Biologia molecolare - appunti

Metodi per l'analisi delle proteine che legano il DNA e delle sequenze di DNA riconosciute

1. Ritarso su gel 2. Identificazione della regione di contatto con DNAsi I 3. Saggio di interferenza per modifica con DMS 4. Footprinting 5. Mutagenesi→procarioti = 50 nt al secondo che corrisponde a 15 aa al secondo di sintesi proteica. Non c'è bisogno di un primer e il legame della RNA-polimerasi con il promotore viene definito complesso chiuso poiché il DNA è ancora integro. In seguito una serie di cambiamenti nell'enzima ne inducono l'apertura con la conseguente formazione del complesso aperto. L'RNA-polimerasi inizialmente sintetizza un filamento senza staccarsi dal promotore che viene rilasciato prima di raggiungere i 9 nt. Tale processo si ripete molte volte fino a che non si forma un ibrido DNA-RNA più lungo di 9, il DNA infatti sembra fungere da regolatore allosterico. Tale fase è stata studiata con le tecniche di DNA footprint.

E sembra che sia importante anche per rimuovere una regione del fattore sigma che occupa inizialmente il canale di uscita. Il trascritto in genere inizia sempre con una A segno che nel sito attivo ci deve essere una particolare affinità per il corrispondente nucleoside trifosfato. Ci sono tre modelli che tentano di spiegare come la RNA-polimerasi avanzi sul promotore:

1. Passaggio transiente = la polimerasi avanza per un tratto breve sintetizzando un corto frammento abortivo di RNA e poi indietreggia tornando sul promotore;
2. Bruco = la polimerasi, che in questo modello dovrebbe essere molto flessibile, si allunga e si contrae sul DNA;
3. Accartocciamento = inizialmente sta ferma sul promotore e ingloba dentro di sé del DNA che poi accartoccia. Questo potrebbe essere fatto anche nella fase di allungamento ed in particolare si pensa che fornisca l'energia necessaria per promuovere il distacco dal promotore.

Promotori e sigma = il promotore nei batteri ha tre

componenti: una sequenza a -35 TTGACA, una sequenza TATAAT a -10, una sequenza +1 che presenta la A del TSS. Se si verificano delle mutazioni si possono avere due casi: quelle down diminuiscono l'efficienza del promotore mentre le up ne aumentano l'efficienza. Invece per quanto riguarda l'oloenzima esso potrebbe non riuscire a legarsi al DNA se sul filamento codificante si hanno troppe mutazioni poiché è con esso che instaura la maggior parte dei punti di contatto. La RNA-polimerasi ha una sua affinità per il DNA ed in particolare nella cellula essa si trova legata alla doppia elica con un equilibrio in cui il distacco sarà lento e il legame veloce. Essa però non è in grado di legarsi specificamente e con grande precisione al sito di inizio infatti per fare ciò è necessario il fattore sigma. Quest'ultimo deve essere legato alla RNA-polimerasi altrimenti essa non è in grado di riconoscere la zona del promotore.particolare inizialmente la RNA-polimerasi con la subunità sigma già presente contatta la sequenza -35, poi sulla regione del promotore si forma il complesso chiuso ed infine la fusione nella zona della regione a -10 permette la formazione della forma aperta. L'allungamento è la fase successiva che inizia quando il fattore sigma non blocca più l'uscita del filamento e non si hanno più i trascritti abortivi. Questo non è affatto un processo senza interruzioni e continuo. Spesso le RNA-polimerasi rallentano, fanno delle pause e creano dei complessi inattivi, dove il 3'OH del trascritto si distacca dal sito attivo, e che possono essere riattivati in seguito. Esistono dei fattori di allungamento come GreA e GreB che riattivano tali processi e aumentano la velocità di sintesi. Inoltre GreB può partecipare alla correzione di bozze di tipo idrolitico in cui deve essere idrolizzato un nt errato che è stato introdotto nella.

