscope utilized.

Epigenetic of personality traits

An illustrative study of identical twins discordant for risk-taking behavior. DNA methylation differences between identical twins could account for phenotypic twin discordance of behavioral traits and diseases. High throughput epigenomic microarray profiling can be a strategy of choice for identification of epigenetic differences in phenotypically different monozygotic (MZ) twins. Epigenomic profiling of a pair of MZ twins with quantified measures of psychometric discordance identified several DNA methylation differences, some of which may have developmental and behavioral implications and are consistent with the contrasting psychometric profiles of the twins. In particular, differential methylation of CpG islands proximal to the homeobox DLX1 gene could modulate stress responses and risk-taking behavior, and deserve further attention as a potential marker of aversion to danger. The epigenetic difference detected at DLX1 of ~1.2 fold change was used to evaluate experimental design issues such as the required numbers of technical replicates. It also enabled us to estimate the power this technique would have to detect a functionally relevant epigenetic difference given a range of 1 to 50 twin pairs. We found that use of epigenomic microarray profiling in a relatively small number (15–25) of phenotypically discordant twin pairs has sufficient power to detect 1.2 fold epigenetic changes.

Lezione 2: Modificazioni biochimiche

Metilazione e demetilazione del DNA

Metilazione:

• DNMT1: DNA emimetilato ed impone la metilazione in maniera simmetrica sul filamento non metilato (DNA-metiltransferasi di mantenimento);
• DNMT3: DNA non metilato (nella maggior parte dei casi) e DNA emimetilato (non necessariamente lo riconoscono);

Demetilazione:

• "Demetilasi" nelle piante che converte la 5-meC in C;
• Glicosilasi negli animali;
• 5-hydroxymeC è elettivamente neurale (SNC);

Modifiche post-traduzionali degli istoni

Acetilazione, ADP-ribosilazione, biotinilazione, citrullinazione, fosforilazione, isomerizzazione, metilazione, SUMOilazione e ubiquitilazione; reversibili; effetti estrinseci/intrinseci (da un punto di vista meccanicistico/spaziale) e positivi/negativi.

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP)

È una tecnica sperimentale impiegata nell'analisi delle interazioni tra DNA e proteine e per lo studio delle alterazioni epigenetiche degli istoni, proteine basiche che costituiscono la componente strutturale della cromatina. Questa metodica mira a studiare l'associazione di proteine regolatrici che si legano a specifiche regioni genomiche come: fattori di trascrizione su promotori, al fine di evidenziare unità codificanti. La ChIP è una tecnica molto utilizzata e l'analisi viene effettuata in vivo.

Le cellule vengono trattate con un agente che provoca la formazione di legami covalenti-crociati fra il DNA e le eventuali proteine ad esso legate. Successivamente la cromatina estratta dalle cellule viene frammentata, il prodotto così ottenuto viene esposto all'anticorpo diretto contro la proteina e in caso questa sia presente, si avrà l'immunoprecipitazione del complesso. I frammenti di DNA recuperabili dall'immunoprecipitazione verranno purificati e si potrà determinarne la sequenza, con l'idea che essa sia correlata alla proteina.

Si lavano le cellule con un tampone (generalmente PBS) e si aggiunge l'1% di formaldeide (che favorisce il legame tra proteina e DNA) e si incuba generalmente 10 - 15 minuti (in base al tipo di tampone utilizzato) a temperatura ambiente, si aggiunge la glicina 0,125 molare che ha la funzione di arrestare la reazione di crosslinking tra proteine e DNA. La fissazione può avvenire anche con trattamento con luce UV.

Si lavano le cellule con PBS e successivamente si lisano. Il secondo passaggio consiste nella frammentazione della cromatina tramite sonicazione, nucleasi o digestione di restrizione. Si aggiunge poi l'anticorpo primario e si incuba a 4 °C per 12 ore, successivamente si aggiunge le proteina A/G immobilizzata su sfere di vario materiale, che è stata precedentemente legata ad un anticorpo secondario che riconosce quello primario.

Si incuba il tutto per 2 ore a 4 °C. Si recuperano le sfere mediante centrifugazione, esse si depositano nel sedimento, si lava con un tampone e si eluiscono i complessi DNA-Proteine dalle sfere. Il DNA non legato resterà nel sopranatante. Si incuba a 66 °C per 6 ore per invertire il crosslinking poi si recupera il DNA (estraendolo mediante fenolo/cloroformio) che successivamente verrà analizzato mediante PCR. L'amplificazione avviene con primers specifici per la sequenza a cui si pensa sia legata la proteina di interesse.

Nel seguire la metodica è opportuno tener conto di alcuni accorgimenti fondamentali: i frammenti di cromatina devono essere di 0.5/1 Kb, per ottenere una corretta amplificazione e per evitare che durante l'immunoprecipitazione si formino aspecifici; l'anticorpo deve essere altamente specifico.

