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05/04/18

L’attacco dei microtubuli proveniente dai poli opposti ai cromatidi fratelli viene definito come amfitelico,

anche se l’attacco più frequente è quello monotelico. Si possono avere anche attacchi sbagliati come

nell’attacco sintelico e merotelico dove si ha l’attacco di un microtubulo al cromatidio sbagliato. In questi

attacchi, il kinetocore non è sottoposto a tensione e sono resi instabili grazie alla presenza dell’aurora B,

portando il microtubulo a staccarsi dai kinetocori e fornendo la possibilità di ottenere ad un attacco

amfitelico. Si è visto che se una cellula viene trattata con un agente che impedisce la separazione del

centrosoma, e si forma un fuso monopolare e si rimuove il farmaco che impedisce la migrazione del

centrosoma, il centrosoma migra al polo opposto e si forma un fuso corretto dove tutti i cromatidi fratelli

sono legati ai poli opposti del fuso, ma se anche aurora B è inibita si hanno degli attacchi scorretti. Aurora

B promuove la fosforilazione di Dam1 e Ncdc80 promuovendo un attacco stabile al kinetocore.

Tensione

Nel momento in cui i due cromatidi fratelli ricevono i microtubuli dai poli opposti, si staccano dovuto allo

sviluppo della tensione. Questa è dovuta a delle proteine, come Sli15 con struttura testa-coda. Sli15 inibisce

l’aurora chinasi la quale fosforila l’anello Dam1 e rende l’attacco del microtubulo instabile. Quando anche

l’altro kinetocore del cromatidio fratello è attaccato da un altro microtubulo, i due kinetocori si allontanano

e l’aurora B si inattiva. Gli attacchi instabili vengono rimossi grazie all’attività di aurora B che diventa attiva

e fosforila diversi substrati, come Dam1 e il microtubulo si “sfila” dall’anello Dam1 e dal kinetocore. Questo

offre la possibilità ad altri microtubuli di inserirsi nel kinetocore in modo da sviluppare la corretta tensione.

Man mano che procede la mitosi, i centrosomi iniziano a spostarsi verso il cortex della membrana plasmatica

e pongono i due cromatidi fratelli sotto tensione che inattiva aurora B e il legame con il microtubulo è di tipo

stabile e non si staccano più. In un attacco merotelico i microtubuli provengono da un’estremità del fuso

mitotico e contattano il cinetocore sbagliato. Ancora non si sa come la cellula sia in grado di capire che vi è

un attacco errato. Viene risolto sia prima dell’anafase che durante l’anafase. In genere è un singolo

microtubulo attaccato scorrettamente, mentre quelli corretti sono più di uno. Aurora B assieme a dei fattori

di catastrofe (chinesina 13 e MCAK) portano al distacco e depolimerizzazione dei microtubuli scorrettamente

attaccati. I microtubuli legati al kinetocore sono strutture estremamente dinamici, dove all’estremità

positiva si assiste alla polimerizzazione/depolimerizzazione, dove la polimerizzazione permette il movimento

verso la piastra metafasica. Il complesso Dam1 rimane sempre attaccato al microtubulo, solo se l’attacco è

corretto, garantendo l’avanzamento in mitosi e l’anafase. Durante la metafase, si possono verificare dei flussi

di tubulina lungo i microtubuli, che portano una continua aggiunta di alfa-beta tubulina all’estremità positiva

e una diminuzione di alfabeta tubulina all’estremità negativa. Aggiungendo dimeri di alfa-beta tubulina

fluorescenti, si vede che quando si ha il fuso mitotico bloccato in metafase, questi migrano verso l’estremità

negativa. La velocità di questo flusso viene regolata durante la mitosi e in metafase si assiste ad una rapida

aggiunta di alfa-beta tubulina all’estremità positiva rispetto alla depolimerizzazione. All’inizio dell’anafase si

ha una polimerizzazione che è più lenta della depolimerizzazione portando ad un accorciamento dei

microtubuli. Al completamento della mitosi, quando tutti i cromatidi fratelli sono attaccati dai poli opposti

del fuso, la cellula può entrare in anafase, con l’attivazione dell’APC-cdc20, attivata dalle cicline mitotiche,

che però non è pienamente attiva finché non si ha il corretto allineamento dei cromatidi fratelli sulla piastra

metafasica e la corretta tensione. L’ACPcdc20 porta alla distruzione della securina, portando all’attivazione

della separasi che degrada Scc1, l’anello delle coesine si apre e si ha la separazione dei cromatidi fratelli. Le

CDK non sono più attive perché le cicline vengono degradate dall’APC e si ha la defosforilazione di una serie

di substrati che sono essenziali per la migrazione dei cromatidi fratelli ai poli e per tutti gli eventi successivi

della mitosi. Gli eventi successivi sono l’allungamento finale dello spindle, la separazione dello spindle stesso

e la citochinesi. L’APC-cdc20 porta alla degradazione della ciclina A in prometafase, ma non degrada la

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securina o la ciclina B1 perché si ha l’attivazione dello spindle assembly checkpoint che rimane attivo fino a

quando tutti i cromosomi non sono presenti sulla piastra metafasica. Durante la profase cdc20 è inibito da

Emi1 e impedisce che cdc20 leghi i substrati. Quindi, il complesso APC-cdc20 si forma all’inizio della profase,

ma questo non è attivo a causa dell’azione di Emi1, che però viene fosforilata da M-cdk e dalla Plk e si assiste

alla sua degradazione. Cdc20 è mantenuto inattivo in quanto viene fosforilato da una proteina dello spindle

checkpoint, Mad2, in modo che si abbia solo l’attività del APC-cdc20 nel momento in cui si deve entrare in

anafase. finchè si hanno attacchi scorretti a livello del chinetocore e non si ha una corretta tensione, lo

spindle assembly checkpoint è attivo. Una volta ottenuta la corretta ativvazione del complesso APC-cdc20 si

asssite alla degradazione delle cicline, all’apertura delle coesine grazie alla separasi e alla distruzione della

securina. SAC inibisce in modo specifico l’attività dell’ACP e durante l’anafase Cdc20 viene sostituita da Cdh1,

dopo la defosforilazione di APC. APC-Cdh1 presenta diversi susbtrati come Plk1, Aurora A e Cdc20.

Spindle assembly checkpoint

Lo spindle assembly checkpoint è un meccanismo di controllo del ciclo cellulare molto conservato nei vari

organismi. Anche la singola copia di cromatidi fratelli non correttamente assemblati attiva lo spindle

assembly checkpoint. Le proteine MAD, implicate in questo checkpoint, se KO portano a letali embrionali.

Mutanti Mad in presenza di benomyl muoiono in quanto si hanno cellule senza cromosomi. In S. cerevisiae,

i mutanti Mad crescono in maniera normale, ma si ha un’incapacità di controllare la mitosi in presenza di

agenti che danneggiano i microtubuli. Sono stati trovati anche diversi omologhi in mammiferi, che portano

alla formazione del MCC, mitotic checkpoint, dove si ha la presenza di qualche fattore diffusibile che inibisce

l’APC-cdc20. Il mitotic checkpoint all’inizio della prometafase, quando i vari kinetocori vengono legati dai

due diversi poli del fuso, genera un segnale dall’allarme che blocca l’APC-cdc20 e man mano che sempre più

cromatidi fratelli sono legati dai poli opposti del fuso, l’inibitore dell’APC-cdc20 diminuisce la sua inibizione,

si assiste ad una graduale diminuzione del MCC e si ha il segnale in anafase solo se tutti i cromatidi fratelli

sono legati ai poli opposti del fuso. La proteina responsabile dell’inibizione di cdc-20 è Mad2 che si localizza

a livello dei kinetocori non legati da microtubuli che provengono dai poli opposti del fuso. Mad2 è una

proteina che è frequentemente mutata nei tumori e ha una struttura costituita da una serie di beta-sheet

che la portano a ripiegarsi su se stessa e ha una zona C-t che viene definita come “cintura di sicurezza”

costituta da due beta-sheet che si possono aprire e chiudere. Quando chiusi sono strettamente adesi alla

proteina, quando sono aperti formano una tasca che può legare i substrati e successivamente chiudersi in

modo da immobilizzare i substrati. La chiusura prevede il contatto con una porzione diversa di Mad2 stesso,

passa quindi a due conformazioni diverse: open dove non è legato al substrato (OMad2) e una close dove

Mad2 è legato al substrato (C-Mad2). I substrati di Mad2 sono Mad1 (proteina dell’outer kinetocore e dello

spindle assembly checkoint) e cdc20. Quando Mad2 è nella close conformation e blocca cdc20, l’APC non è

attiva. Mad2 lega sia Mad1 sia Cdc20 ed è in grado di dimerizzare. nel momento in cui il kinetocore non è

attaccato o sottoposto a tensione, Mad1 è sul kinetocore al quale si lega Mad2 in una conformazione chiusa.

Ma vi è anche Mad2 solubile attorno al kinetocore e dimerizza. La dimerizzazione di Mad2 porta ad una certa

apertura della tasca che immobilizza i substrati e Mad1 legato a Mad2 e si ha anche un’altra molecola di

Mad2 che è pronta ad accoglierei Cdc20 e lo sequestra. Una volta passata nella conformazione close, si stacca

ed è pronta a formare un altro dimero che può sequestrare cdc20. Il passaggio dalla conformazione close a

quella open avviene grazie alla dimerizzazione. Questo processo va avanti fino a quando tutto il cdc20 non

viene sequestrato. Questo avviene a livello dell’outer kinetocore, dove si ha il network KMN, e

rappresentano la piattaforma proteica che legano Mad1. Mad1 viene sequestrato dal kinetocore quando si

supera lo spindle checkpoint, ma si assiste anche alla rimozione di Mad2 grazie alle dineine. Nel momento

in cui il kinetocore è sottoposto a tensione dai poli, lo spindel assembly checkpoint viene spento portando

via il suo inibitore Mad2. APC-cdc20 diventa attiva e degrada la securina e si attiva la separasi. Delezioni della

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securina, in condizioni di crescita non da grossi problemi, ma combinando questa delezione con quella del

cdc20 si ha la separazione dei cromatidi fratelli ma si ha un arresto in APC. La separasi è inibita dalla securina

ma anche dalla M-CDK e per avere la sua completa attivazione vi deve essere la distruzione delle cicline oltre

che della cdc20. La fosforilazione della separasi la rende pienamente attiva e porta al taglio di Scc1, portando

alla separazione dei cromatidi fratelli. In S. cerevisiae si ha ancora un altro network che serve per attivare e

permettere l’uscita della mitosi, definito come MEN mitotic exit network, che porta all’attivazione di una

fosfatasi, cdc14. Questa fosfatasi, fino all’anafase è sequestrata e inattiva nel nucleolo e viene attivata solo

in anafase. Serve a defosforilare una serie di substrati della CDK e permettere l’uscita dalla mitosi e l’entrata

in G1. Cdc14 è legata ad una proteina che la sequestra nel nucleolo, ed è la separasi che taglia questa

proteina e rende cdc14 libera che viene inizialmente attivata dalla plk e inizia ad essere parzialmente attiva

e grazie al netwrok viene completamente attivata. Il network ha come protagonista una GTPasi, Tem1, che

viene attivata da Lte1, mentre viene inattivata da Bub2. Questo network permette a S.cerrevisiae di

controllare la posizione dello spindle, che se è formato correttamente porta all’attivazione della GTPasi che

promuove la fosforilazione di Cdc15 che fosforila Dbf12 che porta alla completa attivazione di Cdc14,

mediante un meccanismo definito come SPOC. Infatti, Lte1 si trova vicino alla gemma ed è l’attivatore della

GTPasi, mentre A livello dei kinetocori della madre si ha Bub2, che è l’inibitore della GTPasi. Questo

meccanismo è stato trovato anche negli eucarioti superiori ogni qualvolta si deve avere una divisione

asimmetrica delle cellule figlie, soprattutto durante lo sviluppo embrionale di drosophila, ma anche in cellule

staminali.

Chinesina 5 spinge i centrosomi allontanandoli; la dineina si lega all’estremità positiva dei microtubuli astrali

e spinge i centrosomi ai poli opposti della cellula. Quando si hanno tutti i cromatidi fratelli allineati, lo spindle

allungato che pone in tensione i kinetocori e nel momento in cui SAC viene inattivato, si ha il passaggio in

anafase e si ha la catastrofe dei microtubuli che vengono velocemente depolimerizzati a livello dell’estremità

positiva e i cromatidi fratelli, in tempi molto rapidi, raggiungono le estremità opposte della cellula. Tutte le

proteine importanti per la mitosi si accumulano a livello della mid-zone. Le varie cicline in mammifero

presentano dei ruoli diversi, creando delle versioni stabili e non più degradabili:

- ciclina A deve essere degradata per la transizione metafase-anafase

- ciclina B deve essere degradata per permettere il passaggio in anafase B

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Telofase

APC-cdc20 degrada securina e ciclina e si assiste alla defosforilazione di tutti i substrati delle CDK grazie ad

una serie di fosfatasi che vengono attivate in anafase come cdc14. In telofase, i cromatidi fratelli sono ai poli

opposti delle cellule e si deve avere il disassemblaggio del fuso mitotico, la decondensazione dei cromosomi

attorno ai quali deve ri-assemblarsi la membrana nucleare e la formazione di due nuclei separati e la

citochinesi, ossia la separazione fisica delle due cellule figlie. APC-cdh1 degrada una serie di substrati che

sono necessari per i punti inibitori.

In tutti gli eucarioti vengono degradate le proteine che stabilizzano i microtubuli, come Ase1 che è un target

di APC-cdh1 che viene degradata in telofase ed è una proteina che stabilizza la + end, per cui quando viene

degradata si ha un acceleramento della depolimerizzazione e il disassemblaggio del microtubulo. Cdc15 è

una delle proteine che porta alla piena attivazione della cdc14 e all’attivazione del MEN component. Sono

stati condotti esperimenti con cdc15 mutanti termosensibili, e ad una temperatura non permissiva le cellule

si bloccano con un lungo fuso mentre in assenza di Ase1 non si ha un fuso stabile. In assenza di Ase1 non si

ha la formazione di un fuso stabile ma la depolimerizzazione del fuso. Un altro esperimento condotto,

utilizzando un ceppo di lievito che non è più degradabile dall’APC-cdh1 si ha sia cdc15ts stabile e Ase1 stabile

si ha una depolimerizzazione più lenta e un disassemblamento più lento. Negli eucarioti superiori, per avere

la depolimerizzazione è necessario che APC-cdh1 inattivi Plk1, aurora A e CENP-E (motor protein) essenziale

per l’attacco dei microtubuli al chinetocore. La degradazione di questi fattori porta al dissasemblamento del

fuso mitotico in telofase. Inoltre, in telofase, si deve avere la ricostituzione della membrana nucleare attorno

ai cromosomi che decondensano, a seguito della degradazione delle condensine ad opera di APC-cdch1.

Grazie ad eventi di defosforilazione, ad esempio sulla laminina e Ran-GTP che è attorno ai cromosomi, si

assiste all’induzione della formazione della membrana nucleare.

Citochinesi

In s. cerevisiae si ha la formazione della gemma, che inizia a formarsi dopo lo start, che in questa fase si

stacca. In s. pombe si ha la formazione di un setto che divide le cellule figlie e oltre alla separazione delle

cellule si ha la deposizione di membrana citoplasmatica e parete cellulare tra le due cellule figlie. In tutti gli

organismi eucarioti, le due cellule figlie iniziano a dividersi mediante un solco di divisione, cleavage furrow,

costituito da un anello interno di actina e miosina che si stringe progressivamente che porta alla separazione

delle due cellule figlie. La separazione nei lieviti viene decisa già prima dell’anafase, in s. cerevisiae, nel punto

in cui si forma la gemma, grazie alla formazione di un deposito precoce si sa già dove sarà il punto di divsione.

In Pombe il punto di divisione viene deciso in metafase e corrisponde al punto dove di trova il nucleo. Negli

eucarioti superiori, il piano di divisione viene deciso in tarda anafase, ma in realtà non si sa nei dettagli come

viene deciso il punto di divisione tra le due cellule. In tutti i casi, questo solco di divisione è dovuto alla

presenza di microfilamenti di actina e miosina 2 (non-muscolare). L’actina è costituita da monomeri che si

assemblano a formare un filamento elicoidale che si avvolgono e si ha un’estremità dove si assembla l’actina

e un’estremità di depolimerizzazione e vengono definite come barbed-end e pointed-end. La barbed-end si

attacca alla membrana cellulare mentre la pointed-end si lega ai filamenti di miosina 2, che è costituita da

due catene pesanti, dove ciascuna catena pesante lega due catene leggere. La miosina presenta un motor

domain all’N-t e un lungo dominio coild-coil in modo che le due molecole pesanti della miosina si avvolgano

su sé stesse. Più molecole di miosina si assemblano a costituire il filamento spesso, che si distingue dal

filamento fine costituito dall’actina. È un filamento bipolare con la presenza di motor domain da entrambi i

lati. Grazie ai motor domain scorre sull’actina. In citochinesi, il legame da parte del filamento di miosina sui

filamenti provenienti dai lati opposti della cellula e i movimenti del motor domain sulla barbed-end porta al

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ristringimento del solco e alla separazione delle cellule figlie. I filamenti di actina sono presenti su tutta la

circonferenza della cellula e ciascuno, a livello dei sic domain è legato in diversi punti della cellula, e seguirà

la contrazione con la successiva separazione delle cellule figlie. I filamenti di actina e miosina sono molto

conservati in tutti gli eucarioti e sono anche conservate proteine come la formina, la profilina e la cofilina

che sono proteina essenziale per il metabolismo dell’actina dove la formina aiuta alla polimerizzazione

dell’actina e porta alla formazione dei microfilamenti. La porfillina lega i monomeri di actina e aiuta il loro

caricamento sulla parte end, legando anche la formina e pertanto formina e profilina hanno attività di

polimerizzazione sul filamento di actina. La cofillina invece depolimerizza l’actina. Tutte queste proteine

vengono attivate in diversi momenti della citochinesi. Per la formazione dell’anello contrattile si ha dapprima

l’azione di formina e profillina e una volta che le cellule figlie si sono formate si ha l’azione della cofillina. In

s. cervesiae si ha la deposizione dell’anello si septine che sono GTPasi essenziali per l’assemblaggio della

cellula e vengono fosforilate dalle cdk-G1/S. in tarda G1 e inizio S si hanno i filamenti di misiona che vengono

depositati in corrispondenza dell’anello di septine GTPasi essensiali per indicare alla cellula dove formare la

gemma. Le septine vengono depositate al passaggio dello start evengono fosforilate dalla CDK g1/S. in tarda

fase G1 e inizio fase S si hanno i filamenti spessi di miosina che vengono depositati in corrispondenza

dell’anello di septine. Le clib-cdk permettono l’accrescimento della gemma, con anche Lte1 che viene a

localizzarsi in corrispondenza della gemma. Solo in tarda anafase si ha l’attivazione di IQ GAP che viene

richiesta per l’attivazione dell’anello di actina.