La trascrizione del DNA inizia con l'apertura della doppia elica del DNA da parte dell'enzima RNA-polimerasi. L'enzima si lega al promotore, una specifica sequenza di DNA, e inizia a sintetizzare l'RNA complementare al filamento di DNA codificante. Durante la sintesi dell'RNA, l'enzima si muove lungo il filamento di DNA, aggiungendo nucleotidi complementari al filamento di DNA codificante.

La sintesi dell'RNA avviene in direzione 5' -> 3', mentre il filamento di DNA codificante viene letto in direzione 3' -> 5'. Pertanto, l'RNA sintetizzato è complementare al filamento di DNA codificante e identico al filamento di DNA non codificante, ad eccezione del fatto che l'RNA contiene uracile (U) al posto della timina (T).

Durante la sintesi dell'RNA, si generano dei superavvolgimenti positivi e negativi lungo il DNA. Questo fenomeno è noto come modello dei domini gemelli per la trascrizione: ogni 10 nucleotidi polimerizzati si genera un superavvolgimento a valle e uno a monte. Se si generano troppi superavvolgimenti positivi, il DNA si compatta e la sintesi si arresta.

Infine, la sintesi dell'RNA si arresta grazie al transito della RNA-polimerasi su alcune sequenze definite terminatori. In E. coli, ci sono due diversi meccanismi per terminare la trascrizione. Si possono avere dei terminatori intrinseci, ovvero delle sequenze palindromiche ricche in G-C seguite da un tratto ricco in A-T, che da sole inducono il distacco dell'enzima e il rilascio dell'RNA formando una forcina che destabilizza il complesso trascrizionale. Oppure si può avere la terminazione Rho-dipendente, in cui la proteina Rho si lega a una sequenza ricca di citosine e povera di G, che è priva di strutture secondarie ed è coinvolta nel distacco dell'enzima.

chiamata sito di utilizzo di rho. Questa usando ATP si muove indirezione 5'→ 3' come un'elicasi, raggiunge l'RNA-polimerasi, la dissocia e poi separa l'ibrido DNA-RNA. Quando si ha sul DNA una mutazione non senso ed i ribosomi si distaccano precocemente Rho può accedere alla RNA-polimerasi e terminare prematuramente la trascrizione.

REGOLAZIONEi batteri sono particolarmente sensibili alle molecole presenti nel terreno di cultura poiché esse possono fungere o come attivatori implicati nella regolazione positiva, contribuendo a incrementare il livello di trascrizione, oppure come repressori implicati nella regolazione negativa. In particolare il momento in cui esse agiscono è la fase iniziale della trascrizione, infatti influenzano il legame della RNA-polimerasi al promotore. Il repressore si lega a una sequenza chiamata operatore, che si può trovare sovrapposta o adiacente al promotore, mentre l'attivatore si lega con due domini:

Un gene interagisce con la RNA-polimerasi e l'altro riconosce una sequenza vicina al promotore promuovendo la formazione del complesso aperto e della isomerizzazione della molecola di RNA-polimerasi.

Nei procarioti i geni sono organizzati in operoni ovvero sono posti gli uni adiacenti agli altri e vengono trascritti in un unico mRNA che per questo motivo viene definito policistronico.

Un tipico operone in particolare è formato da: uno o più geni strutturali che codificano per delle proteine, un unico promotore che si trova a monte rispetto a tutti questi geni, un operatore sovrapposto o adiacente al promotore ed infine un gene regolatore che produce la proteina regolatrice ma che non viene considerato parte integrante dell'operone in quanto tale sequenza si può trovare anche dislocata in un punto del genoma lontano da esso.

Gli operoni possono essere di due tipi diversi: ci sono quelli inducibili e quelli reprimibili. I primi sono normalmente silenti e possono essere

indotti mentre gli altri sono normalmente attivi e possono essere repressi. → si può trovare dove è l'operatore con la tecnica del DNA footprint

Inoltre tali operoni possono essere soggetti a due diversi tipi di controllo: positivo e negativo e queste due modalità possono combinarsi indipendentemente con le due tipologie di operoni.