Acetilazione e deacetilazione dei residui di lisina

Gruppo acetilico (Ac. CoA) gruppo amminico ε (annullamento della carica di questo gruppo amminico).

Acetilazione decondensazione cromatinica maggiore probabilità dell'evento trascrizionale.

HAT suddividibili in 2 classi:

• Localizzazione nucleare
• HAT-1, HAT-11 (RTT-109) localizzazione citoplasmatica (agiscono sugli istoni neosintetizzati)

È l'acetilazione che comporta la decondensazione cromatinica o comunque l'acetilazione è un evento che si verifica e poi lo ritroviamo associato alla decondensazione?

Prima ipotesi: effetto carica interruzione delle interazioni internucleosomali (che si generano tra le code N-terminali di nucleosomi differenti) neutralizzando le cariche positive e "in vitro, questa cromatina ricostituita con istoni ricombinanti privi di code N-terminali si presenta fino a 14 volte più accessibile".

Questa prima ipotesi è stata smentita in quanto la cromatina assemblata con nucleosomi (con code N-terminali non acetilate) i cui cori nucleosomali sono stati estremamente acetilati (interrompendo le interazioni intranucleosomali) si presentava solo 1,4 volte più accessibile (10 volte in meno rispetto all'esperimento precedente).

Seconda ipotesi: interattori l'acetilazione di un residuo lisina non comporta ingombro sterico ma favorisce il reclutamento di un complesso enzimatico che scatena la decondensazione cromatinica.

Es. I residui 16-24 della coda N-terminale di H4 di un nucleosoma interagiscono con la porzione globulare di H2A di un nucleosoma adiacente, favorendo la condensazione della fibra cromatinica. Il compattamento è inibito da H4K16Ac. Questo potrebbe essere spiegato semplicemente dall'effetto carica tuttavia per modificare questo residuo deve intervenire una HAT e l'interazione internucleosomale verrà comunque interrotta dalla presenza di questo enzima. Inoltre una volta apportata l'acetilazione viene reclutato sul residuo modificato un interattore che interromperà esso stesso l'interazione internucleosomale.

Le modifiche post-traduzionali non si verificano esclusivamente sui residui delle code N-terminali.

Es. H491Ac posto tra H4 e H2B comporta il rilassamento del core nucleosomale e il rilascio degli eterodimeri H2A-H2B.

Deacetilazione

HDAC suddividibili in 2 classi:

• Classi I, IIA, IIB e IV (Zn²⁺)
• Classe I: presenti in tutte le forme di vita, nucleari e ubiquitarie;
• Classe II (A e B): nucleari/citoplasmatiche, shuttle tra nucleo e citoplasma e tessuto specifiche (A e B differiscono per struttura e localizzazione tissutale);
• Classe IV: HDAC11 (struttura ibrida fra Classe I e Classe II) nucleare/citoplasmatica shuttle tra nucleo e citoplasma
• Classe III chiamate anche sirtuine (Zn²⁺, NAD⁺) si possono riscontrare in ogni compartimento subcellulare. SIRT4 = ADP-ribosil transferasi. SIRT6 = ADP-ribosil transferasi + attività HDAC

Le HDAC possono essere considerate come dei co-repressori in quanto la deacetilazione è associata a condensazione ma esistono delle eccezioni.

Es. l'espressione dei geni regolati dai glucocorticoidi. Se l'effetto è quello di bloccare la HDAC1, la risultante trascrizionale dovrebbe essere esattamente la stessa anche se elimino completamente. Invece, in seguito a esperimenti di knock-out si ha una diminuzione della trascrizione. Quindi, pur essendo presenti ma cataliticamente inattive, queste 2 HDAC è richiesta e fondamentale per assemblare la giusta configurazione di un complesso che poi eserciterà meglio le sue funzioni positive nei confronti della trascrizione.

Lezione 3

Metilazione e demetilazione dei residui di lisina

Gruppo metilico (SAM SAH) gruppo amminico ε (non influisce sulla carica del gruppo amminico).

4 livelli di metilazione: lisina non metilata, lisina mono-, di- e trimetilata (ogni livello di metilazione ha un effetto funzionale differente complessi differenti che captano differenti livelli di metilazione anche sullo stesso residuo amminoacidico dello stesso istone).

La monometilazione viene captata da complessi/interattori che presentano un dominio caratteristico: cromodominio. Decondensazione/condensazione cromatinica attivazione/repressione trascrizionale.

Metilazione:

• HMT non riescono necessariamente a imporre tutti i livelli di metilazione.
• Attivazione trascrizionale
• Es. H3K4me1,2,3 (3'→5') imposte da Set1 attivazione trascrizionale
• Es. H3K36me3 (Set2) si estende su quasi tutto il gene ed in particolare verso l'estremità 3' rinsaldando le interazioni intranucleosomali ostacolo alla potenziale accessibilità a