In pombe, l’anello viene posto in corrispondenza del nucleo, in tarda fase g2 e inizio profase. Il responsabile

della deposizione è mid1. In anafase si ha la formazione dell’anello di actina e miosina che porta alla

separazione delle due cellule figlie. Quando mid1 si trova tutto attorno al nucleo, se si centrifugano le cellule

di pombe, si è visto che l’anello porta ad un segnale di divisione della cellula. Se la centrifugazione avviene

prima della fase G2 del ciclo cellulare, ossia prima della deposizione di mid1, si nota che il nucleo è

leggermente spostato, si ha la formazione di un corto spindle e l’anello contrattile è spostato, ma in

corrispondenza del nucleo. Se la centrifugazione della cellula avviene in metafase, dopo che mid1 ha formato

l’anello e si è iniziata la deposizione della miosina 2, il fuso si forma, ma l’anello risulta spostato rispetto alla

posizione del nucleo. -> è mid 1 a determinare il segnale. Questi meccanismi non sono molto conservati negli

eucarioti superiori e sembrerebbero esserci più pathways paralleli, che partono dai microtubuli astrali e

convergono verso la cellula e una deposizione sui microfilamenti di actina e miosina. Quando si ha il

disassemblaggio del fuso mitotico, una serie di microtubuli interpolari formano un concentrato di

microtubuli con polarità opposta che provenivano dai poli opposti del fuso e sono gli ultimi che rimangono

fino alla fine della telofase. Questa banda di microtubuli sembra che diano un segnale positivo per la

deposizione dell’anello contrattile. Sembrerebbero esserci delle proteine che si accumulano assieme alla

dineina all’estremità positiva dei microtubuli astrali, ai poli delle due cellule, che portano ad un segnale

negativo che impediscono la deposizione dei filamenti di actina e portano alla formazione dell’anello

contrattile al centro della cellula. I mitocondri, che vengono segregati nelle cellule figlie, seguono un

processo particolare, dove vengono immobilizzati e si fondono cambiando la propria morfologia per poter

essere segregati in modo corretto.

Meiosi

Da una cellula diploidi si ottengono gameti aploidi, che vanno incontro a riarrangiamenti dei geni e la fusione

dei gameti porta alla formazione dell’organismo diploide. La meiosi presenta una fase S più lunga del solito

dove i cromosomi omologhi si appaiano grazie al synaptonemal-complex. Durante la fase S abbiamo anche

eventi di crossing-over tra gli omologhi, che sono dovuti ad una rottura programmata mediata da una

nucleasi, spo11, che porta a dei tagli della doppia elica che vengono riparati mediante ricombinazione

omologa, utilizzando il cromosoma omologo come templato e si hanno degli eventi di crossing over con

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riarrangiamento di tutti i geni fiancheggianti. Durante la prima divisione meiotica abbiamo segregazione ai

poli opposti della cellula dei cromosomi omologhi. I due cromatidi fratelli, a livello del centromero mediante

gli anelli di coesina, rimangono uniti tra di loro. La cellula entra nella seconda divisione meiotica dove si

assiste alla segregazione dei cromatidi fratelli. L’organismo più studiato è stato s. cerevisiae. In omologia alla

mitosi si ha l’azione delle CDK uniti a cicline di fase S e M, si assiste all’alternanza di M-cdk e APC-cdc-20 che

permette l’entrata in fase meiotica e l’uscita. Vi sono dei fattori trascrizionali molto importanti che in risposta

ad alcuni stimoli permettono l’inizio del programma meiotico e portano alla trascrizione di geni meiotici

(early, middle and late) che consentono questa divisione molto particolare che deve essere unica. Tra questi

fattori trascrizionali Ime1 viene trascritto e tradotto in G1 in due condizioni: se la cellula è diploide e se si ha

la carenza di nutrienti nel mezzo. Serve per la trascrizione di una serie di geni meiotici early, come Ime2 che

è una chinasi che porta all’accumulo di ciclina G1-s e all’accumulo di S-CDK e portano alla fase S meiotica che

è molto lunga. Si deve avere non solo sintesi del DNA ma anche eventi di crossing-over. Si attiva un altro ft

ndt80 che permette l’attivazione delle M-CDK e l’inizio della segregazione degli omologhi che avviene nel

momento in cui si attiva APC-cdc20 che degrada le cicline e degrada anche alcune proteine del

synaptonemal-complex e porta alla segregazione degli omologhi. Viene inattivato APC-cdc20 e la CDK ritorna

attiva legata a cicline miotiche di fase M che porta alla cellula a rientrare nella seconda fase meiotica dalla

quale esce grazie all’attivazione di APC-cdc20.

s. cerevisiae solo in presenza di ormoni prodotti dal sesso opposto porta alla formazione di cellule diploidi e

solo grazie all’assenza dei nutrienti nel mezzo di coltura, porta al blocco di clin3 e si ha l’entrata in meiosi.

Queste condizioni portano alla trascrizione di Ime1 che porta alla trascrizione dei geni early, tra cui una

chinasi che serve a fosforilare l’inibitore delle CDK, Sic1, permettendo l’entrata in fase S meiotica, che è una

fase S molto più lunga del normale (normalmente dura 30 minuto mentre la fase S meiotica dura circa 2h,

dove oltre a sintetizzare il DNA si ha l’appaiamento dei cromosomi omologhi e la ricombinazione omologa).

Se le riparazioni del DNA non avvengono in modo corretto non si ha l’inizio della meiosi, inoltre si è vista una

stretta correlazione tra la sintesi del DNA e la ricombinazione omologa dove una non può avvenire in

mancanza dell’altra. I middle meioic genes servono per sintetizzare Ime2, Clb1, Plk e Ndt80. Si innescano

anche dei loop positivisti in modo da procedere con la meiosi. Se il DNA non viene riparato in modo corretto

si ha l’attivazione di Wee1 che inibisce la CDK fino a quando i danni non vengono riparati.

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Genome stability

In assenza di eventi esterni che danneggiano il DNA, la cellula per mantenere il proprio genoma stabile deve

procedere in maniera corretta nel ciclo cellula e soprattutto deve replicare correttamente il DNA e segregarlo

correttamente nelle due cellule figlie. All’interno del genoma stesso vi sono zone fondamentali per

controllare la stabilità del genoma, come le origini di replicazione, le regioni centromeriche e i telomeri.

Telomeri

I telomeri sono le estremità naturali dei cromosomi lineari degli eucarioti e sono costituiti da sequenze di

DNA ripetute. È una struttura nucleo-proteica grazie alla presenza di proteine che legano queste sequenze e

proteggono i telomeri. Le varie sequenze ripetute sono sempre le stesse in tutte le cellule di un organismo e

cambia da organismo a organismo, ma vi sono delle caratteristiche che sono molto conservate in tutti gli

organismi eucarioti. Si ha infatti uno strand di guanina che è a singola elica. Si parla di una G-strand o G-tail.

I telomeri vengono sintetizzati dalla telomerasi, che sono contraddistinte dalla presenza di tante C. alcune

malattie ereditarie molto gravi sono dovute a disfunzioni telomeriche. I telomeri devono essere protetti:

1) per evitare che nucleasi (esonucleasi che degradano ad esempio il DNA virale) degradino il DNA

2) in quanto potrebbero essere visti dalla cellula come dei tagli al DNA che potrebbero attivare i DNA

damage response e innescare senescenza e apoptosi e la cellula cercherebbe anche di riparare questi

danni.

In S. cerevisiae si hanno sequenze TG e la lunghezza è molto variabile. La struttura dei telomeri è comunque

molto conservata da lievito all’uomo. Si ha anche una regione subtelomerica, dove si hanno sequenze

ripetute e degenerate, mentre la sequenza che costituisce il vero e proprio telomero ha una doppia elica e

una G-tail che è 3’ protruding. La zona a singola elica è molto corta, tranne nei mammiferi può raggiungere i

100 nucleotidi. La zona in telomerica a doppia elica in s. cerevisiae è di 100-200pb. La lunghezza dei telomeri

nei mammiferi dipende dall’età della cellula. La

telomerasi è attiva, soprattuto nell’uomo, nelle cellule

embrionali e nelle cellule staminali, mentre in tutte le

cellule differenziate la telomerasi non è espressa. Queste

sequenze ripetute di natura diversa sono essenziali per il

metabolismo dei telomeri che sono importanti per

reclutare le proteine che proteggono i telomeri, le

shelterine, e reclutano la telomerasi stessa. I telomeri nei

mammiferi sono stati studiati nei topi. La presenza dei

telomeri ha funzione protettiva per impedire la

proliferazione incontrollata delle cellule. In assenza di

telomerasi si avrebbe un accorciamento progressivo dello

strand ritardato, dove l’ultimo frammento di okazaki

viene degradato e non si ha il riempimento dell’ultimo

frammento che porterebbe al continuo accorciamento

del DNA. La telomerasi, che è costituita da una

componente proteica e da una ad RNA, che serve da

templato per allungare il 3’ del telomero. È una

retrotrascrittasi, dove una porzione del suo RNA si appaia

all’estremità 3’ a singola elica del telomero e sintetizza

DNA usando come templato il suo RNA e si muove.

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Compie cicli continui di sintesi del DNA che portano a delle

corte ripetizione di sequenza, caratteristiche dei telomeri.

Quando il 3’ è sufficientemente lungo si può costruire un nuovo

frammento di okazaki e si può avere una nuova struttura a

doppia elica. La formazione della G-tail non rimane a singola

elica e invade la porzione a doppia elica del telomero e

costituisce una struttura a t-loop.

18/04/18

Nell’uomo il telomero alla nascita è molto lungo. Il T- loop serve alla cellula a proteggere il telomero stesso.

I cromosomi umani terminano in una serie di ripetizioni TTAGGG che varia in lunghezza. Prossimale alle

ripetizioni telomeriche è un segmento di ripetizioni degenerate e elementi subtelomerici ripetitivi. Il

capolinea dei telomeri contiene una sporgenza lunga del filamento a G. L'estremità 3 'non è definita con

precisione mentre la parte 5'> dei cromosomi umani ha quasi sempre la sequenza ATC-5 '. La zona di

invasione viene chiamata d-loop ed è una struttura identica al d-loop che viene a formarsi durante la

ricombinazione omologa.

Le shelterine proteggono questa zona in

modo che le nucleasi digeriscano e degradino

il telomero, e devono anche evitare che la

cellula vedano il telomero come un taglio al

DNA. Le shelterine sono costituite da diverse

subunità che legano sia la porzione ds DNA sia

la porzione ss. Legano la telomerasi e insieme

regolano la lunghezza dei telomeri e la loro

stabilità. Le subunità delle shelterine sono

molto conservate, TRF1 e TRF2 che legano il ds DNA, TPP1 lega la telomerasi, POT1 lega il ssDNA, rap1 ha

funzione strutturale. In s. cerevisiae si hanno sub diverse e cdc13 è fondamentale per legare il ssDNA. Questi

complessi in tutti gli eucarioti hanno un’importante funzione di protezione sia nei confronti della porzione

dsDNA che la porzione ssDNA. Hanno dei ruoli diversificato in quanto devono bloccare le nucleasi, regolano

la telomerasi e hanno un ruolo fondamentale nell’evitare che la cellula lo identifichi come un taglio e cerchi

di ripararlo oppure di dar luogo alla DNA damage response. Si ha una struttura molto complessa del

telomero, dove la g-tail invade il ds DNA e tutta la zona viene legata dalle shelterine dove POT1 lega il ds

DNA. Si è visto che man mano che le cellule somatiche umane vanno incontro a divisione, man mano si

accorcia il telomero. In uomo, il gene della telomerasi viene spento nel momento in cui le cellule iniziano il

differenziamento. Il gene della telomerasi, nell’uomo, è espresso negli embrioni e nelle cellule staminali. Le

cellule che non esprimono la telomerasi, divisione dopo divisione, accorciano i telomeri e questo processo

si verifica con l’invecchiamento, ma anche nelle cellule in coltura. Cellule vecchie di una persona anziana

presentano telomeri corti e il complesso dello shelterine non riesce più a legarsi ai telomeri e si attiva la

cascata di attivazione del segnale attivata dal danno al DNA, segue l’arresto del ciclo cellulare e senescenza

delle cellule. Questo processo può essere visto come un meccanismo per limitare il numero di divisioni delle

cellule differenziate, che dopo un numero di divisioni vanno incontro alla senescenza. L’importanza del

41

complesso delle shelterine è rivelato anche da esperimenti condotti su topo, mediante KO condizionali dei

geni per le shelterine, e si è visto che le cellule attivano il DNA damage checkpoint, dove delle chinasi apicali

attivano una cascata di trasduzione del segnale che attiva una serie di altre chinasi per amplificare il segnale

e il target finale sono le CDK, con la loro inibizione, soprattuto cdc25 e l’attivazione degli inibitori p21 e p27.

ATM si attiva quando si ha un taglio della doppia elica del DNA, quando invece si ha un ss DNA si ha

l’attivazione di un’altra chinasi, ATR. Quando si attivano queste chinasi si ha l’attivazione della cascata del

segnale con l’entrata in senescenza tramite l’attivazione di p53 e l’entrata anche in apoptosi. Il complesso

MRN si lega al dsDNA e attiva ATM che fosforila altre chinasi e gli effettori della cascata sono Cdc25 e p53,

che è un ft che serve a trascrivere p21 e p27. Quando si attiva il DNA damage checkpoint si ha il blocco del

ciclo cellulare. ATR invece, attivata da ssDNA, coperta da ssAPA. Se si ha una delezione di TRF2, sub della

shelterina che lega il dsDNA, il complesso si disassembla e si attiva ATM e si ha il blocco del ciclo cellulare.

Pertanto, i geni che codificano per le shelterine sono essenziali. Se si fa un KO di POT1, proteina che lega

ssDNA, il ssDNA è esposto e al posto di POT1 si lega RPA che porta all’attivazione del DNA checkpoint e porta

al blocco del ciclo cellulare. Se il blocco è prolungato questo porta a senescenza e apoptosi.

In assenza di shelterine, la cellula cerca di riparare il telomero, mediante diversi meccanismi:

- NHEJ: alcune proteine legano il dsB. È un processo abbastanza veloce ma anche mutagenico, in

quanto si hanno delle nucleasi che processano le estremità e creano delle piccole delezioni o

inserzioni di basi di 1 o due nt, causando anche citotossicità e cambiando il frame di lettura.

- Processamento del taglio a doppia elica: sono processi dannosi nella cellula, soprattuto se avvengo

nelle zone codificanti del DNA, in quanto ricercano zone di microomologia a monte o a valle della

cellula, che vengono tagliate e le nucleasi portano al taglio e al sigillamento del taglio. Vengono

chiamate il MMEJ e SSA, e differiscono per il tipo di proteine e per la quantità di basi che si appaiano.

Nel momento in cui si hanno due cromatidi fratelli appaiati, durante la fase s-g2 del ciclo cellulare, il

pathway che viene più seguito è la ricombinazione omologa, dove delle nucleasi procedono al taglio

alla doppia elica, il ssDNA viene esposto e mediante RAD51 (ricombinasi) lega il ssDNA e invade un

dsDNA e di capire se vi è omologia di sequenza tra il dsDNA e la donor sequence. Se si hanno cromatidi

fratelli, il cromatidio dove non è avvenuto il dsDNA serve da templato. La ricombinazione omologa è

un pathway che porta alla riparazione corretta senza alcuna mutazione del taglio alla doppia elica.

Ogni volta che la cellula ha dei telomeri non protetti la riparazione è sorgente di instabilità genomica. Se i

telomeri di due diversi cromosomi vengono uniti mediante NHEJ si ha la formazione di un cromosoma

dicentrico o di cromosomi con tantissimi centromeri.

Anche nel momento in cui agisce la ricombinazione omologa sul telomero, si ha la formazione della doppia-

hollyday junction che viene attivata dalle nucleasi, resolvasi, che tagliano il DNA in punti di scambio tra le

due zone di omologia e se avviene a livello del telomero, porta alla perdita di una porzione telomerica,

ottenendo un telomero tronco e corto e del DNA telomerico circolarmente chiuso. In assenza delle shelterine

si possono avere ricombinazioni omologa tra sequenze telomeriche non esattamente omologhe, perché

presentano comunque sequenze altamente ripetute. Si possono avere ricombinazioni tra telomeri di

cromatidi fratelli e non. Questo evento di ricombinazione porta alla formazione di cromosomi con lunghezza

dei telomeri molto variabile che risulta essere molto dannoso per la cellula. Si possono avere anche

ricombinazioni dove il g-tail DNA invade zone più a monte del telomero, con delezione terminale del

telomero e la perdita di DNA telomerico circolarmente chiuso, definito come Double Minute, perché nel

momento in cui si hanno danni ai metabolismi del telomero, il DNA viene circondato da micronuclei , dove il

DNA intrappolato è circolare e telomerico. 42

La telomerasi

La telomerasi è costituita da una porzione a RNA e da sub proteiche dove la più importante è la TERT nei

mammiferi che è la trascrittasi inversa. La telomerasi è conservata da lievito fino all’uomo, e nel lievito le

telomerasi vengono definite come EST even shorter telomers. Si hanno subunità che stabilizzano la

telomerasi come la diskerina. La componente a RNA fornisce il templato che si annila parzialmente

all’estremità 3’ del telomero, che serva alla telomerasi per sintetizzare del DNA e allungare il telomero.