Nel caso del controllo positivo si ha una proteina trans-agente prodotta dal gene regolatore si lega a sequenze cis-agenti e promuove la trascrizione mentre nell'altro caso la proteina trans-agente si lega a sequenze cis-agenti per inibire la trascrizione. → OPERONE LAC (operone inducibile) = è soggetto a due meccanismi di regolazione :

1. regolazione negativa o specifica = l'operone lac è formato dai geni LacZ che codifica per l'enzima β galattosidasi, il gene LacY che codifica per una permeasi che consente l'ingresso di lattosio nella cellula e dal gene LacA che codifica per la

tiogalattoside-permeasi chetrasferisce un gruppo acetilico ai β galattosidi. A monte di essi troviamo il promotore, l'operatore ed infine molto più a monte il gene LacI che è un gene regolatore costitutivamente trascritto a partire da un proprio promotore. Esso codifica per un repressore che se legato all'operatore inibisce la trascrizione dei geni dell'operone Lac: in particolare con un dominio lega proprio la sequenza dell'operatore mentre l'altro lega le molecole segnale come lattosio e simili. L'induttore naturale è l'allolattosio, un analogo del lattosio e sottoprodotto della β galattosidasi, che si lega all'operatore favorendo la trascrizione. In assenza di esso il repressore si lega al repressore che non è più in grado di legare il DNA (le due teste alla livello della cerniera del repressore si inclinano e non possono più legarsi alla doppia elica) e inibisce la trascrizione. cI mutanti costitutivi

Lac producono una β galattosidasi funzionale ma non regolata dallapresenza/assenza dell'induttore. Di essi ne esistono due categorie: quelli che mappanoc cnell'operatore (O ) e quelli che mappano nel gene regolatore I (I ). In entrambi i casi ciò cheavviene è che viene impedito il legame del repressore all'operatore. Se però tali mutanti sipongono in parziale diploidia con una copia del tipo selvatico posta su un plasmiderispettivamente si avranno un fenotipo costitutivo e wild-type. Le mutazioni Oc infattiinteressano la sequenza nucleotidica dell'operatore ed esse hanno permesso di identificarel'operatore come un elemento che non funziona attraverso un prodotto genico ma solo inquanto capace di essere legato e riconosciuto dal repressore. In questo modo i genistrutturali adiacenti in questo tipo di mutazioni saranno espressi costitutivamente mentrequelli sul plasmide saranno regolati normalmente. L'operatore è definito

dominante in cis poiché controlla solo i geni strutturali a valle o adiacenti ad esso.

Le mutazioni LacI invece, portano alla mancanza della produzione del repressore attivo e in grado di riconoscere l'operatore; perciò se poste con il plasmide bastano i repressori funzionanti prodotti da quest'ultimo per riottenere un fenotipo wt. Esso viene definito dominante in trans in quanto con il suo repressore riesce a controllare i geni anche distanti sul genoma.

Il repressore Lac in particolare è una molecola dimerica in cui ciascun monomero è formato da: un dominio N-terminale o testa che si lega al DNA, un dominio centrale che contiene il sito di legame per l'induttore, una regione C-terminale che contiene una α-elica implicata nella formazione del tetramero con il quale il repressore lega due operatori. Il repressore si lega al DNA grazie alla presenza di un motivo detto elica-giro-elica che è formato da due α-eliche di cui una è

gami tra il DNA e le proteine è chiamata sito di legame. Durante l'interazione, l'elica di riconoscimento riconosce specifiche sequenze di nucleotidi nel DNA e si lega ad esse in modo preciso. Questo processo è fondamentale per regolare l'espressione genica e per il corretto funzionamento delle cellule. D'altra parte, l'elica stabilizzante si lega al DNA in modo non specifico e aiuta a mantenere la struttura tridimensionale del complesso DNA-proteina. Insieme, queste due eliche svolgono un ruolo cruciale nella regolazione dell'interazione tra DNA e proteine e nella corretta funzione cellulare.