Biologia molecolare - Appunti

Replicazione del DNA

La replicazione del DNA è il processo che sta alla base della trasmissione dell'informazione genetica. Può essere definito come il processo che è in grado di trasferire l’informazione genetica di un organismo alle cellule figlie create durante la duplicazione cellulare (fase M). Infatti, è il meccanismo molecolare che porta il DNA a produrre una copia di se stesso. In particolare, il modello di replicazione a cui si fa riferimento è il modello di replicazione semiconservativa.

Il modello semiconservativo

Secondo questo modello, la molecola di DNA che deve essere duplicata viene aperta, o meglio, le due eliche vengono separate in modo tale che singolarmente ognuna delle due eliche possa fungere da stampo per la sintesi di un nuovo filamento di DNA, complementare a quello stampo. Si chiama appunto semiconservativa perché ogni molecola figlia (di nuova formazione) mantiene una delle due eliche parentali.

Questo modello venne dimostrato dagli esperimenti fatti da Meselson-Stahl: M&S fecero crescere il batterio Escherichia coli in un terreno minimo in cui l’unica fonte di azoto era NH₄Cl (cloruro di ammonio). Così facendo, sostituirono al normale isotopo dell’azoto l’isotopo pesante ¹⁵N. Fecero questo in modo tale che tutti i composti delle cellule batteriche contenenti azoto, incluso quindi anche il DNA, contenessero ¹⁵N al posto di ¹⁴N.

Successivamente misero i batteri marcati con ¹⁵N in un terreno contenente solo ¹⁴N, e furono lasciati replicare. Dopo un ciclo di replicazione, misero il DNA di queste cellule in delle provette contenenti un gradiente di cloruro di cesio (che permette di separare il DNA in base alla densità) in cui le cellule coltivate per molte generazioni in ¹⁵N e in ¹⁴N forniscono le posizioni controllo per le bande pesanti e leggere. Così facendo, dopo un ciclo di replicazione, videro che tutto il DNA presentava una densità intermedia fra quella del DNA tutto ¹⁵N e quella del DNA tutto ¹⁴N.

Successivamente, invece, la seconda generazione produceva due bande, una di densità intermedia ed una leggera, ovvero metà del DNA era ancora di densità intermedia, mentre l’altra metà era tutta contenente ¹⁴N. Da questi esperimenti, M&S allora capirono che solo questo tipo di modello di replicazione semiconservativa poteva spiegare i risultati ottenuti con questo tipo di esperimento (ovvero una singola banda intermedia ¹⁵N / ¹⁴N dopo la prima generazione e una banda intermedia e una leggera, ovvero tutta ¹⁴N, dopo la seconda generazione).

Inoltre, attraverso questo esperimento furono quindi esclusi gli altri due modelli di replicazione del DNA, ovvero il modello dispersivo e il modello conservativo.

Inizio della replicazione

Parlare di replicazione significa parlare di un’unità di replicazione e di un’unità di trascrizione. In particolare, definiamo l’unità di replicazione: il replicone, ovvero l’unità di DNA coinvolta in un singolo evento di replicazione. Diciamo singolo evento perché ogni replicone deve essere replicato una ed una sola volta per ciclo cellulare, ovvero ogni replicone si attiva una volta sola per ciclo cellulare, e quindi questo significa che ci devono essere dei meccanismi che regolano questa replicazione unica per ciclo cellulare.

Infatti, il modello del replicone è caratterizzato da elementi di controllo necessari per la replicazione. Parlare di prereplicone significa identificare un punto di inizio, detta origine di replicazione, e un punto di terminazione della replicazione, chiamato terminazione della replicazione, oltre alle sequenze intermedie che stanno tra questi due punti iniziale e finale che saranno anch’esse replicate. Quindi possiamo dire che ogni replicone possiede un’origine e una terminazione.

Origine di replicazione

In particolare, vediamo che il genoma di E.coli (o meglio di tutti i procarioti) presenta un'unica origine di replicazione, e di conseguenza il suo intero genoma è un replicone. Invece, i genomi degli eucarioti presentano origini di replicazione multiple, per cui il singolo cromosoma eucariotico è frazionato o meglio è composto da altrettanti repliconi.