L’azione della telomerasi è stata molto studiate nel lievito, dove è sempre attiva e agisce alla fine della fase

S, dove i telomeri sono molto corti e la G-tail è di 10-15nt. Nel lievito, la lunghezza dei telomeri è sempre

mantenuta ad una lunghezza precisa e regolata. Tutti i telomeri hanno un’estremità 30 protruding e durante

la replicazione del DNA si ha la replicazione totale del telomero e nei due cromatidi fratelli, uno avrà

un’estremità 3’ protruding e l’altro avrà un ds. Vi è quindi una nucleasi che processa il telomero, MRX, in

modo che vi sia sempre un’estremità 3’ protruding e possa invadere la regione ds e formare il t-loop. Nei

mammiferi il telomero è più lungo, come anche la G-tail (50nt). Si è visto che il complesso delle shelterine,

oltre a proteggere il telomero, ha un ruolo fondamentale nel regolare l’azione della telomerasi, perché da

un lato serve a reclutare la telomerasi e dall’altro, quando il telomero è lungo e ha molti complessi di

shelterine legati serve ad inibire la telomerasi stessa. Si è visto in lievito che se introduciamo dei cromosomi

artificiali, con telomeri molto lunghi e si analizza la lunghezza dei telomeri dopo divisioni successive e si

riporta il numero di cellule che hanno il cromosoma lungo, si vede che man mano il telomero si accorcia.

Viceversa, se si introduce in lievito un cromosoma artificiale con un telomero molto corto, dopo divisioni

successive, si vede che man mano il telomero si allunga fino a raggiungere una lunghezza media del telomero

che è la medesima di tutti gli altri telomeri di lievito. Questo rivela che l’attività della telomerasi in lievito è

estremamente regolata. Cdc13 lega il ssDNA e se mutato portato ad un fenotipo con telomeri molto corti.

Nel momento in cui il telomero si accorcia il complesso MRX riesce a legarsi al telomero, recluta la chinasi

apicale del DNA damage checkpoint ATM che fosforila cdc13 affinché recluti la telomerasi che arriva al

telomero e lo allunga. Si ha un lungo ssDNA e alla successiva fase S si assiste all’allungamento della porzione

dsDNA del telomero e più shelterine che si legano a questo livello, cdc13 si lega al ssDNA e non è più in grado

di reclutare la telomerasi. Questo permette a S.cerevisiae di reclutare la telomerasi nel sito in cui il telomero

è corto, mentre non si ha il reclutamento della telomerasi quando il telomero è lungo. Ciò permette di avere

i telomeri sempre della stessa lunghezza.

Regolazione della telomerasi in lievito

• mutante cdc13 ha unfenotipo est (even shorter telomeres)

• Cdc13 lega G tail

• Cdc13-P da Tel1 recluta Est1,telomerasi

• Rap1 lega dsDNA e reclutagli inibitori Rif1 e Rif2

• Rif1 e Rif2 inibiscono la telomerasi in maniera indipendente

Negli eucarioti superiori, alcune

sub del complesso delle

shelterine, come TPP1 che lega

TERT servono a reclutare la

telomerasi. POT1 è un inibitore

della telomerasi, che inibisce sia

l’attività catalitica, sia legandosi

fisicamente al dsDNA impedendo

l’anilamento della telomerasi.

Anche nelle cellule staminali embrionali e anche in topo il gene TERT è sempre espresso. Anche in uomo si

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ha il doppio ruolo delle shelterine sia nel reclutare la telomerasi sia nell’inibirla. Funzione essenziale del

complesso delle shelterine, mediante KO delle varie sub in topo, come KO di TRF2 si accende ATM, KO di

POT1 attiva l’attività chinasica di ATR e si attivano i pathway di riparazione del dsDNA.

Il metabolsimo dei telomeri è strettamente legato al problema dell’invecchiamento, all’instabilità genomica

e all’insorgenza dei tumori. Nell’uomo la telomerasi non è espressa nelle cellule differenziate ed è un

meccanismo per prevenire l’insorgenza dei tumori in modo tale che le cellule facciano un numero finito di

divisioni. È un meccanismo pericoloso, in quanto nel momento in cui si hanno dei telomeri scoperti, si ha

grande instabilità genomica e se la cellula non riesce subito ad entrare in senescenza e a bloccare il ciclo

cellulare si può avere l’insorgenza di tumori. Le cellule tumorali, ai primi stadi di sviluppo del tumore, quando

si ha l’overespressione di oncogene e mutazione di un oncosoppressore, le cellule vanno in crisi e la pressione

selettiva delle cellule consiste nel riesprimere il gene della telomerasi che è presente nel 60% dei tumori.

Anche nei tumori che non esprimono la telomerasi si hanno dei meccanismi alternativi per allungare i

telomeri, mediante un meccanismo ALT. Lo studio dei telomeri è stata garantita grazie alla discheratosi

congenita.

Man mano che le cellule differenziate si dividono, i telomeri si accorciano, in modo da limitare il numero di

divisioni, e nel momento in cui si hanno telomeri non protetti si ha instabilità genomica. Già negli anni ’30-

’40, McClintock notò come le estremità dei cromosomi potevano rompersi e fondersi tra di loro. Si creano

dei ponti che collegano i cromatidi fratelli e sono molto deleteri in quanto durante l’anafase, la mitosi

procede poiché i cinetocori sono legati correttamente al fuso anche se si ha rottura del cromosoma. Si ha

quindi un telomero sprotetto e durante la replicazione si ha la fusione dei due cromatidi fratelli e in anafase-

telofase si ha di nuovo rottura e di nuovo si hanno telomeri sprotetti. Questi riarrangiamenti cromosomi

enormi portano alla formazione di cromosomi molto lunghi.

Sia a livello dell’intero organismo sia a livello dei singoli fibroblasti, le cellule differenziate hanno un numero

finito di divisioni (50-70) e si ha accorciamento dei telomeri, che porta a senescenza replicativa che arresta

il ciclo cellulare. Nelle cellule in cultura queste non possono essere immortalizzate. Nel momento in cui si

hanno cromosomi corti si possono avere riarrangiamenti e instabilità genomica. Nella maggior parte dei casi

di questi cicli di fusione e rottura portano alla morte della cellula, ma se la cellula riattiva la telomerasi si

hanno cellule che sopravvivono e diventano tumorali. Mutazioni in p53, RB, overespressione di cdc25

portano a cromosomi che non sono protetti dal complesso delle shelterine e successivamente riesprimono

il gene della telomerasi e attivano i processi di allungamento dei telomeri portando anche al riarrangiamento

del genoma.

Il metabolismo dei telomeri venne capito già all’inizio del ‘900 dove alcune cellule, come fibroblasti messi in

coltura, erano in grado di compiere un numero finito di replicazioni e andavano incontro alla morte. Questo

venne definito come limite di Hayflick. La prima volta che si riuscì ad ottenere cellule in coltura con

proliferazione incontrollata furono cellule tumorali della cervice uterina HeLa. Nel momento in cui si

prelevano le cellule e le si mettono in coltura, queste compiono una serie di divisioni. Inizialmente vanno

incontro a shock in quanto sono state prelevate dal loro ambiente (tessuto) e si ha il calcio-shock. Molte

delle cellule riescono a superare questo shock e nel tempo accorciano i telomeri, fino ad arrivare ad un

momento di crisi, definito come senescenza replicativa, dove si hanno dei telomeri sprotetti e iniziano a

rallentare la crescita e si ha la fase di crisi vera e propria dove tutte le cellule si arrestano. Nelle cellule

immortali, embrionali o staminali con il gene della telomerasi espresso, divisione cellulare dopo divisione

non si assiste all’accorciamento dei telomeri. Trasfettando la telomerasi in fibroblasti si è visto che si riesce

ad ottenere cellule immortali. Nel momento in cui le cellule entrano in crisi, questa è accompagnata da

instabilità genomica e si possono avere mutazioni che portano la cellula a proliferare, come a livello di p53

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che è mutata nell’80% dei tumori. La telomerasi è stata molto studiata per poter sviluppare degli inibitori

come possibile approccio chemioterapico, è quindi fondamentale l’analisi molecolare del tumore per poter

sviluppare una terapia personalizzata.

Molti telomeri sono poliploidi perché nel momento in cui si ha una cellula che overesprime un oncogene e

ha alcuni telomeri sprotetti, si attiva il DNA damage checkpoint e si ha un blocco prolungato nella fase g2 del

ciclo cellulare e la cellula non entra in mitosi. Alcune volte queste cellule replicano il loro DNA e diventano

tetrapoloide dando un enorme vantaggio, che porta ad un accumulo di mutazione, dove alcune non sono

favorevoli alla vita della cellula ma diventano tollerate. Spesso, le cellule tumorali, se bloccate in metafase

(metaphase spread) si vede che sono tetraploidi, triploidi ecc.

La telomerasi non può essere considerata un oncogene perché se in una cellula normale viene trasfettata

con TERT si ottiene una cellula immortale che mantiene tutte le caratteristiche delle cellule normali, in

quanto è soggetta ad inibizione da contatto, ha bisogno del mezzo di coltura per entrare nel ciclo cellulare,

presenta tutti i checkpoint del ciclo cellulare. Se la cellula normale subisce della mutazione che la portano a

diventare trasformata e contemporaneamente si ha la riattivazione della telomerasi o di ALT si ha una cellula

tumorale vera e propria. Negli anni ’90 si è anche ipotizzato di usare la telomerasi nel trattamento di alcune

malattie degenerative croniche, come nel caso delle ulcere croniche della pelle, degenerazion maculare,

nell’AIDS, ma tutti questi trattamenti furono subito abbandonati in quanto era troppo pericoloso perché si

potevano indurre le cellule ad ottenere dei vantaggi aggiuntivi e di avere una possibilità ulteriore di andare

incontro a tumori.

ALT (alternative Lenghtenng of telomeres): non si sa con precisione come avvengano questi meccanismi, si

ipotizza che sia un meccanismo ricombinativo dove i telomeri corti invadono dei telomeri lunghi e avvenga

una sorta di ricombinazione omologa molto particolare definita come break induced replication che porta a

copiare il cromosoma lungo in modo da ottenere due cromosomi di uguale lunghezza. In questi meccanismi

alternativi si ha azione delle proteine ricombinative, che ultimamente sono state molto utilizzate per poter

sviluppare degli inibitori che possano bloccare le cellule quando attuano questi meccanismi.

Esiste una malattia ereditaria, la discheratosi congenita, che è la malattia del mantenimento

dell’allungamento dei telomeri. Tutti i pazienti presentano problemi di sviluppo, midollo osseo ed è

considerata come una malattia chromosom instability syndrome. Si ha accumulo di tumori, le mutazioni più

frequenti cadono nella diskerina, che stabilizza il complesso della telomerasi. Questi pazienti presentano la

telomerasi che però non funziona correttamente e già dalla nascita hanno dei telomeri molto corti. Un

fenotipo tipico di questi bambini è l’invecchiamento precoce. Sono state trovate mutazioni sia in TERC che

TERT. Le cellule prelevate dai pazienti sono servite a comprendere l’importanza del metabolismo dei

telomeri. 45

19/04/18

L’instabilità genomica è una caratteristica base delle cellule tumorali, in quanto sono in grado di riarrangiare

il proprio genoma e di accumulare mutazioni. Fino a 50 anni fa i tumori erano considerati tutti uguali, ma ad

oggi si sa che sono di diverso tipo. A seconda del contesto tissutale si hanno diversi tipi di tumore e si hanno

anche interazioni di cross-talk tra il tumore e il tessuto.

I tumori vengono classificati in:

- Carcinomi: derivano dai tessuti epiteliali

- Sarcomi: si sviluppano nelle ossa, cartilagine,

- Leucemie: a carico delle cellule sanguigne

- Linfomi e mielomi: a carico delle cellule del sistema immunitario

Cellule all’interno dello stesso tumore sono diverse, perché presentano instabilità genomica distinta e si ha

una selezione di tipo darwiniano, in modo tale da favorire le cellule più favorevoli, da un punto di vista del

tumore, ossia quelle cellule che hanno proliferazione incontrollata. La cellula tumorale acquista più

mutazioni, ma inizialmente si trova in un ambiente dove si hanno altre cellule che si dividono. La cellula

tumorale è in grado di abbattere il checkpoint del ciclo cellulare e riesce ad acquisire caratteristiche che la

portano a dividersi indipendente dagli stimoli esterni, dai checkpoint e dal danno al DNA. Le cellule devono

acquisire più mutazioni per abbattere tutte queste barriere. I tumori vengono considerati come malattie del

ciclo cellulare, poiché molto spesso si hanno mutazioni in geni in grado di controllare la risposta ai danni al

DNA.

La ricerca sul cancro cerca di capire la morfologia e le caratteristiche molecolari e genetiche a seconda del

tipo di cancro. Nel 2000 Weinberg definì 6 caratteristiche dei tumori che accumunano tutti i tumori:

- Capacità di crescere anche in assenza di stimoli esterni (es cellule tumorali in cultura non hanno

bisogno di siero)

- Sono insensibili ai segnali che limitano la proliferazione cellulare di un certo tessuto

- Hanno mutazioni sui geni che portano all’apoptosi

- Stimolano l’angiogenesi

- Sono in grado di invadere altri tessuti -> metastasi

- Potenziale replicativo illimitato (riattivano la polimerasi)

Nel 2011 le caratteristiche che permettono la tumorigenesi sono:

- Instabilità genomica e la possibilità di accumulare mutazioni

- Capacità dei tumori di promuovere lo stato infiammatorio (dove lo stato infiammatorio aiuta il

tumore a crescere)

- Modificare completamente il metabolismo della cellula (le cellule tumorali sviluppano molti ROS,

hanno un metabolismo accelerato)

- Non vengono riconosciute dal sistema immunitario

I tumori non sono cellule isolate, vivono in un microambiente costituito dalle cellule normali e si ha un

continuo scambio di informazioni tra le cellule normali e le cellule tumorali. All’interno delle cellule tumorali

vi è un pool di cellule tumorali staminali che sono in grado di invadere altri tessuti e si avranno microambienti

tumorali nei tessuti dove queste formano metastasi. Le cellule immunitarie infiammatorie hanno un’attività

pro-tumorale, mentre in alcuni casi combattono le cellule tumorali stesse. Le cellule tumorali hanno un

continuo scambio di fattori di crescita, interleuchine e proteine solubili.

46

Siccome le cellule tumorali si formano in età avanzate, le cellule staminali non hanno un pool di divisone

molto alto e non sono molto in grado di accumulare mutazione, a differenza di alcune cellule di transizione

che vanno maggiormente incontro a proliferazione. Si ipotizza che invece si abbia una reversione della

staminalità, dove il tumore deriva dall’accumulo di mutazione andando incontro ad un processo di de-

differenziamento. Riconoscere tutte le caratteristiche delle cellule tumorali è fondamentale per identificare

la corretta chemioterapia.

Una volta che il DNA è danneggiato si hanno dei sensori che danno luogo ad una cascata di trasduzione del

segnale, che prevede l’azione di chinasi. Si ha quindi la riparazione del danno, l’arresto del ciclo cellulare e

in alcuni casi anche tolleranza del danno. Se l’arresto si protrae per tanto tempo si ha senescenza e la cellula

può andare in apoptosi. Ogni qualvolta u meccanismo di questa cascata non funziona correttamente si va

incontro ad instabilità genomica. Questa cascata ha molteplici funzioni, è importante anche per il

metabolismo dei mitocondri, è importante per il sistema immunitario, nella risposta virale, nel ritmo

circadiano. Molte malattie ereditarie sono dovute a mutazioni in geni coinvolti nella risposta di riparazione

dei danni al DNA. Sia il parenchima che lo stroma dei tumori contengono diversi tipi di cellule e sottotipi che

collettivamente consentono la crescita e la progressione del tumore. Le cellule immunitarie infiammatorie

presenti nei tumori possono comprendere sia sottoprocessi di tumore che di tumore.

Le cellule tumorali hanno un corredo cromosomico completamente alterato, dove anche l’ambiente può

causare danno al DNA, a seguito dello stress ossidativo, problemi a livello dei telomeri. Se i danni al DNA non

vengono riparati si ha instabilità genomica e tumore. i danni al DNA sono coinvolti in molti aspetti:

infiammazione tissutale, rigenerazione cellulare -> grande importanza della DDR. Le cellule tumorali sono

poliploidi e aneuploidi e spesso si hanno delle traslocazioni, amplificazioni geniche (amplificazione dei

microsatelliti), mutazioni puntiformi.

Le cellule che iniziano a replicare in maniera indiscriminata devono superare lo stress replicativo. Si hanno

una serie di eventi, quali il firing delle origini di replicazione non coordinato, alcune origini non iniziano la

replicazione del DNA. Queste cellule sono in grado di ri-iniziare la replicazione del DNA in modo da portare

alla poliploidia. A causa dello stress replicativo le cellule tumorali accumulano tagli alla doppia elica. tutte le

volte che si ha iperattivazione di un oncogene si ha iperattivazione delle forche replicative, in alcuni casi si

ha anche ri-replicazione del DNA, che causa stress replicativo, dove una replicazione così veloce porta ad un

rapido esaurimento del pool di nucleotidi. Tutti questi stress postano ad un accumulo di tagli alla doppia

elica del DNA, che portano al riarrangiamento, delezioni e inversioni che sono tipiche delle cellule tumorali.

Nel fenomeno della chromothripsis, si ha l’insorgenza di un tumore in un unico evento, dove nelle cellule si

hanno una serie di tagli continui di doppi tagli al DNA che portano a riarrangiamenti in un unico evento.

