Biologia molecolare applicata alla ricerca biomedica

Biologia molecolare applicata alla ricerca biomedica

Federica Marini

Testi: - Morgan the cell cycle of control

Programma

• Meccanismi di base del ciclo cellulare (condizioni fisiologiche e non)
• Risposte cellulari ai danni al DNA (condizioni patologiche) e controllo della stabilità

Parziali e domande

1° parziale: 12 aprile

2° parziale: 8 giugno

4-5 domande aperte 101-03-2018

DNA damage response

Negli ultimi anni è stata molto studiata e rappresenta un meccanismo che si attiva nel momento in cui la cellula inizia a proliferare in maniera incontrollata. Esistono diversi tipi di pathways cellulari che portano a un rallentamento del ciclo cellulare e portano anche all’attivazione dei pathways di riparazione di danno al DNA. Vi devono esser delle proteine che sono implicate nella trasduzione del segnale e degli effettori di riparazione. Nel momento in cui una cellula inizia a dividersi in maniera incontrollata, va incontro a stress replicativo che porta a un impoverimento del pool di nucleotidi e insorgono dei danni al DNA – damage response – che è la prima barriera di risposta al cancro.

Questa cascata di trasduzione del segnale non è solo attivata da danni al DNA ma più in generale da situazioni da stress genomico, senza che vi siano direttamente dei danni al DNA. Le cellule tumorali sono in una situazione di genomic stress response (GRS). Una cellula prima di diventare tumorale deve accumulare più mutazioni, andare incontro a proliferazione non controllata e presentare anche riarrangiamenti cromosomici. Queste cellule, una volta diventate tumorali, iniziano il percorso di proliferazione incontrollata, l’unica differenza che le distingue da tutte le altre cellule dell’organismo è proprio la proliferazione incontrollata e per questo motivo la chemioterapia colpisce anche cellule che sono in attiva proliferazione, per questo si assistono a problemi di anemia a livello del midollo osseo e alopecia.

Ad oggi si sta cercando di sviluppare terapie personalizzate analizzando le caratteristiche specifiche del tumore in esame. Le cellule tumorali presentano un rate di mutazione più alto, dove alcune mutazioni sono vantaggiose, garantendone la proliferazione rapida e il superamento dei blocchi che servono a regolare la proliferazione, altre invece saranno svantaggiose. Tra le mutazioni più vantaggiose per una cellula tumorale si riscontrano nei geni riparativi, in modo che la cellula non ripari i danni al DNA e accumuli mutazioni che risulta essere un vantaggio per la cellula tumorale, nei termini proliferativi e invasivi di altri tessuti.

Nel momento in cui si ha una mutazione in un gene riparativo si ha l’insorgenza di aberrazioni cromosomiche e la maggior parte dei tumori presentano un corredo cromosomico poliploide o aneploide, permettendo di avere più copie di uno stesso cromosoma e le mutazioni che portano alla morte cellulare non vengono percepite dalla cellula. Le alterazioni del genoma, gross chromosomal rearrangements, sono dovuti a problemi nei pathways di riparazione al DNA. Nel momento in cui una cellula inizia a proliferare in maniera incontrollata portano ad un fenotipo mutatore, contraddistinto dall’incremento di mutazioni e da un vantaggio selettivo che portano al superamento di tutti i tipi di controllo.

Mutazioni e regolatori della proliferazione cellulare

Tra le mutazioni che la cellula deve accumulare per diventare tumorale esse si localizzano in geni che prevengono l’apoptosi, geni coinvolti nella risposta di antimitogeni (segnali di inibizione da contatto), geni implicati nel metabolismo di telomeri. In generale possiamo distinguere due possibili fattori:

• Regolatori positivi che promuovono la proliferazione cellulare
• Regolatori negativi che attenuano la proliferazione

Con l’aumentare dell’età si assiste ad un accumulo di mutazioni che possono portare ad una maggiore probabilità di tumori. Gli oncogeni sono geni che regolano positivamente la proliferazione cellulare e se vengono over espressi possono portare all’insorgenza della massa tumorale. I tumor soppressor presentano mutazioni di tipo loss of function mentre gli oncogeni presentano mutazioni di tipo gain of function.

In realtà la proliferazione incontrollata è recessiva rispetto alla proliferazione di una cellula normale. Sono stati fatti esperimenti fondendo cellule normali con cellule tumorali. La fusione venne fatta con polietilene glicolo. Le cellule fuse presentavano una proliferazione normale. Erano cellule poliploidi ed erano normali. A seguito di divisioni si ottenevano cellule normali ma anche cellule che tornavano ad essere tumorali. Queste cellule overesprimevano degli oncogeni. Esistono tantissimi oncogeni e oncosoppressori, come le CDK che sono regolate dalle cicline. Tutte le proteine coinvolte nella DNA damage response sono degli oncosoppressori.

Molti dei geni implicati nella DNA damage response sono implicati anche in malattie rare di tipo familiare che danno instabilità genomica, incidenza di tumori e neurodegenerazione.