Attivazione dell’evento replicativo

Il primo evento che deve avvenire affinché il processo di replicazione abbia inizio è la selezione e attivazione dell’origine di replicazione. La replicazione non parte da un punto qualsiasi del cromosoma, ma ovviamente si deve identificare un punto ben preciso del cromosoma da cui far partire la replicazione. In particolare, questa identificazione avviene da parte di proteine regolatrici della replicazione (iniziatori) che riconoscono (selezionano) e attivano sequenze ben precise che si trovano all’interno dell’origine di replicazione (replicatore), in modo tale che si vada incontro a un processo iniziale di denaturazione locale, a livello proprio delle origini, affinché possano essere caricate le elicasi sui singoli filamenti e quindi possa dare inizio alle fasi successive della replicazione.

L'origine di replicazione, o replicatore, è un tratto di DNA che può presentarsi in un'unica copia e in più copie all’interno del genoma, che è deputato all’inizio della replicazione. È un tratto di DNA di circa 250 pb che se legato con qualunque genoma (DNA), conferisce a quest’ultimo la capacità di replicarsi autonomamente. Quindi è un tratto di DNA necessario e sufficiente affinché si possa andare incontro al processo di replicazione. Se non c’è questa origine di 250 pb (questo tratto di DNA), il genoma non può andare incontro a replicazione, mentre è sufficiente perché non serve altro.

Siti di legame per l’iniziatore

All’interno dell'origine di replicazione, sono inclusi sia siti di legame per l’iniziatore (sequenze di DNA di 1 o più proteine) sia siti di legame facilmente denaturabili. Sono delle sequenze speciali presenti a livello dell’origine di replicazione; in particolare, sono sequenze di 13 bp ripetute 3 volte e sequenze di 9 bp ripetute 4 volte. In particolare, sappiamo che le proteine iniziatrici cooperativamente vanno a riconoscere in prima istanza le sequenze di 9 bp e poi successivamente estendono questo processo di legame a quelle da 13 bp dove avverrà l’iniziale denaturazione.

Siti facilmente denaturabili

Sono sequenze del DNA che devono andare incontro a un processo di denaturazione iniziale, poiché a livello di queste sequenze, la doppia elica deve per la prima volta aprirsi (denaturarsi) in modo da permettere la separazione dei due filamenti, su cui potranno essere così caricate le elicasi. Questa iniziale denaturazione a livello di questi siti può avvenire più facilmente perché, come abbiamo detto, sono siti facilmente denaturabili, poiché proprio a livello di questi siti il DNA presenta un’abbondanza di appaiamenti e impilamenti di tipo A-T, rispetto a appaiamenti e impilamenti di tipo G-C.

In particolare, dalla struttura delle macromolecole, sappiamo che i diversi appaiamenti e impilamenti presentano una diversa disponibilità ad andare incontro a processi di separazione, perché le energie richieste per separare i vari tipi di appaiamenti e impilamenti sono sicuramente diverse. Infatti, appaiamenti di tipo A-T sono più semplici da separare perché sono tenuti insieme da solo due legami a H, per cui serve meno energia per separali rispetto ad appaiamenti di tipo G-C, che sono invece tenuti insieme da tre legami a H. Inoltre, gli impilamenti di tipo A-T saranno pure più semplici da separare poiché presentano forze di stacking inferiori rispetto ad impilamenti di tipo G-C.

Quindi, oltre alla regione dove si vanno a legare le proteine (siti di legame per l’iniziatore), se c’è anche a monte una regione particolarmente ricca di A-T, è chiaro che questa regione andrà più facilmente incontro a questo iniziale processo di denaturazione. In particolare, sappiamo che la regione ricca di appaiamenti e impilamenti di tipo A-T è presente a livello di quelle sequenze di 13 bp ripetute 3 volte.