Questo si verifica nel 25% dei casi nei tumori alle ossa. Si ha un evento devastante con un accumulo enorme

di tagli. Sequenziando il genoma di questi tumori, si nota che il genoma è completamente riarrangiato. Sono

state sviluppate diverse ipotesi: si pensa che si verifichino dei tagli massicci alla doppia elica quando i

cromosomi sono condensati in meiosi, oppure che siano dovuti ai telomeri. Nel momento in cui si hanno

eventi di fusione tra i cromatidi fratelli dove questi non sono protetti dalle shelterine, si ha un’estrema

instabilità genomica, e nel momento in cui si hanno i bridges in anafase, che portano alla formazione dei

cromosomi dicentrici, vengono tagliati in frammenti e causano gli eventi di chromothripsis.

A livello dei tumori si parla di Kataegis (dal greco che vuol dire “tuono”), dove nei tumori si ha un pattern di

ipermutazione particolare, dove le C vengono mutate in T o le C vengono mutate in G. questo prchè quando

in anafase si hanno cromosomi dicentrici con la formazione di bridges, questi sono esposti ad una serie di

proteine che sono citoplasmatiche che servono a combattere il DNA esogeno (virale) e sonoTREX-1

(esnonucleasi plasmatica) e APOBEC che deammina la citosina-uracile. Normalmente queste protein non

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hanno accesso al DNA, ma quando si formano i ponti cromatinici in anafase riescono ad agire. TREX1 è una

esonucleasi che taglia il DNA come anche APOBEC che deammina la citosina ad uracile che viene riparato e

si ha un accumulo di mutazioni molto specifiche.

Fino agli anni ’80 l’unico trattamento principale contro il cancro era la chemioterapia, dove si pensava che

dosi massicce di chemioterapico fossero più efficaci nel trattamento del tumore. ad oggi si cercano le cause

dei singoli tumori

Il DNA inoltre è una molecola instabile, e si hanno almeno 70mila lesioni al DNA al giorno per cellula, ma

grazie ai pathways di riparazione molti danni vengono evitati. Il DNA è ricoperto da proteine che lo

proteggono, ma quando si hanno fenomeni di trascrizione e replicazione sono i momenti più fragili per il

DNA.

SRC è un oncogene che viene attivata dai fattori di crescita.

26/04/18

Danni al DNA

Nel momento in cui il meccanismo di riparo del danno al DNA non funzionano correttamente si possono

accumulare mutazioni a livello di esso che possono causare tumorigenesi. Molti dei danni a livello del DNA

avvengono in maniera spontanea, proprio perché il DNA è immerso in una soluzione acquosa e soprattutto

anche perché all’interno della cellula si hanno meccanismi che possono indurre danni al DNA come la

presenza di ROS. Si possono avere tagli a singola elica, dove al giorno per cellula umana si aggirano attorno

a 50mila. Si possono avere eventi di perdita di una base, che sono attorno a 10mila al giorno; seguiti da

eventi di de-amminazione (600 al giorno); accumulo di eventi ossidativi (2mila al giorno). Sommando tutti

questi eventi si possono avere 70mila danni al DNA che al giorno devono essere riparati. Si conta che nel

17

corpo umano si hanno 3x10 danni all’ora, ma i vari pathways di riparazione riescono a far fronte a questi.

Alcuni danni possono non essere riparati e possono dar luogo a mutazioni silenti, ma se la mutazione cade

all’interno di un sito attivo di un gene questo può essere molto dannoso per la cellula. Anche l’ambiente può

presentare degli agenti mutageni che possono causare mutazioni, come le radiazioni solari, l’inquinamento

ambientale, l’aspartame, agenti conservanti i quanto portano all’accumulo di NO.

I danni più frequenti sono dovuti a perdite di base, seguiti da deaminazione delle citosine, metilazione

indotta da SAM, ossidazione. I raggi UV sono molto citossici e possono causare fino a 500 lesioni/cellula. La

dose di radiazione che è considerata tumorale è di 100mSv, che causano 4 tagli alla doppia elica del DNA o

100 tagli alla singola elica. Dosi più alte causano degli effetti devastanti, dove 500mSv inducono nausea,

vomito, e ad esempio la bomba rilasciata ad Hiroshima ha rilasciato circa 100mila Sv. Anche però alcuni

trattamenti tumorali inducono radiazioni attorno ai 10mSv.

Il DNA è una molecola fragile dove può subire in modo spontaneo dei danni che se non riparati portano a

mutazione. Le mutazioni possono essere distinte in:

- Genomiche: variazioni di tutto il genoma (aneploidie). Dovute spesso ad un’alterata segregazione

-5

cromosomica. Con una frequenza di 10 /divisione cellulare

- Cromosomiche: causati da riarrangiamenti, delezioni, duplicazioni, inversioni, traslocazioni. Hanno

-4

una frequenza di 6x10 /divisione cellulare. Sono di facile individuazione mediante il bandeggio dei

cromosomi

- Geniche: date da mutazioni puntiformi che possono essere dovute a transizioni (purina con purina e

pirimidina con pirimidina) e trasversione (pirimidina con purina e viceversa), si possono avere anche

inserzioni e delezioni. 48

Gli acidi nucleici in soluzione vanno incontro a decomposizione spontanea, dove si possono avere dei tagli a

livello del backbone fosfodiesterico, il ribosio presente nell’RNA lo rende più suscettibile all’idrolisi rispetto

al DNA. La perdita dell’OH nel DNA è più stabile ma a spese del legame N-glicosidico. Quando il DNA è a

singola elica si possono avere eventi di depurinazione. La maggior parte delle mutazioni puntiformi che

possono avvenire nel DNA avvengono a causa di agenti endogeni:

- Acqua: può dare due danni principali: idrolisi che portano alla rimozione delle basi e eventi di

deaminazione della citosina

- ROS: ossidazione modificando le basi, rottura delle basi, modificazione dello zucchero, rottura del

backbone fosfodiesterico (nicks)

- Agenti alchilanti: agiscono a livello delle basi alchilando e dando luogo a diversi sottoprodotti delle

basi.

L’acqua può causare eventi di depurinazione con perdita di intere basi e di deaminazione con perdita dei

gruppi amminici. La deaminazione può essere a carico di tutte le basi: citosina -> uracile, adeinina ->

ipoxantina, guanina -> xantina, 5-metilcitosina (a seguito di modificazioni epigenetiche) -> timina (evento

molto pericolo per la cellula perché non viene riconosciuto). L’evento più frequente è la deaminazione della

citosina a uracile che viene riparato dal BER e mediante anche l’aiuto di una glicosilasi che riconosce l’uracile

e lo elimina. Se la citosina è metilata la deamminazione porta alla formazione della timina, il cui

misappaiamento T-G viene riconosciuto da BER: la deamminazione della 5’metilcitosina, che è più frequente

se il DNA è a singola elica e avviene prevalentemente quando il DNA si sta replicando. Alcune delle timine

missappaiate non vengono riconosciute, soprattuto nelle CpG islands (zone di regolazione trascrizionale)

causando anche mutazioni. Le transizioni di G-C ad A-T costituiscono 1/3 delle mutazioni che si trovano in

geni fondamentali presenti in malattie ereditarie, come a carico di p53. La deamminazione delle purine ha

una frequenza molto minore e si hanno delle glicosilasi che le riconscono e le rimuovono dal DNA, dove gli

eventi di deamminazione portano le basi ad appaiarsi in maniera scorretta, dove l’adenina trasformata ad

ipoxantina si appaia con la C e non più con la T. quando queste basi non vengono prontamente tolte dal DNA

si assistono ad accumuli di mutazione. L’acqua causa anche la perdita di purine e pirimidine. Sono gli eventi

più frequenti nel DNA che nell’RNA e nel momento in cui si ha la perdita della base, si ha la formazione di

una sito apurinico/apirimidinico che viene riconosciuto dal BER grazie ad un enzima, AP endonucleasi, che

taglia il backbone fosfodiestarico e una polimaerasi riempie questo vuoto con una base corretta. Nel

momento in cui si ha un sito apurinico anche il ribosio è instabile e si può trasformare in aldeide con taglio

fosfodiesterico, che se avviene durante la replicazione del DNA indica una modificazione molto citotossica.

Questi siti apurinici vengono riconosciuti dalla DNA glicosilasi, che riconoscono la base modificata e tagliano

il legame N-glicosidico per modificare la base modificata, creando un sito AP che viene riconosciuto dall’AP

endonucleasi che porta alla riparazione delle lesioni. Gli eventi di depurinazione sono molto frequenti, circa

10mila al giorno per cellula umana.

I danni indotti dal metabolsimo dell’ossigeno (paradosso del metabolismo aerobico). L’ossigeno si può

trasformare in ROS che possono danneggiare il DNA, ma anche lipidi, carboidrati proteine. Pure i lipidi

ossidati possono legarsi al DNA dando luogo a crosslink. Tra le specie reattive più citotossiche vi sono i radicali

dell’ossigeno, come il superossido, perossido di idrogeno, radicali ossidrili. Si possono formare ROS anche a

causa di agenti esogeni, soprattutto a causa delle radiazioni, composti ciclici, farmaci/droghe. Le basi più

frequentemente modificate sono la toxoguanina e l’etilglicol. Sia l’etilglicol che la toxoguanina si appaiano

in maniera scorretta e portano ad eventi di trasversione. Anche il timin glicol si accumula frequentemente e

si hanno circa 2mila eventi di accumulo al giorno e 2mila di 8oxo-G. La maggior parte del metabolismo

aerobico coinvolge i mitocondri, colpendo il DNA mitocondriale, che però presenta molte copie di DNA.

49

Eventi di metilazione sul DNA avvengono in maniera controllata, sia a livello istonico che a livello del DNA

stesso e servono per mediare la trascrizione. S-adenosilmetionina serve a molte metilasi per metilare il DNA.

Le forme più frequenti di metilazione sono la 7-metilguaina e la 3-mtiladenina, dove la 7-metigualina si

appaia correttamente, ma il legame tra la base e lo zucchero è labile. Non esiste glicosilasi specifica. La 3-

metiladenina non si appaia con nessuna base e quando la DNA polimerasi sintetizza il DNA, trova la 3-

metiladenina si blocca. Viene riconosciuta da una glicosilasi specifica del BER che la toglie dal DNA. La S-

adenosilmetionina SAM è csotituito da ATP e metionina. È presente in tutte le cellule dell’organismo,

soprattuto nel fegato dove gli eventi di metilazione sono abbondanti. Anche la replicazione stessa del DNA

è un possibile evento di accumulo di danni e di missappaiamenti. Le basi possono subire degli shift

tautomerici dove sono più frequenti le forme chetoniche e si possono avere la formazione di forme rare

imminiche o enoliche. Che però vengono prontamente eliminati grazie ai miss-match-rapair. Le DNA

4

polimerasi inseriscono una base errata 1/1x10 . Esistono nella cellula una serie di DNA polimerasi

translesione che sono in grado di replicare il DNA anche nel momento in cui il templato è danneggiato. Si

sono sviluppate per replicare dei DNA danneggiati, ma hanno perso la fedeltà e inseriscono un nucleotide

2

sbagliato 1 ogni 10 . Un altro problema che si ha durante la replicazione del DNA riguarda le zone dove

singole basi o copie di due nucleotidi/triplette sono altamente ripetute, causando l’espansione di triplette

che se si accumulano possono portare a patologie come la sindrome dell’X-fragile, la corea di Huntington. Il

fenomeno che porta alla formazione di accumulo di triplette viene definito come slippage, dove il DNA

neosintetizzato può scorrere rispetto al templato e se scorre all’indietro si ha la replicazione del DNA.

I danni esogeni sono dovuti a radiazioni ionizzanti, raggi UV, agenti alchilanti, agenti di crosslink, agenti

chimici che causano alterazioni delle basi. Si parla di mutagenesi ambientale e di una serie di mutageno che

causano danni al DNA, come BBQ, tabacco, aflatossina (secreto da muffe o lieviti che contaminano riso),

mais, noccioine. Agenti alchilanti che causano modificazioni a livello della singola elica del DNA come il gas

mostarda. Molti agenti sviluppati in chemioterapia sono stati usati perché tagliano il DNA.

Uno dei test maggiormente usati per valutare la mutagenicità di una sostanza è il Test di Ames. Si preleva

una coltura del batterio salmonella che non è n grado di crescere in assenza di istidina e si va a vedere se

l’agente possibile mutageno induce una crescita nelle cellule in assenza di istidina.

Oltre al test di Ames è importane vedere se una sostanza in topi nude può indurre mutazioni. tra gli agenti

mutagenici più potenti vi sono gli analoghi delle basi che vengono intordotti nel DNA creando

missappaiamenti.

Le radiazioni UV causano delle lesioni importanti al DNA, che possono causare la formazione di dimeri di

pirimidina causando una distorsione molto grossa della doppia elica del DNA. Si assiste al blocco dell’attività

della DNA polimerasi e dell’RNA polimerasi. Questi danni vengono riparati dal NER. Altri agenti molto

citotossici sono gli inibitori delle topoisomerasi, che sono molto usati in chemioterpaia. Agiscono rilassando

il DNA mediante tagli o a singola elica con le topoisomerasi di calasse I, oppure mediante tagli della doppia

elica con le topoisomerasi di classe II. Qualsiasi agente che blocca le topoisomerasi come la camptotecina o

l’etoposdide sono estremamente citotossici e usati molto in cheioterapia, mediando il taglio della doppia

elica durante la fase S. Altri agenti usati in chemioterapia sono i DNA interstrand crossilinks dove un solo

danno di questi può portare alla morte della cellula. Ad esempio, il cisplatino si è dimostrato molto efficace

per il tumore ai testicoli. Un altro potente agente intercalante è lo psoralene che viene attivato dalle

radiazioni UVA formando del monoadotti e causa danni solo nella zona irraggiata. Usato soprattuto per le

psoriasi. 50

I pathways di riparazione sono molto importanti perché si hanno molti eventi di danno al DNA, come le

depurinazioni. Molti degli agenti chemioterapici sono citotossici anche per le altre cellule dell’organismo ad

attiva replicazione.

02/05/18

DNA damage response

Si possono avere diversi tipi di danni: alchilazione, mutazioni puntiformi, radiazioni UV che portano alla

distorsione del DNA formando dimeri di pirimidine, bloccando sia la DNA polimerasi sia la RNA polimerasi.

Anche i tagli alla doppia elica sono molto citotossici e i pathway che possono ripararli danno instabilità

genomica.

- Reversione diretta del danno: si hanno pochi enzimi che sono in grado di rimuovere il danno, in

genere sono delle metil-transferiasi negli eucarioti superiori

- MMR, BER, NER

- Pathways di riparazione a singola elica

- Double Strand Break Repair

- ICL repair

- DNA Damage Tolerance (PRR)

2015 premio Nobel per la chimica per le scoperte dei pathways di riparazione del DNA a Lindahl, Modrich,

Sancar. I primi studi condotti sulla riparazione del DNA sono stati condotti su S. cerevisiae, mediante

l’isolamento di mutanti RAD sensibili alle radiazioni UV e ionizzanti. Molti di questi mutanti erano anche

difettivi nella meiosi. Questi sono stati raggruppati in 3 diversi gruppi di epistasi, definito come gruppi

RAD3, RAD52 e RAD6. I geni che appartengono al gruppo RAD3 partecipano al nucleotide excision repair,

quelli che appartengono al gruppo RAD52 sono implicati nella ricombinazione omologa e i componenti del

gruppo RAD6 sono coinvolti nella DNA damage tolerance (post-replicative repair). Molti di questi geni

implicati nel meccanismo di riparazione del DNA sono coinvolti in numerose malattie caratterizzate da

instabilità genomica, problemi neurodegenerativi, nello sviluppo, invecchiamento veloce.

Riparazione diretta del danno

Si hanno degli enzimi che sono in grado di riparare i danni a livello delle singole classi. Si distinguono in due

classi principali:

- DNA fotoliasi: è conservati negli eucarioti fino ai marsupiali, mentre è stata persa nei mammiferi a

seguito della comparsa della pelliccia. Cattura dal sole l’energia necessaria per rompere legami tra

dimeri di pirimidine. Mediante topi transgenici che esprimevano la DNA fotoliasi specifiche per spefici

danni al DNA, ossia i 6-4 fotoprodotti oppure i dimeri di primidina. Hanno visto che la fotoliasi che è

in grado di revertire il danno a livello dei dimeri di pirimidina, i topi erano molto meno sensibili ai

danni UV e sviluppavano meno danni rispetto ai controlli. Per l’uomo questa perdita rappresenta uno

svantaggio in quanto ha perso la pelliccia. I topi, invece, che presentano i 6-4 fotoprodotti non sono

più protetti rispetto al controllo in quanto sviluppano tumori alla pelle. è un enzima piccolo che riesce

a revertire i danni

- Metiltransferasi: rimozione diretta del gruppo metilico da O6-metilguanina ad uno dei propri residui

di cisteina inattivando permanentemente la proteina. È un processo molto dispendioso per la cellula.

- Altre alchitransferasi sono le AlkiB, conservate da E.coli all’uomo, essendo in grado di rimuovere la

3-metil citosina e 1-metiladenina, ossia i gruppi metilici.

51

Le fotoliasi: sono state molto studiate in S. cerevsiae, sono in grado di riconoscere o i dimeri di pirimidina o

i 6-4 fotoprodotti, legarli e alla luce visibile si attivano e rimuovono il danno mediante un cromoforo che si

eccita alla luce e rimuove il danno.

La metiltransferasi: costituiti principalmente dalla famiglia Ada, rimuovono il gruppo metilico dall’O6

metilguanina che è legato covalentemente alla cistina e si inattivano. Questi eventi sono abbastanza rari, ma

nel momento in cui le basi sono danneggiate si hanno l’attivazione dei pathways di excisione.

Alchiltransferasi conservate in tutti gli eucarioti

Excision repair pathways

Sfruttano il fatto che il DNA è a doppia elica e che la stessa informazione è presente su entrambe le eliche:

si hanno 3 meccanismi:

- Mismatch repair

- Base excision repair

- Nucleotide excision repair

Mismatch repair Ha un ruolo

importante

durante la

replicazione del

DNA, dove la

fedeltà della

riparazione cresce

di 2-3 ordini di

grandezza.

Durante la

ricombinazione

omologa si

possono avere 1-2

nucleotidi

missappaiati che

devono essere riparati. Se si hanno danni alle basi a seguito di eventi di deamminazione (dove il più frequente

è quella della citosina ad uracile, oppure la 5-metilcitosina che porta alla formazione della timina. questo

meccanismo è implicato anche nella DNA damage checkpoint, apoptosi, ipermutazione somatica dei geni

delle Ig, espansione delle triplette.

• Errori nella replicazione del DNA (incrementa la fedeltà della replicazione di 2/3 ordini di grandezza)

• Formazione di un eteroduplex tra due molecole di DNA omologhe (ricombinazione omologa)

• Elimina basi chimicamente modificate (chemioterapia). Es.: Deaminazione della 5-metilcitosina a

timina (5MeC/G a T/G)

• Ruolo nei DNA damage checkpoints, apoptosi, ipermutazione somatica dei geni delle

immunoglobuline, espansione delle triplette in malattie ereditarie, etc.

8

Un nucleotide incorporato scorrettamente avviene ogni 10 basi. Si hanno anche delle polimerasi che

vengono solitamente tenute a basse concentrazioni e sono pol-translesione che agiscono anche se il

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templato è danneggiato. Sono molto importanti per la vita della cellula e il suo sviluppo nel caso di organismi

unicellulari, dove il sito catalitico rende delle polimerasi poco fedeli.

La proteina che riconosce il danno si chiama Mut S che in coli è un omodimero che lega l’ATP e forma un

anello attorno al DNA (struttura simile alle coesine). Mut S scorre lungo il DNA appaiato alla forca replicativa,

negli eucarioti lega il PCNA che rende processive pol delta e pol epsilon, e riconosce il mismatch reclutando

altre proteine che sono MUTL e MUTH. MUTH è un’endonucleasi che viene attivata solo all’interno del

complesso Mut S legato al mismatch-Mut L- Mut H. Dopo che MUTH taglia il DNA si hanno delle esonucleasi

che digeriscono e rimuovono i nucleotidi fino ad arrivare al miss match e si ha una polimerasi che riempie il

gap e una ligasi che porta alla riparazione finale.

MutS è in grado di piegare leggermente il DNA e gli permette di riconoscere il mismatch, dove in questi punti

i legami non sono così forti e il DNA si piega ulteriormente e MutS riconosce il missappaiamento. Si recluta

MuTL e mutH viene attivato per tagliare il DNA. Per capire chi è il nucleotide scorretto, mentre avviene la

replicazione del DNA si ha la emimetilazione del DNA e per questo che MutH taglia il DNA a livello di

sequenze emimetilate e taglia lo strand non metilato. Le esonucleasi digeriscono il DNA a seconda di dove si

trova il miss match (a monte o a valle di MUTH) e si ha riparazione del danno. anche nell’uomo si hanno gli

stessi fattori, dove però si hanno più geni che codificano per Mut S. questi geni sono definiti come Msh2,3,6

e formano degli eterodimeri: MutS alfa e MutS beta. Lo stesso vale per MutL, dove si hanno geni Mlh1,2,3

che formano diversi complessi: MutL alfa, MutL beta e MutL gamma. Questi agiscono in momenti diversi e

riconoscono danni diversi, dove MutS alfa riconosce inserzioni, misappatiamenti o delezioni di una singola

base, mentre MUTSbeta riconosce inserzioni, delezioni e misappaiamenti di più basi. MutL alfa è quello che

viene maggiormente usato dalla cellula, mentre le altre forme hanno funzioni più accessorie. Le endonucleasi

MUTH sono assenti negli eucarioti e per molti anni i ricercatori hanno cercato in ogni modo di trovarli fino a

quando non si sono accorti che alcune sub di MUTL hanno attività endonucelasica. I diversi complessi si

combinano tra di loro. Il complesso MUTS sia in forma di omodimero che in forma eterodimerica mantiene

la propria struttura e sono molto conservati. Legano l’ATP e lo idrolizzano. È anche in grado di legare l’N-t

del complesso MUTL, che in ColI ha solo una funzione di matchmaker per attivare MUTH mentre nell’uomo

ha anche attività endonucleasica. MutS quando lega l’ATP cambia conformazione. È una ABC ATPasica, come

anche le coesine e condensine e RAD50 (proteina che appartiene al complesso MRX che riconosce i tagli alla

doppia elica del DNA). MUTS lega il DNA e si hanno dei cicli di idrolisi dell’ATP, ma quando lega il missmatch

l’attività ATPasica è soppressa. Cambia conformazione legandosi più fortemente al DNA in modo da attivare

l’eterodimero MutL che taglia il DNA e delle esonucleasi digeriscono il DNA per rimuovere il mismatch e

quando MutS è vicino al ssDNA, cambia conformazione, si stacca dal DNA e torna ad avere attività ATPasica

e idrolizzare ATP e lega l’eterodimero MutL. Si è visto che MutS può anche tetramerizzare. Negli eucarioti

l’attività endonucleasica è posseduta da MUTL.

Il complesso Mlh1-Pms1 che il più frequente nelle cellule umane è in grado di legare gli ioni zinco grazie a

Pms1 come MutH e ha attività endonucleasica. Una volta attivato dal complesso MUTS che ha riconosciuto

il mismatch, è in grado di tagliare il DNA. Mentre in coli MUTS attiva MUTL e si deve legare a MUTH, negli

eucarioti si ha il complesso MUTL agisce e taglia il DNA.

Come fa il mismatch ripair a capire qual è il nucleotide inserito scorrettamente?

Sia MUTS che MUTL hanno dei domini di legame al PCNA e si ipotizza che muovendosi assieme alla forca

replicativa, sia in grado di riconoscere tra il filamento neosintetizzato e il filamento leading. Il mismatch rapir

agisce diversamente sulla lagging e leading strand, dove nel caso caso della lagging strand, i frammenti di

oakazaki non vengono subito legati e si formano dei nick sul DNA. Sono i nick che permettono l’entrata della

esonucleasi e permettono l’entrata dell’apparato implicato nel riparo del mismatch. Nel caso della leading

strand, le DNA polimerasi replicative possono inserire dei ribonucleotidi che sono più abbondanti dei

deossinucleotidi nel nucleoplasma, dove pol-epsilon inserisce un ribonucleotide ogni 250 deossinucleotidi,

53

mentre pol-delta inserisce 1 ribonucleotide ogni 5mila. La cellula presenta la RNAasi H2 che è in grado di

processare il DNA ed eliminare i ribonucleotidi mandando un segnale al mismatch repair per indicare qual è

il filamento neosintetizzato. Durante la sintesi della leading strand pol-epsilon inserisce un ribonucleotide e

se si verifica un mismatch, contemporaneamente il complesso RNAasi H2 costituito da 3 sub, riconosce il

ribonucleotide, lo rimuove e il complesso Mut S riconosce il mismatch ed EXO1 digerisce il DNA

neosintetizzato fino a rimuovere il ribonucletide. La polimerasi coordinata dal PCNA riempie il gap e si ha la

riparazione del danno.

Molti tumori sporadici-ereditari sono dati da mutazioni sul mismatch repair (MSH2 (35%), MSH6, MLH1

(60%), PMS1 and PMS2), come nel caso della sindrome di Lynch. È un tumore con incidenza considerevole

nella popolazione che porta a sviluppare cancro al colon che inizia a svilupparsi in età giovane ed è

contraddistinto da instabilità dei microsatelliti dove le triplette che si formano hanno un’espansione di

lunghezza molto variabile. Si è scoperto un nuovo gene della sindrome di Lynch ed è stata un’unione tra

ricerca di base e ricerca applicata, dove in alcuni pazienti non erano noti mutazioni sul mismatch repair. In

vitro, si è in grado di effettuare mismatch repair, che funziona solo se il DNA è nudo e non cromatinico. Se si

hanno i nucleosomi sul plasmide non si ha la riparazione del DNA. Si è visto che MSH6, che possiede un

dominio di legame al PCNA ossia il PIP domain e un dominio di legame agli istoni metilati che lega fortemente

la trimetilazione dell’istone H3 che avviene ad opera di serd2 che è presente nei geni altamente trascritti.

una modificazione istonica ad opera di setd2 è importante in modo da caratterizzare la trascrizione.

03/05/18

Base excision repair

Si occupa di riparare tutte quelle lesioni che riguardo le singole basi del DNA che però non distorcono la

doppia elica e alterano solo la struttura delle basi e i legami che si istaurano tra le due eliche. Questi eventi

derivano da reazioni di ossidazione, deaminazione e di alchilazione. La maggior parte delle lesioni che

avvengono spontaneamente all’interno della cellula sono carico dell’acqua e del metabolismo ossidativo,

che possono portare fino a 10mila danni al giorno per cellula umana. Si è visto che KO di geni che codificano

per proteine del BER nei topi, l’assenza nello sviluppo embrionale dei mammiferi porta a letalità nelle prime

fasi di sviluppo, causando un mancato sviluppo del sistema nervoso centrale. Le rapide divisioni che

avvengono nel SN implicano lo sviluppo di molti ROS che causano danni e portano a letalità embrionale. BER

svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento dell’integrità del genoma, nello sviluppo corretto del

sistema nervoso e svolge un ruolo molto importante di prevenzione nei tumori. In molti casi, chemioterapici,

causano danni che vengono riparati dal BER. Da qui l’importanza di studiare gli enzimi implicati nel BER. Il

meccanismo di riparazione dei danni del DNA è fondamentale per mantenere la stabilità genomica. Si hanno

anche dei crosstalk con il nucleotide excision repair e un ruolo molto importante nel prevenire la

neurodegenerazione. Molti degli enzimi del BER sono modificati dalla PARP. Il BER ripara una serie di

modificazioni che avvengono spontaneamente nel genoma dovuti a processi di ossidazione come la 8-

oxoguanina, la deamminazione dell’uracile, modificazioni delle basi dovute a metilazione, alchilazione. Ossia

tutte quelle modificazioni che alterano le strutture delle basi che cambiano il loro legame idrossile con la

base della elica opposta e non si ha una grossa distorsione dell’elica.

Si riconoscono 5 step:

1) Riconoscimento e rimozione della base ad opera delle DNA glicosilasi che sono molte e specifiche per

una o poche simili alterazioni di basi. La DNA glicosilasi, quando riconosce la base alterata, la elimina,

taglia il legame glicosidico e crea un sito abasico (apurino o apirimidinico) che viene riconosciuto da

una AP endonucleasi. In alcuni casi le DNA glicosilasi hanno attività AP

54

2) Azione AP endonucleasi taglia il 5’ rispetto al sito apurinico/apirimidinico tagliando il legame

glicosidico.

3) Polimerasi specializzata (pol-beta con attività anche deossiribosio fosfatasica rimuovendo

deossiribosiofosfati) la quale rimuove il fosfato che rimane ancorato sul 3’ e inserisce il nucleotide

corretto

4) Ligasi specializzata (LIG3) sigilla il DNA. XRCC1 funge da matchmaker stabilizza tutto il complesso in

modo tale che il danno venga riparato rapidamente.

Short patch BER: rimozione della singola base alterata, inserzione della base corretta e ligasi che

 riporta allo stato corretto. Avviene nella maggior parte dei casi ed è un processo molto veloce

In altri casi si ha il long patch BER, dove si ha la rimozione della base danneggiate e intervento di una DNA

polimerasi che inserisce più nucleotidi. Dove il 3’-OH viene esteso dalla pol-delta/epsilon e sintetizzano una

porzione di DNA e si ha lo spostamento di un frammento di DNA a singola elica che viene tagliato da

un’endonucleasi da FEN1. Si ha successivamente l’azione di LIG1.

DNA glicosilasi: enzima abbastanza piccolo, agisce come monomero e non ha cationi o altri cofattori che lo

aiutano nella sua attività. Anche le DNA glicosilasi legano il DNA e lo piegano leggermente permettendo il

riconoscimento delle basi errate che hanno maggior tendenza a fuoriuscire dal DNA quando questo è

leggermente piegato. Tutte le glicosilasi hanno una tasca in cui riconoscono la base alterata e se sono

specifiche per quella base, una volta che la riconoscono, tagliano il legame glicosidico. alcune hanno attività

AP ligasica che tagliano tra l’ossigeno e il carbonio e agiscono nelle reazioni di beta-eliminazioni. Oltre a

tagliare il legame glicosidico, agiscono anche mediante reazioni di beta-eliminazione con il taglio del

backbone fosfodiesterico. Si ottiene in 5’ un’aldeide insaturo e un fosfato attaccato al ribosio della base

corretta. Queste DNA glicosilasi liasi sono NTH1, NEIL1 e NEIL2. Sono molto conservate da S. cerevisiae fino

all’uomo e sono specializzate per una o per alcuni tipi di basi. La forma di base più danneggiata è l’uracile

per il quale sono presenti 4 DNA glicosilasi diverse: SMUG1 riconosce l’uracile anche quando è presente al

ssDNA. AAG/MPG riconosce basi metilate. Esiste una DNA glicosilasi di sicurezza che è in grado di riconoscere

basi difronte all’8-oxo-guanina che è una delle più frequenti a seguito di ossidazione. Se avviene la

replicazione del DNA prima che questa base venga eliminate, la DNA polimerasi inserisce la A o la C, causando

mutazioni, ma esiste una glicosilasi di sicurezza che riconosce la A legata alla OXO che viene quindi eliminata.

La maggior parte dei geni coinvolti nel BER sono essenziali per lo sviluppo embrionale dei mammiferi, ma

questo non vale per le DNA glicosilasi in quanto sono ridondanti. A differenza del nucletode excision repair

non si hanno casi frequenti di patologie. È stato studiato un caso di un paziente che presentava una

mutazione a livello della DNA ligasi I. l’attività della pool-beta è fondamentale in quanto KO danno letalità

embrionale, ma quando sono stati condotti KI che presentavano l’attività polimerasica di pol-beta non porta

a letali embrionali indicando che l’essenzialità di pol-beta nel BER è data dalla sua capacità di togliere il

deossiribosio.

Tagli a singola elica

Dovuti ad eventi endogeni ed esogeni. questi tagli avvengono a seguito di eventi ossidativi che portano alla

rottura del backbone fosfodiesterico, ma anche le radiazioni possono causare dei tagli a doppia elica, ma

molto più frequentemente danno tagli a singola elica. I tagli alla singola elica del DNA sono coperti dalla ligasi

solo se si ha un 3’OH e un 5’ fosfato, ecco che in presenza dei diversi ssb la ligasi non può agire perché le

estremità non sono “pulite” ma sono di diversa natura. Queste estremità devono essere pulita prima che la

ligasi possa agire.

Quando abbiamo un taglio alla singola elica del DNA durante la replicazione diventa un double strand break,

perché quando arriva la forca replicativa un templato è interrotto. Questo tipo di double strand break viene

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chiamato one end double strand break, perché comunque si ha un templato corretto dove la DNA polimerasi

è libera di correre, mentre l’altro templato risulta essere un one end double strand DNA break. Anche a

livello neuronale, dove le cellule sono in G0, si ha un’alta attività trascrizionale e i ssbreak interferiscono con

la trascrizione del DNA, soprattutto se il SS si trova a livello del templato della polimerasi. Uno dei primi

enzimi che riconosce i ss break è la PARP, ed è in grado di modificare il DNA e molte proteine coinvolte nel

BER aggiungendo dei residui di poli-ADP-ribosio. Sono 17 diverse nel genoma umano. PARP è un target molto

importante per la chemioterapia, soprattuto nel tumore al seno. Agisce ADP-ribosio a partire dal NAD e se si

ha una sua alta espressione si ha una diminuzione di NAD nella cellule e di ATP scatenando l’apoptosi. Questo

avviene frequentemente nel caso di neurodegenerazione e di massiccio danno cerebrale quando le cellule

vanno incontro ad elevata ossidazione.

PARP

7 sono attive nei mammiferi. PARP1 coinvolta nel ss brek repair. Presenta grande affinità per i tagli a singola

elica ed è in grado di aggiungere catene ramificate di poli-ADP-ribosio, sia a sé stressa che ad alcuni enzimi

cruciali come la polimerasi beta, XRCC1, la ligasi3, istoni e proteine che modificano la cromatina, in modo da

reclutare proteine replicative. Si hanno centinaia di residui di poli-ADP-ribosio ramificati. Si ha una

modificazione transiente del DNA. L’azione della poli-ADP-glicosio glicoidrolasi PARG toglie i residui di poli-

ADP-ribosio.

Nel momento in cui si ha un sito AP che si trasforma in un ssb vengono legati da PARP e il primo punto

essenziale è quello di rimuovere le estremità danneggiate, in quanto il ssb non è mai pulito e la ligasi non

può agire direttamente. La polinucleotdie kinasi 3-fosfatasi PNKP, aprataxin APTX, tirosil-DNA fosfodiesterasi

TDP1 puliscono le estremità del ssb. Successivamente il pathway segue gli step successivi del BER. Gli ultimi

step di riparazione del danno sono in comune tra il ssb e il ber.

Una delle modificazioni più semplici al 3’ possono essere solo dati da gruppi fosfati, modificazioni del ribosio,

o la topoisomerasi legata covalentemente al ssb. Tutte queste modificazioni devono essere ripulitili dagli

enzimi PNK1, APE1 ecc. nel caso del 5’ dove vi dovrebbe essere un gruppo fosfato affinché agisca la ligasi si

hanno gruppi OH, 5’aldeide, %’-dRP, 5’-AMP.

Ssb che viene riconosciuto da PARP porta al reclutamento di diversi enzimi che processano il 3’ e il 5’ e si

ottiene un intermedio simile a quello del BER sul quale può agire o lo short BER o il long BER, con riparazione

del danno con l’inserzione di un singolo nucleotide o di più nucleotidi.