Origine di replicazione nei vari organismi

In particolare, vediamo che l’origine di replicazione dei vari organismi può variare in grandezza:

• E.coli: presenta un’origine di replicazione lunga circa 245 bp detta oriC, con la presenza di novimeri (ripetuti 4 volte) e tredicimeri (ripetuti 3 volte); la lunghezza di questa origine è necessaria e sufficiente affinché il genoma vada incontro a replicazione. Da notare che l’origine minima è definita dalla distanza tra i membri più esterni delle ripetizioni di 13 bp e 9 bp.
• Virus SV40: presenta un’origine di replicazione lunga 65 bp, al cui interno ritroviamo le sequenze dette P ripetute 4 volte (siti di legame) formate da 5 bp, che sono il sito di attacco della proteina d’inizio T, e le sequenze ripetute palindrome di 20 bp dette EP (siti facilmente denaturabili).
• S.cerevisiae: presenta un’origine di replicazione lunga circa 100 bp, al cui interno ritroviamo sequenze B1 e A (siti di legame), sequenze B2 (siti facilmente denaturabili) e la sequenza B3.

In maniera generica viene rappresentato che la proteina iniziatrice va a riconoscere in prima istanza le sequenze da 9 bp (i novimeri) organizzando una superelica positiva. Questo avviene perché, in particolare, vediamo che questa proteina non è solo capace di fare interazione proteina-DNA ma è anche capace di fare interazione proteina-proteina, ovvero interazioni cooperative. Quindi, quando le prime proteine iniziatrici si sono legate ai novimeri, queste recluteranno cooperativamente tutta una serie di altre proteine (sempre dello stesso tipo), che andranno a formare una superficie toroidale su cui il DNA potrà così andare a formare una superelica positiva, ovvero potrà superavvolgersi in maniera positiva.

Dopodiché, in presenza di ATP (le proteine d’inizio legano ATP), queste proteine così organizzate estendono il loro legame anche alle sequenze di 13 bp (tredicimeri), provocando una denaturazione iniziale di circa 20 bp all’interno di questa regione ricca di A-T. Avvenuto ciò, avviene il distacco delle proteine iniziatrici dalle ripetizioni di 13 bp, in modo tale che quella quantità di ssDNA denaturato risulti libera affinché le elicasi potranno essere caricate, grazie a un caricatore (proteina), su entrambi i filamenti ormai così separati.

Elicasi e loro attivazione

Dobbiamo fare attenzione tuttavia al fatto che le elicasi non devono essere attive nel nucleoplasma ma devono attivarsi solamente nel momento in cui risultano legate con i singoli filamenti. Infatti, il legame del caricatore (delle elicasi) con le elicasi mantiene le elicasi stesse in uno stato inattivo, fin quando il caricatore, caricate le elicasi sui filamenti, si staccherà da queste ultime a causa di una modifica conformazionale indotta dall’idrolisi dell’ATP, provocando così l’attivazione delle elicasi. In questo modo, le elicasi scorreranno, ognuna su un singolo filamento, in direzione 5→3 all’interno della bolla, posizionandosi su ognuna delle due forche.

Meccanismi di regolazione della replicazione in procarioti

Il processo che sta alla base di questa iniziale denaturazione a livello dei tredicimeri va osservato dal punto di vista topologico. In particolare, il legame di queste proteine iniziatrici causa una modifica topologica del DNA, ovvero agisce a livello della topologia del DNA. Quindi, essendo all’interno di un dominio topologico, ovvero non variando il numero di legame poiché a questo livello non agisce nessun tipo di topoisomerasi, allora sicuramente vengono variati i parametri geometrici.

In particolare, il parametro geometrico che viene inizialmente modificato è il Wright (che è quel parametro geometrico che determina la formazione di super elica) perché il DNA si superavvolge positivamente attorno a quella superficie toroidale creata dall’unione cooperativa delle proteine iniziatrici. Quindi, ovviamente, sapendo che se c’è una superelica positiva, ovvero che il Wright è variato in positivo di una certa quantità, è chiaro che per mantenere costante il numero di legame (parametro topologico), ci deve essere una variazione compensativa di quel secondo parametro, Twist, che insieme al Wright definiscono il numero di legame.

Quindi, il Twist (grado di avvolgimento del DNA), a fronte di una super elica positiva, ovvero di una variazione positiva del Wright, diminuirà, provocando così lo svolgimento iniziale di questo DNA, a livello dei tredicimeri (regione ricca di A-T), e così facendo creando una regione di DNA a singolo filamento che permetterà il caricamento delle elicasi, che a questo punto potranno andare a svolgere il mestiere di estendere la bolla di replicazione.