Un taglio alla singola elica del DNA può essere processato in maniera diversa se incontrato durante la

replicazione. Se la forca replicativa arriva a livello del taglio, questo viene convertito in dsb e processato con

ricombinazione omologa. Si possono avere due casi diversi:

- Nel momento in cui arriva la forca replicativa al ssb si può avere la formazione di un taglio alla doppia

elica. Le estremità vengono riconosciute dalle proteine che riconoscono i dsb, come il complesso

MRN e CtrIP, che hanno la capacità di processare le estremità del dsb e di dare origine ad un ssDNA

3’ protruding che invade il DNA omologo del cromatidio fratello

- La replicazione continua anche a valle del ssb. Il dsb viene riparato per ricombinazione omologa

classica.

Studi recenti suggeriscono che si verifichi il primo modello. Mutazioni a livello degli enzimi che sono implicati

nella modificazione delle estremità del ssb danno luogo a malattie come la ataxia oculomotor apraxia 1

(AOA1). Questa malattia rappresenta il 5-10% delle atassie cerebrali che colpisce i bambini. La malattia si

può manifestare dal primo anno di vita fino al 18 anno. È caratterizzata da atrofia del cervelletto che porta

56

a movimenti incontrollati che porta a alterazioni cognitivi e dello sviluppo. La mutazione è a carico

dell’aprataxin che processa l’estremità del ssb. Si possono avere mutazioni anche a carico della TDP1 che

rimuove la topoisomerasi e inducono una malattia ereditaria molto grave SCAN1 spinocerebellar ataxia with

axonal neuropathy che si manifesta in età più tardiva e porta a neurodegenerazioe e a grossi problemi di

sviluppo. Anche nel caso della polinucleotide-kinasi-fosfoatasi PNKP se mutata porta alla MCSZ caratterizzata

da difetti nello sviluppo e da crisi epilettiche. La più frequente di queste malattie è la AOA1. Il gene non è

essenziale per lo sviluppo ma se mutati danno gravi effetti devastanti da un punto di vista neuronale.

09/05/18

Nucleotide excision repair

Si hanno dei danni più gravi a livello del DNA. Sono implicate dalle 20 alle 30 proteine. Si distingue in due

sotto pathways: uno ripara a livello dei geni trascritti mentre l’altro ripara i danni nella restante componente

del genoma. È stato il primo pathway di riparazione al DNA ricostituito in vitro in cellule umane di

mammifero. I danni più importanti che ripara sono quelli dovuti ai raggi UV, ossia danni a cui il nostro DNA

è sottoposto quotidianamente, e sono i dimeri di pirimidina e i 6-4fotoprodotti. I dimeri di pirimidina

distorcono meno la doppia elica rispetto ai 6-4 fotoprodotti con un rapporto di 3 a 1. La fotoliasi che protegge

dai danni è quella in grado di revertire i CPD che sono anche meno riconosciuti dal NER in quanto distorcono

meno la doppia elica. Il NER è conservato da S. cerevisiae all’uomo. I geni si dividono in: geni che riconoscono

il danno XPA e XPC, elicasi XPD e XPB e nucleasi XPF e XPG. I due pathways sono:

- Global genome repair GCR: ripara i danni a livello di tutto il genoma

- Transcription coupled repair TCR: specifico per I geni trascritti e per i danni che riguardano l’elica

che serve come templato per l’RNA polimerasi

Si distinguono per i fattori e il metodo con cui

riconoscono il danno. Una volta riconosciuto il

danno, i successivi step di processamento sono

uguali nei due pathways.

Global genome NER: il danno viene riconosciuto dal

complesso XPC-rad23B, che recluta altri fattori quali

TF2H (ruolo essenziale per la trascrizione genica) e

due elicasi XPB e XPD che hanno il compito di aprire

il DNA e formare una bubble laddove vi è un danno.

il ssDNA viene ricoperto dalla ssBP RPA e arriva

un’altra proteina, XPA, che ha altissima affinità per

il DNA danneggiato la quale conferma il danno e le

nucleasi procedono con il taglio al DNA. Le

endonucleasi del NER sono XPF (complesso

costituito da due proteine ERCC1-XPF) e XPG che

tagliano a monte del danno e XPG taglia a valle, nel

3’, del danno. una volta effettuato il danno, il

segmento di DNA che contiene il danno viene

eliminato e le polimerasi replicative pol-delta (nelle

cellule che proliferano) e pol-epsilon e pol-k (nelle

cellule quiescenti) possono sintetizzare il DNA e si ha 57

la riparazione finale del danno dove la ligasi lega correttamente il DNA.

1) Riconoscimento del danno

2) Apertura della bubble

3) Endonucleasi che tagliano a monte e a valle del danno

4) Excisione del ssDNA danneggiato

5) Risintesi del DNA

Transcriptiona coupled NER: il

danno è riconosciuto dal

complesso RNApolimerasi e da

alcune proteine che legano il

complesso RNApolimerasi e dal

fatto che queste si bloccano in

prossimità della lesione. Queste

sono CSA e CSB e quando si blocca

il complesso in presenza del danno

si ha il reclutamento di TF2H che è

già presente nel complesso, XPB e

XPD aprono la bolla, si ha il

richiamo di RPA e XPA che

riconosce il danno e si ha l’azione

delle endonucleasi XPG e XPF-ERCC1 che tagliano a monte e a valle del danno e si ha eliminazione del ssDNA

danneggiato e risintesi del DNA.

È stato molto studiato in relazione alle lesioni causate da UV che sono riconosciute durante il NER. Diversi

complessi proteici riconscono queste lesioni che distorcono la doppia elica, come XPA e UVDDB che hanno

altissima affinità per questo tipo di danni. Ci si è chiesto come mai nel NER si abbia la presenza di tanti

complessi diversi. Nel Global genome NER a seconda del tipo di lesione e a secondo di quanto questa distorce

la doppia elica sono necessari i complessi XPC assieme alla Centrina-2 e il complesso UV-DDB. Il complesso

XPC è essenziale per il NER mentre il complesso UV-DDB aiuta il complesso XPC a vedere il danno. Nel caso

dell’RNA polimerasi che viene bloccata da una lesione, CSA e CSB svolgono un ruolo fondamentale affinché

la RNA polimerasi si accorga del danno e la elimini dal DNA e si possa procedere con la riparazione.

Recentemente si è visto che altri fattori sono essenziali, come UV-SSA, ubiquitin proteasi che tolgono i residui

di proteine in modo che la RNA polimerasi si accorga della lesione e dall’altro lato la RNA polimerasi stessa

deve allontanarsi dalla lesione per permettere che il NER possa agire correttamente.

XPC e il complesso UV-DDB: il complesso UV-DDB presenta alta affinità per il DNA danneggiato ma non è

essenziale affinché il NER avvenga in vitro. Si è scoperto che si hanno modalità diverse di riconoscimento tra

i CPDs e i 6-4 fotoprodotti dovuta al fatto che i CPD non distorcono molto la doppia elica del DNA. I 6-4

fotoprodotti invece, lasciano del ssDNA che è facilmente riconoscibile dal complesso XPC-rad23 B. questo

complesso XPC-rad23 B non lega direttamente la lesione ma lega il ssDNA difronte alla lesione. Nel caso di

CPDs è necessario il complesso UV-DDB che li riconscono con alta affinità e procedono con il ribaltamento

degli CPDs fuori dalla doppia elica e creando una zona di riconoscimento dal complesso XPC-rad23B. i 6-4

fotoprodotti possono essere riconosciuti direttamente dal complesso XPC-rad23B e ciò vale anche per altri

composti aromatici che possono distorcere la doppia elica. Il complesso UV-DDB può anche aiutare al

riconoscimento dei 6-4 fotoprodotti. 58

Nella regolazione del NER gioca un ruolo essenziale l’ubiquitinazione, dove si è visto che regola lo step iniziale

di riconoscimento del danno, perché il complesso UV-DDB è costituito da diverse proteine: DDB1, DDB2

CUL4A, che recluta il COP9 che si stacca quando viene riconosciuto il danno e si ha la modifica delle culina a

cui segue la metilazione e si ha l’attivazione del complesso E3 ligasico. Viene poliubiquitinato DDB2 che ha

altissima affinità per il DNA danneggiato. Questa ubiquitinazione permette quindi il reclutamento successivo

delle proteine del NER. L’ubiquitinazione di XPC porta ad una sua maggiore affinità per il DNA danneggiato.

Lo stesso complesso della cullina ha un ruolo, assieme a DDB1, nel transcritional NER, dove si hanno eventi

di poli-ubiquitinazione di XPC in modo che si attivi il NER. Nei primi step di riconoscimento del danno si hanno

eventi di poli-ubiquitinazione in entrambi i pathways e servono per liberare la lesione dal complesso UV-DDB

e anche per rendere più efficienti le proteine che riconoscono il danno e permettere la successiva riparazione

del danno. una volta riconosciuto il danno in TC-NER la RNApol deve spostarsi dalla lesione e in alcuni casi

indietreggia, secondo un meccanismo definito come back trapping, e in altri casi viene degradata la sub

catalitica, soprattutto quando i danni sono tanti a livello del DNA e il NER deve agire rapidamente.

Le lesioni dovute alle radiazioni ultraviolette avvengono a livello della cromatina e si hanno una serie di

modificazioni post-traduzionali sia nel GC-NER sia nel TC-NER e si hanno dei complessi proteici che

modificano la cromatina in modo da riuscire a rimuovere gli istoni affinché il NER possa agire. Una volta che

il DNA viene riconosciuto e riparato si deve avere il ritorno degli istoni per poter tornare al precedente stato

cromatinico. Una volta che il DNA è danneggiato a seguito di UV, si accende anche la cascata di trasduzione

del segnale che è attivata dal danno al DNA (DNA damage checkpoint), in quanto il ssDNA che è coperto

dall’RPA è il segnale di attivazione del DNA damage checkpoint. Il segnale che attiva la chinasi apicale ATR e

attiva il pathway che porta all’arresto del ciclo cellulare per poter riparare il DNA. Questo segnale parte anche

durante la replicazione del DNA dove le DNA polimerasi non sono in grado di procedere in presenza di lesioni

da raggi UV e quindi si arrestano, il ssDNA viene coperta da RPA che attiva la chinasi apicale.

I geni sono chiamati XP perché sono stati studiati in una malattia definita come Xerodama Pgmentosum che

presenta difetti nel NER. Altre malattie associate a difetti nel NER sono: la sindrome di Cockayne, e la

Trichotihiodystrophy tutte contraddistinte da alta sensibilità alla luce solare. XP è una malattia che può

avere un’alta incidenza nell’insorgenza di tumori alla pelle. I bambini affetti se non esposti alla luce solare

possono condurre una vita normale ed arrivare all’età anziana. I pazienti affetti dalla CS e TTD non sviluppano

tumori alla pelle ma presentano un grave ritardo di sviluppo e mentale (in quanto si accumulano danni a

livello dei neuroni e si hanno soprattuto difetti a livello trascrizionali nella sindrome di Cockayne) e ha

caratteristiche molto particolari, dove la CS porta ad un invecchiamento precoce dei bambini, mentre nella

TTD hanno problemi a livello della cheratina e dei capelli. Nello XP abbiamo difetti sia nel CG-NER e nel TC-

NER mentre le sindromi CD e TTD presentano difetti in TC-NER. Infatti, i geni CSA e CSB sono stati identificati

in pazienti affetti da CS, si hanno infatti problemi nella ripresa della trascrizione a seguito di danno.

Le cellule XP non sono in grado di accumulare i nucleotidi radioattivi e ha portato allo sviluppo di un saggio

in vitro, dove i fibroblasti quiescenti sani vengono irraggiati con luce UV, incorporano i nucleotidi radioattivi

che vengono visti da una lastra fotografica, ma se si prelevano le stesse cellule da pazienti XP queste non

sono in grado di incorporare nucleotidi radioattivi e sono difettivi nell’UDS unscheduled DNA syntheshis. Ciò

ha permesso di classificare i pazienti come XP. Questi studi hanno permesso di identificare i geni XP. Grazie

alla fusione di cellule provenienti da diversi pazienti si capì che esistono 7 diversi gruppi di

complementazione XP. Successivamente si sono clonati i geni mediante complementazione di cellule CHO.

Si sono isolati geni ERCC perché questi mutanti sono serviti per clonare i geni umani. Si vedeva che se si ha

una cellula CHO con mutazione nel NER che sensibile alla radiazione UV e fusa con fibroblasto umano di

persona sana, le cellule CHO divisione dopo divisione espellono tutti i cromosomi umani e ne tengono solo

uno. Se questo contiene il gene che complementa nelle cellule la mutazione allora si riusciva a risalire al gene

59

che risiedeva in quel cromosoma. Una volta identificati i geni si è arrivati alla purificazione delle proteine e

alla loro analisi biochimica. Ciò ha permesso lo studio delle loro funzioni. I saggi in vitro utilizzati

permettevano di vedere se in provetta funzionavano i vari componenti isolati. Sono stati usati due saggi:

- Wood: misura l’incorporazione di nucleotidi radioattivi: se in vitro si ha una lesione e agisce il NER e

diamo un nucleotide di cui uno è radioattivo abbiamo incorporazione di radioattività nel plasmide

- Sancar: misura excisione in vitro. Di fianco al danno nel plasmide si ha un nucleotide radioattivo e se

il NER agisce si ha un frammento exicso che contiene la lesione e anche il nucleotide radioattivo.

Questi saggi sono stati effettuati con cellule Hela. Prelevando gli estratti cellulari (totali o nucleari) e

facendoli passare attraverso delle colonne di affinità che legano proteine (nel caso di proteine che legano il

DNA si usa la fosfocellulosa grazie alla presenza di cariche positive in quanto il DNA è carico negativamente).

Si ottiene una colonna che lega le proteine e la colonna viene lavata con un buffer che ha un gradiente di

salinità crescente. Si raccolgono le diverse frazioni e si ottengono proteine diverse. A basse concentrazioni

per KCl si hanno proteine con minore affinità per il DNA. Queste diverse frazioni vengono ripassate ad altre

colonne e si raccolgono le diverse frazione e si combinano con le precedenti per vedere dove si ha la proteina

di interesse.

Per vedere se il NER agiva in maniera sequenziale oppure come un unico riparosoma si sono condotti degli

esperimenti di FRET che sfrutta l’autofluorescenza della GFP fusa alle proteine del NER. Al microscopio a

fluorescenza specializzati con dei laser ad alta energia blechanno gli epitopi fluorescenti. Se il laser viene

fatto passare solo in una zona nel nucleo si può monitorare nel tempo il ritorno della fluorescenza grazie al

moto delle proteine. Si nota che nel tempo la fluorescenza ritorna, ma non ritorna mai al massimo del

precedente fotobleaching e la velocità di ritorno della fluorescenza indica la velocità di spostamento della

proteina in esame. Ciò indica che vi sia un’unica proteina che si muove, perché se fosse un unico complesso

farebbe fatica a migrare. Dopo irraggiamento la mobilità di queste diminuisce perché sono reclutate a livello

dei danni indotti al genoma.

Substrati del NER:

• CPD

• 6-4PPs

• Cisplatino (chemioterapici)

• Idrocarburi aromatici (fumo e scarichi auto)

• amine aromatiche (insetticidi)

tanto maggiore è la distorsione della doppia elica tanto più è efficiente il NER. Le cellule dei vari pazienti XP

venivano irraggiate con luce UV e utilizzando dei filtri di policarbonato che presentano dei pori, solo una

porzione del nucleo viene irraggiata. Dopo irraggiamento queste cellule vengono fissate e vengono fatti

esperimenti di immunofluorescenza che riconscono determinate proteine. Gli anticorpi primari vengono

riconosciuti da anticorpi secondari si può vedere sia la localizzazione dei danni sia la localizzazione delle

proteine. In questo modo è possibile sapere l’ordine di arrivo delle varie proteine del NER sul danno. si hanno

dei fibroblasti normali, XPA, e fibroblasti XPC e si è visto che irraggiando i fibroblasti si ha localizzazione di

XPC e XPB, XPA a livello del danno. fibroblasti XPA non localizzano XPA, ma XPC e XPB riescono ad arrivare al

DNA. Fibroblasti XPC invece non reclutano XPA e XPB a livello della zona danneggiata. Fibroblasti XPF sia XPA

sia XPG si localizzano a livello dell’irraggiamento. Ciò ha permesso di capire la sequenzialità delle proteine

del NER. 60

10/05/18

Double strand break repair

dsDNA break sono quelli più citotossici prodotti da agenti esogeni (radiazioni ionizzanti, ROS) ed endogeni.

Si hanno 2 grossi pathways di riparazione:

- ricombinazione omologa

- giunzione delle estremità

la scelta dei pathways deve essere estremamente regolata. La ricombinazione omologa avviene durante la

fase S-G2 del ciclo cellulare quando è presente il cromatidio fratello in quanto viene usato come templato.

La ricombinazione omologa è il pathway di riparazione che viene eseguito anche durante la meiosi. In quasi

tutte le fasi del ciclo può agire il NHEJ che implica l’avvicinamento delle estremità del DNA, ma è un pathway

che porta all’accumulo di mutazioni e in particolare delezioni e inserzioni di base. I tagli alla doppia elica

possono avvenire spontaneamente, causati da RAG1 e RAG2 durante la class switch ricombination o durante

la ricombinazione VDJ. Possono essere indotte anche da SPO11 durante la meiosi. Durante la replicazione i

ssb si trasformano in dsb e qualsiasi evento che blocca la forca replicativa può portare alla degenerazione

della forca stessa e causare dsb. La cellula comunque ha alta capacità di riparazione del danno.

Cellule di lievito trattate con neomicina, che causa tagli alla doppia elica, si vede che a seguito dell’estrazione

del DNA non si hanno cromosomi integri, ma se la neomicina viene rimossa e le cellule vengono rilasciate

nel terreno di coltura per 12-24h si nota che le cellule che sopravvivono riescono a riparare tutti i dsb e si

hanno i cromosomi integri. Tutti questi apparati di riparazione sono estremamente efficaci. I diversi tagli

devono essere tenuti vicini cosa che viene garantita da entrambi i pathways. Le cellule tumorali perdono

anche la capacità di tenere vicini i dsb.

S. cerevisiae è stato un buon modello per studiare i dsb. Si erano raggruppati i mutanti RAD in 3 gruppi di

complementazione dove il gruppo RAD52 presenta tutti i geni difettivi coinvolti nella risposta a radiazioni

ionizzanti e in particolare servono per la ricombinazione omologa, che si pensava che fosse l’unico

meccanismo presente all’interno di lievito, questo perché la fase G1 del ciclo cellulare è molto veloce e quasi

tutte si trovano nella fase S G2 del ciclo cellulare. In esperimenti con radiazioni ionizzanti, il DNA viene fatto

migrare in gradienti di saccarosio e vengono raccolte diverse frazioni: nelle prime frazioni si hanno frammenti

più grandi e nelle ultime frazioni si hanno frammenti più piccoli. Si vede che tutto il DNA nel momento in cui

la cellula non è irraggiata fuoriesce tra la frazione 10-15, se poi si irradia la cellula il DNA si accumula attorno

alla frazione 30 e successive. Se dopo irraggiamento si aspettano 3h i frammenti tornano ad essere grandi e

si ha il ritorno ad una situazione pre-irraggiamento e quindi si ha l’azione dei meccanismi di ricombinazione

che riparano i tagli alla doppia elica del DNA. Un ceppo con mutazione in RAD52 che è coinvolto in quasi tutti

i sottopathways di riparazione del DNA, anche dopo 3h, presenta il DNA con frammenti piccoli e nessun

danno alla doppia elica era stato riparato. Questi esperimenti hanno permesso di identificare tutti i geni del

gruppo di epistasi di RAD52.

Vi sono diverse modalità di riparazione dei dsb:

- il taglio può essere riunito mediante NHEJ con perdita o inserzione di basi

- processamento delle estremità mediante nucleasi che digeriscono le estremità, il modo da generare

un’estremità 3’ protruding a singola elica che può invadere il templato con sequenza omologa

affinché avvenga la riparazione mediante ricombinazione omologa

BIR (break induce replication) meno frequente, dove il 3’ protruding si inserisce nella

o sequenza omologa del cromosoma e si inserisce in una forca replicativa e viene copiato tutta

61

la sequenza omologa che viene invasa fino a ristabilire tutto il DNA. In questo modo si ha

perdita di eterozigosi

Ricombinazione omologa classica con invasione, inizio di sintesi del DNA, appaiamento

o dell’altra estremità del dsb e formazione della holliday juction, che verranno poi risolte dalle

resolvasi. Si verifica anche durante la fase meiotica. In mitosi, però, non sempre porta alla

formazione della holliday junction e alla risoluzione tramite resolvasi (si verifica nel 25% dei

casi). Nella maggior parte dei casi delle elicasi risolvono la struttura e la via viene definita

come SDSA. Una volta che si ha il processamento del dsb ed esposizione del 3’ protruding, se

si hanno delle sequenze ripetute a monte e a valle del dsb, si possono avere SSA

- SSA: Le sequenze ripetute si appaiano e delle endonucleasi tagliano le strutture a flap e delle ligasi

risigillano il DNA. Si hanno perdite di sequenze e non è una via favorita. Viene eseguita in zone del

genoma con sequenze altamente ripetute

Tutti questi meccanismi dipendono dal processamento del dsb e sono tutti RAD52 dipendenti. La via più

seguita in mitosi è SDSA.

NHEJ

Inizialmente si pensava non esistesse in S. cerevisiae, ma si pensava che fosse l’unico pathway che riparava

il dsb nel ciclo mitotico nelle cellule eucariotiche. Ma ciò non è vero perché il meccanismo di riparo dipende

dalla fase del ciclo cellulare:

- G1 la via preferenziale è NHEJ, che in S. cerevisie è molto breve. In questo caso è difficile trovare

l’omologo per poter riparare secondo ricombinazione omologa e inoltre potrebbe essere pericolosa

e causare traslocazioni e riarrangiamenti.

- In fase S la via preferenziale è la ricombinazione omologa in quanto non porta ad errori ma ripara

fedelmente il danno e non si hanno possibilità di riarrangiamenti. NHEJ non è favorito in questa fase

perché porta ad accumulo di mutazioni e inoltre è sfavorito nei geni altamente trascritti.

Gli esperimenti che hanno portato alla scoperta di NHEJ sono stati condotti con plasmidi linearizzati che non

presentavano omologia di sequenza con lievito e in presenza di RAD52 questi plasmidi venivano riparati e

mantenuti nelle cellule di lievito se invece si usavano dei doppi mutanti di RAD52 e del gene KU (responsabile

del riconoscimento dei tagli a doppia elica del NHEJ) non si avevano trasformanti perché il taglio a doppia

elica non riusciva ad essere riparato. In S. cerevisiae la delezione di KU non da sensibilità alle radiazioni

ionizzanti, ma se combinata alla mutazione RAD52 aggrava la sensibilità dei mutanti indicano che il NEHJ ha

un ruolo importante anche in lievito.

In presenza di dsb, la scelta tra NHEJ e ricombinazione omologa dipende dalla fase del ciclo cellulare: NHEJ

agisce durante la fase G1, mentre nelle fasi S-G2 quando i due cromatidi fratelli sono vicini i dsb vengono

riparati via ricombinazione omologa e il cromatidio fratello intatto viene definito come donor sequence.

Quali sono i fattori che determinano una via o l’altra? Molto importanti sono le CDK. Se la scelta del pathway

non avviene in maniera corretta si hanno dei grossi riarrangiamenti, dove NHEJ può causare traslocazioni

con la formazione di cromosomi dicentrici e riarrangiamenti genomici. Il processamento dei dsb durante la

fase G1 in assenza del cromatidio fratello può portare ad una spinta verso i pathways di riparazione che

portano a delezione nel dsb a seguito di appaiamento di sequenze ripetute indotte da MMEJ, SSA. Il MMEJ

indica l’appaiamento di alcune basi e grosse delezioni.

Nel NHEJ si hanno delle proteine che riconscono il taglio alla doppia elica del DNA e sono il dimero KU70/80

che legano una protein kinasi DNA-PK molto abbondante nel nucleo e lega i dsb. Si hanno delle proteine che

processano il dsb dove si ha sempre un taglio sfalsato e delle basi danneggiate, come la nucleasi Artemis che

62

processa il dsb e anche proteine che processano le estremità, polimerasi che possono inserire una o più basi

sulle quali può agire la ligasi accoppiata a XRCC4 in modo che agiscano in maniera sequenziale e ordinata.

Mutazioni nelle proteine coinvolte nel NHEJ trovate in pazienti immunodeficienti: Radiation sensitive severe

combined immunodeficiency (RD-SCID).

Il dimero KU70/80 ha alta affinità per i dsb che legandosi a questi circonda il DNA e richiama le altre proteine

del NHEJ, tra queste la DNA-PK che fosforila una serie di substrati e manda dei segnali per iniziare la

riparazione per NHEJ. La DNA-PK viene attivata dalla nucleasi Artemis. Il NHER elimina i nucleotidi

danneggiati oppure inserisce dei nucleotidi ad opera di pol-lambda e pol-nu. Ai diversi fattori implicati nel

NHEJ si aggiungono dei fattori accessori come PNK, PALF, APTX in modo da processare il dsb ed eliminare

eventuali basi danneggiate o estremità non compatibili con l’azione della ligasi. Quando le estremità sono

processate, agisce il complesso ligasico che è comporto da due fattori XRCC4-XLF e dalla ligasi 4, che è

specifica per il NHEJ, formando un complesso definito come complesso cernunnos in relazione alla sindrome

di cernunnos dove tale complesso risulta mutato. Il complesso cernunoos forma un’impalcatura che

permette alle proteine di processare il DNA e successivamente permette alla ligasi 4 di legarsi ad esso.

Questo meccanismo viene definito come classical NHEJ, dove si ha una riparazione veloce del dsb con

avvicinamento delle due estremità ad opera di KU70/80 e dalla DNA-PK che funziona da ponte tra i due

eterodimeri KU70/80 reclutando e attivando tutto il complesso delle nucleasi e polimerasi che possono

aggiungere nucleotidi anche in assenza di templato. Nella maggior parte dei casi si tratta di un’unione e

riparazione del dsb estremamente error prone. Molti di questi fattori sono stati trovati mutati nella RD-SCID,

dove si ha un’assenza di produzione di anticorpi e immunodeficienza severa. NHEJ può agire in presenza di

tanti tagli alla doppia elica e causare anche traslocazioni portando alla formazione di cromosomi acentrici e

dicentrici. Tutte queste traslocazioni sono tipiche delle cellule tumorali. Nel cromosoma 14 si hanno molti

frammenti genici delle Ig per la formazione della catena pesante è spesso interessato da traslocazioni che

sono tipiche dei linfomi. Il linfoma di Burkitt ha portato alla scoperta dell’oncogene myc e si ha una

traslocazione tra il cromosoma 8 e il cromosoma 14 causando l’overespressione di myc e causando il linfoma.

Questo è dovuto ad un malfunzionamento del NHEJ, dove RAG1 e RAG2 portano alla traslocazione. Nelle

cellule B il cromosoma 14 subisce spesso delle traslocazioni che possono essere molto gravi.

in presenza di dsb le estremità

vengono protette dal dimero

KU70/80 se avviene NHEJ si ha

l’introduzione di danni. Negli

altri pathways si ha il

processamnto dei dsb che

risulta essere utile e auspicabile

durante la fase S e G2 del ciclo

cellulare, ma se questo

processamento avviene

durante la fase G1 del ciclo

cellulare può dare origine ad un

pathway che viene eseguito

dalla MMEJ, dove piccole

ripetizioni a monte o a valle del

dsb vengono appaiate e quindi, similmente al SSA, si hanno grosse delezioni comprese tra le sequenze

ripetute. 63

Il processamento delle estremità deve essere estremamente regolato. Si è visto nelle cellule KU- hanno un

processamento del dsb che è molto rapido e si ha un joining mediato da micro-omologie che si appaiano e

le nucleasi tolgono dell’estremità e si assiste all’appaiamento e la ligasi restaura il DNA. Nel MMEJ si ha

l’azione di RAD1 che taglia l’estremità a singola elica ed è stata identificata perché mediante mutazioni

combinate con RAD52 e KU- aggrava ulteriormente il fenotipo. Si pensava che questo pathway venisse

attuato solo in condizioni estreme, ma si è visto che molte traslocazioni che riguardano tumori ereditari e

spontanei, ma anche malattie ereditarie come la fibrosi cistica, siano dovuti al MMEJ. Si ha una PARP e dei

fattori per il processamento delle estremità come MRN CtIP, polimerasi translesione pol delta e XRCC1 che

serve a ristaurare il DNA. Questo pathway di riparazione è uno degli ultimi in fase di studio in quanto alcune

fasi non sono ancora note.

Nel 95% dei casi di leucemia mieloide cronica si ha una traslocazione 9-22 che porta alla fusione di BCR e ABL

con la formazione di una chinasi iperattiva. Si nota che sia a monte che a valle della traslocazione si hanno

zone altamente ripetute causate probabilmente da MMEJ. Questo stesso meccanismo è stato visto in

retinoblastoma e fibrosi cistica. 64

16/05/18

Ricombinazione omologia: diversi sotto-

pathways

La ricombinazione omologa è il meccanismo di riparazione più fedele e avviene durante le fasi S e G2 del

ciclo cellulare quando è presente il cromatidio fratello che può essere usato come templato. Se questa

avviene durante la fase G1 del ciclo cellulare e non è presente il cromatidio fratello, può essere utilizzata la

sequenza di un altro cromosoma si possono avere dei riarrangiamenti. Questo pathway viene sempre

eseguito durante la meiosi nel crossing-over. Ci sono diversi sotto-pathways. Il primo step è il processamento

dei dsb. Una volta che si ha il dsb processato possono seguire due eventi distinti: o le estremità sono protette

o delle nucleasi iniziano a processare le estremità (reseption) che porta alla formazione di ssd 3’ protruding.

Nel caso in cui le estremità siano protette si segue il NHEJ che rendono le estremità compatibili e si ha l’azione

della DNA ligasi 4 che riunisce le estremità. È un pathway non fedele in quanto porta alla delezione dei

nucleotidi e se avviene in zone codificanti del genoma è disastroso per la cellula. Se le endonucleasi

digerisocno il DNA si ha la formazione delle estremità 3’ protruding e diverse strade vengono seguite. Se si

ha la ricombinazione omologa si ha l’invasione di una sequenza omologa a cui segue una fedele riparazione

del taglio alla doppia elica del DNA. Nel caso in cui non si abbia vicino una sequenza omologa, come nella

fase G1 del ciclo cellulare, si seguono altre vie come il MMEJ e il SSA. Il MMEJ viene anche chiamato

alternative end joining e si hanno delle sequenze ripetute a monte e a valle del dsb che si possono appaiare,

i flap di ssDNA possono essere tagliati e il DNA è processato dalla polimerasi e la ligasi 3 restaura il DNA ad

una situazione di dsDNA. Questa riparazione va a spese dei nucleotidi che si trovano tra queste sequenze

ripetute. Nel SSA si hanno sequenze più lunghe che si appaiano (DNA ribosoma) e il ssDNA si può appaiare e

i flap vengono tagliate dalle nucleasi e la ligasi 1 lega il DNA e porta ad una situazione di DNA intatta. Si hanno

delezioni si sequenze tra le sequenze ripetute.

Nella ricombinazione omologa si hanno diversi sottopathway ma condividono un meccanismo comune dove

il ssDNA viene legato da RAD51 che forma un filamento nucleoproteico che si avvolge attorno al DNA e ha

la capacità di invadere una sequenza omologa. I sottpathways sono 3:

- SDSA

- BIR

- Ricombinazione omologa classica

I primi dati che sono stati raccolti sulla ricombinazione omologa provengono dall’osservazione della meiosi.

All’inizio del ‘900 Morgan aveva notato che in Drosophila avveniva un riassortimento genico e che questo

fosse dovuto ad eventi di rottura dei cromosomi. Nella ricombinazione omologa classica si deve avere il

riconoscimento del dsb mediante specifici elementi, il processamento ad opera di nucleasi che porta alla

formazione di ssDNA 3’ protruding e grazie alla ricombinasi RAD51 si assiste all’invasione della sequenza

omologa che funge da donor (templato) e si ha la sintesi del DNA (5’->3’). Nella ricombinazione classica anche

la seconda estremità viene processata e si ha la formazione delle Holiday junction. Durante la ricombinazione

meiotica si hanno delle nucleasi che risolvono queste strutture. Durante la meiosi si hanno delle

topoisomerasi o delle nucleasi.

- Riconoscimento

- Processamento delle estremità

- Formazione del 3’ protruding

- Formazione del D loop 65

- Se anche l’altra estremità viene cattura si ha la second end junction

- Formazione della Holiday junction

- Risoluzione della Holiday junction

SSA: non si ha invasione di una sequenza omologa, ma si hanno sequenze ripetute a monte e a valle che si

appaiano, seguite da delezione di tutta la zona delle sequenze che si appaia.

BIR: è un pathway particolare che avviene raramente, ma si ha quando il dsb è all’estremità del cromosoma.

Quando si ha la formazione ssDNA 3’protruding, questo può invadere la sequenza omologa del cromatidio

fratello e si ha la formazione di una sorta di forca replicativa, inizia la replicazione che procede fino a

raggiungere l’estremità del cromosoma. Il cromosoma che è stato invaso funziona da templato per la

replicazione del DNA che procede fino all’estremità terminale di questo.

SDSA: è il pathway che viene più seguito nel ciclo mitotico. In questo caso dopo la resection il ssDNA invade

la sequenza omologa e si ha l’inizio della replicazione del DNA che non procede fino alla fine, ma solo per un

centinaio di nucleotidi. Anche l’altra estremità del ssb può essere processata e delle elicasi risolvono la

struttura e le ligasi risigillano il DNA e si ha la fedele riparazione del dsb. Non si hanno eventi di crossing-over

e non si ha il riarrangiamento dei geni attorno al dsb.

Ricombinazione classica: è un processo simile al SSA in quanto si ha invasione della sequenza omologa

(template), sintesi del DNA, e anche a livello dell’altra estremità si ha sintesi del DNA e formazione delle

doppie Holiday junction che possono scorre e migrare. La double Holiday junction può essere risolta da un

complesso topoisomerasico che risolve la struttura senza riarrangiamento genico oppure da delle nucleasi,

resolvasi, che riconoscono le Holiday junction e le tagliano. A seconda di come tagliano la Holiday junction

si hanno eventi di crossing-over con riarrangiamento dei geni fiancheggiateti oppure di non-crossing-over. A

seconda di come la resolvasi taglia la Holiday junction.

Tantissime proteine sono coinvolte in ciascuno degli step della ricombinazione omologa. È un processo molto

regolato. La combinazione omologa inizialmente è stata studiata nel processo meiotico dove la sequenza

omologa che serve a riparare il dsb è il cromosoma omologo, che possono avere geni diversi. In presenza di

dsb durante la ricombinazione omologa, questo viene creato dalla nucleasi spo11, si ha la formazione di un

DNA a singola elica 3’ protruding che invade l’omologo e si assiste alla formazione di un D-loop o giunzione

di Holiday. Le due sequenze di DNA non sono identiche e si possono avere dei nucleotidi che non si appaiano

e MSH4 e MSH5 riconoscono i missappaiamenti e li riparano. Dopo la sintesi del DNA a livello delle estremità

e viene copiata anche l’informazione del cromosoma omologo e questo processo viene definito come gene

conversion. Si possono avere eventi di crossing-over o non crossing-over. Guardando i geni fiancheggianti e

a seconda di come la giunzione di Holiday viene tagliata dalle resolvasi si possono avere riarrangiamenti. Il

riarrangiamento e la gene conversion non sono eventi auspicabili nel ciclo mitotico in quanto si potrebbe

avere la perdita di eterozigosità e portare all’espressione di geni che normalmente sono silenti.