Iniziatore

L’iniziatore può essere una singola proteina oppure un complesso proteico che vanno a riconoscere in maniera specifica l’origine di replicazione (in particolare in prima istanza i novimeri) in modo tale che possa iniziare l’attivazione dell’evento replicativo. In particolare, sappiamo che la proteina iniziatore di E.coli è un complesso proteico formato da diverse proteina DnaA.

Mentre la proteina iniziatore degli eucarioti (S.Cerevisiae) è una proteina complessa esamerica ORC, che poi vedremo avere una funzione e un meccanismo leggermente diverso rispetto alla DnaA. Da notare che l’iniziatore è la sola proteina sequenza-specifica coinvolta nell’inizio della replicazione. Altre proteine implicate in questa fase non legano specificatamente delle sequenze del DNA, ma sono reclutate dal replicatore mediante una combinazione di interazioni proteina-proteina e per affinità verso specifiche strutture che si creano sul DNA (per esempio ssDNA o giunzioni innesco-stampo).

Modello dell’inizio della replicazione in E.coli

Il primo evento che deve avvenire affinché si verifichi l’inizio della replicazione in E.coli è ovviamente la selezione e attivazione dell’origine di replicazione chiamato Ori C, che qui avviene da parte di una proteina (iniziatore) detta Proteina Dna A. In realtà, questo iniziatore non è un'unica proteina ma è per lo più un complesso proteico formato solo inizialmente da 4-5 molecole di DnaA, che una volta legate ai siti di legame dell’origine, in particolare ai novimeri (sequenze di 9 bp ripetute 4 volte), richiamano cooperativamente altre molecole di DnaA poiché oltre ai legami proteina-DNA sanno pure effettuare legami proteina-proteina.

In questo modo, richiamo cooperativamente queste stesse altre molecole, organizzano una superficie toroidale, su cui il DNA stesso si può andare a superavvolgere positivamente, creando così un superelica positiva. Successivamente, in presenza di ATP, questo complesso proteico d’inizio (Dna A) va a legare anche i tredicimeri, ovvero le 3 ripetizioni delle 13 bp, provocando così una denaturazione iniziale di circa 20 bp all’interno di questa regione ricca in A-T, che non è altro che la regione dove si trovano i tredicimeri.

Dopodiché, grazie all’idrolisi dell’ATP (viene convertito in ADP), avviene il distacco delle proteine regolatrici dai tredicimeri (rip di 13 bp), in modo tale che quella quantità di ssDNA denaturato risulti libera affinché possano essere caricate le elicasi (Dna B), attraverso il loro caricatore (Dna C). Da notare che sia Dna B (elicasi) che Dna C (caricatore dell’elicasi) sono dei complessi esamerici. In particolare, le elicasi devono essere attive solo una volta caricate sui filamenti di DNA appena denaturato e non devono esserlo già nel nucleoplasma, per cui proprio l’unione del caricatore con le elicasi rende queste ultime inattive.

L’attivazione delle elicasi quindi potrà avvenire solamente quando, una volta che sono state caricate sui singoli filamenti, il caricatore, attraverso una modifica conformazionale indotta dall’idrolisi dell’ATP, si staccherà rendendo le elicasi finalmente attive, e libere di poter scorrere sui filamenti, ognuna in direzione 5→3 all’interno della bolla, posizionandosi su ognuna delle due forche.

Quante volte per ciclo cellulare devono essere attivate le origini?

Affinché la cellula vada incontro ad un singolo evento di duplicazione e alla successiva separazione delle molecole figlie (di DNA) nelle rispettive cellule figlie, ovviamente le origini devono essere attivate una e una sola volta per ciclo cellulare, poiché non possiamo andare incontro a fenomeno di poliploidia che produrrebbe gravi danni alle cellule figlie.

Sapendo ciò, allora si è capito che devono esistere particolari meccanismi che regolano e controllano che questa attivazione avvenga una e una sola volta per ciclo cellulare. Nei procarioti, in particolare in E.coli, uno di questi meccanismi di controllo della replicazione sfrutta i cambiamenti dello stato di metilazione del DNA a livello delle origini, prima e dopo la replicazione. In particolare, sappiamo che esistono degli enzimi chiamati DAM-metilasi (metil-trasferasi Dam) che aggiungono un gruppo metile o alle citosine (metil-citosine) o alle adenine (metil-adenine), solo dopo però che esse sono state inglobate nel nuovo filamento.