Durante le fasi S e G2 la cellula vuole riparare il dsb con ricombinazione omologa, mentre durante la fase G1

vuole riparare i dsb via NHEJ. Diverse proteine agiscono nella resection, dove un complesso MRN

(Mre11/Rad50 e Nbs1 che è una proteina regolatoria). Questo complesso compete con l’eterodimero

KU70/80 per il legame al DNA. Il complesso MRN è attivato da una proteina, CtIP, che serve ad attivare

l’attività nucleasica della nucleasi MRe11 che taglia il DNA e innesca la resection alla quale partecipano DNA2

e EExo1 che digeriscono il DNA e si hanno code di DNA a singola elica che vengono protette da RPA.

Complessi BRCA2 e BRCA1 tolgono l’RPA dal DNA e lo sostituisco con RAD51 che darà luogo alla formazione

della HR. 66

Il complesso MRE11 è costituito da 3 sub: RAD50, Mre11 e

Nbs1. Ha altissima affinità per le estremità del dsb e ha attività

sia endonucleasica sia esonucleasica ed è responsabile dello

step iniziale della reseption. Rad50 forma delle strutture coil-

coil con un loop alle estremità che servono a tenere vicine le

estremità del dsb. Rad50 è proteina ABC-ATPasi come coesine

e mutS, dove al domino N e C-t si trovano vicini tra di loro a

formare una struttura coil-coild e al centro della proteina si ha

un hook domain che lega lo zinco e ripiega la proteina su sé

stessa con i due domini ATPasici che si trovano vicini e

costituiscono un unico dominio ATPasico in grado di legare e

idrolizzare l’ATP. Questo permette di legare le estremità del ssb

e di tenerle vicine. Sembrerebbe che MRE11 scorra sul DNA e

che non si leghi proprio alle estremità ma in prossimità di esse,

inoltre non si ha propriamente un dimero ma questo risulta

essere costituito da più subunità. Diverse molecole di RAD50 sono tenute insieme tramite l’hook domain in

modo da tenere vicine le estremità del dsb, come il dimero KU, in modo da evitare traslocazione e

aneuploidie. MRE11 contiene anche Nbs1 che lega la chinasi apicale del DNA dame checkpoint ed è in grado

di accendere la cascata di attivazione del segnale mediante il legame di ATM. Il complesso KU70/80 lega le

estremità del dsb e grazie alla DNA-PK, tiene assieme le estremità e attiva il DNA damage checkpoint.

All’inizio della resection MRN taglia il DNA a valle del dsb, ad

una distanza di 10 nucleotidi. Una volta che CtIP viene

fosforilata dalla cdk, attiva l’attività endonucleasica di MRe11

formando un nick a livello del DNA. Inizia la resection che

avviene in maniera bidirezione con l’attività esonucleasica che

va verso l’estremità del dsb e le altre esonucleasi che

processano in direzione opposta (Exo1 e DNAasi2) e il ssDNA

viene ricoperto dalle RPA. Invece, il dimero KU occupa le

estremità del dsb e se il complesso MRE11 non è attivo parte il

complesso del NHE, mentre se MRE11 è attivo questo spiazza

il dimero KU 70/80. Una volta che RPA copre il ssDNA viene

sostituita da RAD51 e si ha HR.

Sono state trovate numerose malattie ereditarie che presentano mutazioni a livello dei fattori implicati nella

resection, come a carico di BRCA1/2 che sono importanti nel caricamento di RAD51. MRE11 è stato trovato

alterato nell’ATLD, mentre Nbs1 in NBS. Molti di queste sindromi presentano atassia, ritardi nello sviluppo e

tumori.

RAD51 è una proteina molto conservata dai procarioti fino a noi. Queste vengono caricate sul ssDNA da

diverse proteine. In lievito, per togliere RPA, si ha l’azione di RAD52 che toglie RPA e aggiungere rad51. Nei

mammiferi CTRB-RAD51 spiazza RPA e perette il caricamento di RAD51. È la proteina che ha la capacità di

scambiare il filamento. In vitro RAD51 scambia i filamenti dove il ssDNA viene scambiato con un filamento

del dsDNA sia che questo sia aperto o chiuso. Questo avviene in quanto si avvolge ad una proteina elicoidale

che si lega sia al dsDNA che al ssDNA. Infatti, gli basta un piccolo stretch del ssDNA per poter mediare la

sostituzione. Quando si avvolge al dsDNA lo allunga e la lunghezza complessiva del DNA aumenta di 1,5 volte.

Studi recenti hanno mostrato che lascia 3 basi vicine e poi allunga. RAD51 si avvolge lungo il ssDNA in maniera

direzionale e si ha un filamento di ssDNA si avvolge e forma una spirale attorno al ssDNA più velocemente in

67

direzione 5’->3’ rispetto che alla direzione opposta, spiegando il motivo che la resection agisce lasciando

un’estremità 3’ protruding permettendo la rapida azione di rad51. Se il filamento viene visto in sezione

trasversale, questo invade il dsDNA e si avvolge ad esso formando una struttura a triplice elica dove RAD51,

mediante l’uso di ATP, apre le coppie di basi del dsDNA per vedere se vi è appaiamento con il ssDNA. Una

volta che più basi trovano complementarietà allora procede altrimenti il ssDNA si stacca. RecA si avvolge

momentaneamente sulla triplice elica che si forma. La ricerca dell’omologia avviene per triplette.

Lo step principale che viene regolato è la resection, dove vi sono alcuni fattori che regolano quanto il DNA

deve essere processato. Un altro step che viene regolato è la capacità di RAD51 di formare il filamento,

soprattuto a livello di BRCA2. È la CDK che regola la resection fosforilando CtIP, nella fase S e G2 del ciclo

cellulare. Degli studi recenti hanno rivelato che anche le elicasi sono fosforilate. BRCA2 è fosforilata e resa

inattiva nelle fasi G1 e G0 del ciclo cellulare e defosforilata durante la fase S e G2 ad opera di una fosfatasi

attivata dalla CDK.

Nel momento in cui non si ha più un corretto bilanciamento tra NHEJ e HR: se nella fase S si forma un ssb

che viene convertito durante la replicazione in dsb e se non viene riparato mediante HR, il NHEJ agisce e si

possono avere segmenti di DNA provenienti da cromosomi diversi e portare alla formazione di cromosomi

dicentrici che causano anche aneuploidie. Se la resection non è regolata finemente e avviene durante la fase

G1 del ciclo cellulare si ha un incremento di MMEJ e SSA che portano a delezioni e riarrangiamenti

cromosomici.

17/05/18

La ricombinazione omologa è il metodo preferito dalla cellula per riparare i danni al DNA durante la fase S e

G2. Quando si hanno dsb parte la resection, che è attivata dalla CDK, e delle nucleasi processano il dsDNA e

creano un 3’ protruding che invade le sequenze omologhe e si può avere la sintesi del DNA che è limitata a

poche decine di basi (massimo 100 basi). Si ha l’azione di un complesso di elicasi e topoisomerasi che

dissolvono la struttura e si ha il riappaiamento delle eliche del DNA che si erano precedente rotte e la ligasi

ripara il DSB senza nessun errore, mutazione e senza che avvenga il crossing-over. Questo si verifica nel 90%

dei casi. In un 10% dei casi si ha la formazione di una doppia Holiday junction che possono essere risolte dalle

topoisomerasi e non portano a crossing-over, oppure possono essere tagliate da resolvasi e a seconda del

piano in cui tagliano portano al crossing-over. Per vedere se si è verificato un evento di crossing-over si usa

una tecnica definita come sister chromatid exchange che è in grado di visualizzare gli eventi di crossing-over

nel ciclo mitotico. Il test si basa sulla capacità delle cellule di internalizzare al posto della timina la

bromodeossiuridina. Durante la prima sintesi del DNA tutti i cromatidi avranno un’elica con BrdU e una senza

BrdU. Durante il secondo ciclo di replicazione del DNA, si avrà una doppia elica con BrdU e un’elica normale

e una con BrdU. Se avvengono eventi di crossing-over è possibile visualizzarlo grazie al blocco delle cellule in

metafase con i cromosomi condensati ed è possibile vedere se avvengono sister chromatid exchange. Si

hanno dei cromosomi arlecchino se si verificano eventi di crossing-over a seguito degli scambi. Questo

permette di caratterizzare tutti i fattori che servono per gli scambi o per evitare questi scambi. Geni che

mutati danno un incremento di sister chromatid exchange portano ad instabilità genomica. Il complesso BTR

agisce per dissolvere le strutture e quando agisce porta ad eventi di non crossing-over. È costituito da

un’elicasi BLOM, dalla topo3 e da proteine accessorie che stabilizzano il complesso RMI1 e RMI2. Questo

complesso dissolve la struttura e porta alla formazione di due cromatidi fratelli separati senza

riarrangiamento genico. BLOOM è mutata nella sindrome di Bloom che è caratterizzata da un quadro clinico

complesso, nanismo, ritardo mentale e da alta instabilità genomica, sensibilità alla luce solare. Si assiste alla

mancata risoluzione delle joint molecules e le uniche che riescono ad agire sono le resolvasi che quindi

possono portare ad un incremento dei crossing-over. Se si prelevano le cellule dei pazienti si nota che hanno

68

un’alta capacità di crossing-over. Se il complesso non riesce a risolvere le joint molecules quelle che agiscono

a livello delle Holiday junction sono SLX1 e SLX4 (piattaforma a cui si legano diverse nucleasi MUSB1, SLX1 e

XPF) agiscono tagliando le Holiday junction e a seconda del piano di taglio possono dare origine ad eventi di

crossing-over. GEN1 è l’unica resolvasi degli eucarioti che da sola riesce a riconoscere le Holiday junction e a

risolverle. La resolvasi di E. coli, RuvC, è stata molto studiata e taglia i due filamenti che hanno la stessa

polarità in punti opposti e da origine a un taglio che può essere direttamente rilegato dalle elicasi. Per molto

tempo si è cercato di trovare la resolvasi negli eucarioti e si è visto che GEN1 eucariotica, viene attivata solo

a seguito di meccanismi che vengono attivati per ultimi. GEN1 umana è stata trovata mediante degli

screening di spettrometria di massa frazionando estratti di Hela e mediante omologia con RuvC. Yen1 è stata

trovata mediante uno screening su larga scala e saggi biochimici su tutte le proteine di lievito. Si hanno 3

diversi complessi

- BTR: resolvasi che risolve la struttura senza dare origine a crossing-over

- Mus1-MMs4

- Yen1

Questi complessi sono altamente regolati e il complesso BTR è attivo fin dall’inizio della fase S. è il primo che

agisce. Se i danni al DNA sono tanti e il complesso BTR non è riuscito ad agire su tutte le joint molecules, in

fase G2 viene attivato il complesso SLX4-SLX1. Sono in anafase è attivo Yen1 che serve a risolvere le ultime

strutture che sono rimaste e legano i cromatidi fratelli che sono pronti a migrare ai poli opposti della cellula

ma sono tenuti insieme da questi eventi di crossing-over.

SLX4-Mus84 è attivato a seguito di fosforilazione da parte della CDK e della polo-chinasi. Nella fase S e G2

questo complesso non è attivo. Yen1 è fosforilato dalla CDK dopo il passaggio dello start che la inattiva e solo

dopo la transizione metafase-anafase e cdc14 diventa attiva, questa agisce su Yen1 e la rende attiva.

A seguito della replicazione del DNA i due cromatidi fratelli sono vicini come anche gli omologhi e in una

percentuale molto bassa di casi il dsb, una volta processato, invece che usare il cromatidio fratello come

templato usa il cromosoma omologo. Durante la fase S e G2, il complesso BTR dissolve le strutture e si ha

irraggiamento del genoma con tanti dsb, alcune jonit molecules scappano dall’azione di BTR e in tarda fase

G2, quando sono attive le polo-chinasi, agisce SLX4 e mus1 che taglia e risolve queste strutture. Se il crossing-

over riguarda i due omologhi, l’azione di SLX4-Mus81 porta al crossing-over e se questo avviene tra gli

omologhi può portare alla loss of eterozigosis che può portare alla formazione di cellula tumorale.

Questi complessi sono finemente regolati durante il ciclo cellulare e tutte le volte in cui si ha regolazione

partecipa la CDK e GEN1, al passaggio dello start, viene fosforilato dalle CDK di fase S e poi si riattiva quando

il complesso APC-cdh1 si attiva assieme alla fosfatasi cdc14. Al contrario è attivato solo se viene fosforilato

prima dalle M-CDK e poi dalle polo-chinasi. Mutazioni in tutte queste proteine possono portare ad instabilità

genomica. Il compito delle resolvasi è di tagliare il DNA ed impedire che vi siano delle joint molecules durante

la mitosi che porterebbero alla formazione di bridges che durante l’anafase si possono rompere in quanto i

due cinetocori vengono tirati ai poli opposti e si hanno dei lagging chromosome che non vengno attaccati

dal fuso e portano alla formazione dei micronuclei. Questi eventi sono tipici delle cellule tumorali che hanno

molti dsb che vengono riparati, ma perdono l’azione di proteine implicate nella regolazione dei joint

molecules e si ha la formazione di ponti in anafase. 69

DNA interstrand cross-links (ICLs)

Implicano dei danni alle doppie eliche del DNA bloccando tutto il suo metabolismo. Sono causati da molti

agenti come il cis-platino, mitomicina C e gas mostarda. Si possono formare in modo spontaneo nelle cellule

a seguito di eventi di perossidazioni dei lipidi. Inoltre, anche reazioni di aldeidi portano a ICL. Questo pathway

è stato studiato nell’anemia di Fanconi che è data da un’alterazione a 21 diversi geni. Ha un quadro clinico

complesso con delle caratteristiche principali quali: problemi al midollo osseo (cellule staminali

ematopoietiche) e un’estrema instabilità genomica che porta ad un’elevata frequenza di tumori, come la

leucemia mieloide acuta, ma anche a diversi tumori solidi come cancro al seno, ovario, carcinomi che sono

la principale causa di morte di questi pazienti. Il pathway è complesso e il modo per capire se un paziente è

affetto da questa malattia è mediante la valutazione della sensibilità delle cellule dei pazienti ai ICLs. Questo

pathway ha ruolo in diverse vie cellulari come nel bloccare l’instabilità genomica e un pathway importante

nel mantenere la stabilità a livello delle cellule ematopoietiche a livello delle quali si ha un accumulo di danni

che portano al blocco del ciclo cellulare e perdono la staminalità e vanno incontro a senescenza. I blocchi

della forca replicativa vengono rincanalati nella ricombinazione omologa, bloccando il NHEJ durante la fase

S e inibendo la riparazione inaccurata dei tagli alla doppi elica del DNA durante la fase S. 8 geni, dei 21

coinvolti, formano un complesso nucleare che ha una precisa funzione ossia ubiquitinare il dimero FAND2 e

FANK. Nel momento in cui si ha un ICL o un blocco forte della forca replicativa durante la fase S, si ha

l’attivazione del complesso di Fanconi. Nel complesso si ha un core-complex nucleare costituito da numerose

protein, dove FANCM è in grado di riconoscere il blocco della forca replicativa ed è anche una traslocasi,

permettendo al complesso di viaggiare lungo il DNA. All’interno del complesso troviamo anche FANCL che è

un’ubiquitina ligasi E3 che porta all’ubiquitinazione del complesso I/D. Il dimero viene fosforilato dalle

chinasi apicali del DNA damage checkpoint e una volta che si attiva, attiva tutte le altre proteine a valle del

pathway di Fanconi e sono coinvolte nella ricombinazione omologa. Nonostante questa malattia sia molto

rara, mutazioni in eterozigosi sono frequenti perché molti dei geni del pathway di fanconi sono responsabili

dei tumori familiari come BRCA1/2, che sono coinvolti nel mantenimento della stabilità del genoma.

Nel momento in cui la replicazione del DNA si

interrompe, il core complex si attiva e ubiquitina

il complesso FAND2-FANK che viene fosforilato

anche dalle chinasi apicali come ATR (attivato dal

ssDNA coperto da RPA). Il dimero FAND2-FANK

attiva una serie di nucleasi all’ICL. A valle segue

l’attivazione di SLX4 che rappresenta la base per

le nucleasi XPF, MUS81 e SLX1, che portano

all’unhooking dove un cromatidio ha un dsb e

l’altro presenta un mono-addotto. L’ICL viene

trasformato in una lesione a livello di una base di

un filamento che distorce la doppia elica del

DNA. Si ha quindi la presenza di una polimerasi

che sintetizza il DNA difronte alla lesione. Uno

degli ultimi geni di fanconi identificato è stato

REV7 che è una sub di un complesso di

polimerasi translesione. Questa lesione viene

riparata dal NER. A livello dell’altro cromatidio

abbiamo un dsb che viene riparato per HR. 70

Uno studio condotto sui topi ha permesso di capire il ruolo dell’anemia di Fanconi, si è visto che la causa

endogena dei ICL è data dalla detossificazione degli aldeidi presenti nell’alcol che possono dare origine a

specie reattive che danno gli ICL. Questi processi si verificano anche in eventi di de-metilazione degli sitoni

o perossidazione dei lipidi. Uno dei principali enzimi che detossifica gli aldeidi nel nostro organismo è ALDH2.

I ricercatori combinarono mutazioni dell’ALDH2 con geni implicati nel pathway di fanconi. Una topolina con

ALDH2 mutata non poteva portare avanti la gravidanza un feto con mutazioni di un gene a livello del pathway

di fanconi mentre se presentava la ALDH2 wt il feto nasceva con anemia di fanconi. Questi studi suggerisco

che il comportamento della madre durante la gravidanza può influenzare moltissimo il quadro clinico del

nascituro. Molti individui in Asia presentano un allele dominante di ALDH2 che non è funzionante e l’anemia

di fanconi è poco diffusa in Asia e i pochi casi che si riscontrano hanno dei quadri clinici molto gravi. Esiste

un composto, Alda1 che stimola l’attività dell’ALDH2 e si sta usando per curare i bambini affetti da anemia

di Fanconi. Correlazione di anemia di fanconi con mitofagia…

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yetapia

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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in biologia applicata alla ricerca biomedica
SSD:
Università: Milano - Unimi
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher yetapia di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biologia molecolare applicata alla ricerca biomedica e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Milano - Unimi o del prof Marini Federica.

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