Il ciclo cellulare

Meccanismo che permette la corretta proliferazione delle cellule. È un programma genetico che sopraintende la corretta divisione delle cellule. Molte malattie genetiche e la cancerogenesi sono legati a difetti nei controlli del ciclo cellulare. Alcune cellule embrionali hanno un ciclo molto semplice: duplicazione del DNA e mitosi con segregazione dei cromatidi fratelli nelle due cellule figlie. La maggior parte delle cellule presenta un ciclo più complesso che implica anche delle fasi di gap G1 che precede la replicazione del DNA e G2 che si trova tra la replicazione del DNA e la mitosi.

Una cellula inizia ad accrescere il suo contributo cellulare e ad un certo punto inizia a replicare il suo DNA, che è seguita da una fase di gap e di accrescimento a cui segue il programma mitotico, si assiste alla condensazione dei cromatidi fratelli, disposizione nella piastra metafasica, segregazione, anafase e citochinesi. In natura esistono diversi tipi di divisioni cellulari, ad esempio si possono avere alternanze di replicazioni-mitosi durante le prime fasi dello sviluppo embrionale. Le cellule all’interno dell’embrione a loro volta hanno cicli cellulari diversi in tempi diversi in modo da differenziare le varie cellule dell’organismo.

Alcune cellule possono “uscire” dal ciclo cellulare e si bloccano della fase G1 e andando in fase G0, diventando delle cellule quiescenti post-mitotiche, come nel caso dei neuroni. Alcune di queste cellule possono rientrare nel ciclo cellulare, come nel caso di alcune cellule staminali. In altri casi si assiste ad un accrescimento cellulare dando origine a due cellule uguali, in altri casi, nelle cellule embrionali di Xenopus Leavis, si nota che le prime divisioni non portano ad accrescimento cellulare e si ottiene una blastula con 4mila cellule che deriva dalla cellula embrionale fecondata. Bisogna sempre avere una fase S di replicazione del DNA che precede la fase M. nelle cellule umane la fase S è abbastanza lunga, mentre la fase G2 è relativamente corta come la mitosi e la citochinesi. In Xenopus non si hanno le fasi di gap.

La durata del ciclo cellulare di una cellula umana è attorno alle 24h, mentre i primi stadi embrionali di Xenopus presentano ritmi di divisione cellulare molto rapidi. Con Sacaromices Cerevisae non si può parlare di citochinesi, ma di gemmazione, dove non appena termina la replicazione del DNA inizia la mitosi che è seguita dal distacco della gemma dalla madre. Nelle prime fasi embrionali di Drosophila si hanno delle fasi cellulari che non corrispondono a delle citochinesi, ma si ha la formazione di un sincizio e solo successivamente si assiste alla divisione vera e propria.

Per ogni ciclo cellulare vi deve essere:

• Una e una sola duplicazione del DNA
• Seguita da una e una sola mitosi

Esistono però delle eccezioni:

• Meiosi: seguita da due divisioni cellulari che ha come fine la formazione di gameti aploidi. I cromatidi fratelli sono strettamente uniti tra di loro e nella prima divisione meiotica (profase) anche i cromosomi omologhi sono uniti tra di loro tramite il sinaptometa complex che permette lo scambio di informazione genetica tra gli omologhi. Nella prima divisione meiotica, gli omologhi vanno ai poli opposti e si assiste al riarrangiamento genetico e solo nella seconda divisione meiotica si assiste alla separazione dei cromatidi fratelli, con la generazione di 4 cellule che sono diverse tra di loro.
• Endoreduplicazione: cromosomi politenici delle ghiandole salivari di Drosophila dove si hanno continue fasi S non seguite da mitotici.

Nel 2001 è stato dato il premio Nobel ad Hartwell, Hunt e Nurse che hanno fatto scoperte molto importanti sul ciclo cellulare, utilizzando organismi modello S. Cerevisiae e S. pombe: eucarioti unicellulari. Tutte le proteine che sono state identificate coinvolte nella DNA damage response sono state trovate per la prima volta in S. Cerevisiae. S. Cerevisiae può esistere sia nello stato aploide che diploide ed esiste in due dimorfismi: alfa ed a, che possono fondersi tra di loro e andare incontro ad un ciclo cellulare, ma se vi sono condizioni sfavorevoli alla crescita, la cellula diploide entra nel programma meiotico e si divide dando origine a 4 spore aploidi. S. pombe è molto simile a S. Cerevisiae. Si hanno cellule aploidi di sesso diverso P ed M che ciclano molto velocemente. Si assiste ad una citochinesi con la produzione di due cellule figlie di eguale dimensione. La formazione della cellula diploide avviene solo in seguito a problemi nel mezzo di coltura. La cellula diploide va subito incontro a meiosi e sporulazione.

Un altro organismo modello, che ha permesso di identificare le cicline, è Xenopus Leavis. Le uova di Xenopus hanno un processo molto particolare di maturazione per cui si ha un oocita che cresce ed entra nella fase S e inizia ad entrare nella prima divisione meiotica. Si blocca al livello della profase I e può rimanere in questo stadio per diversi mesi, accrescendo solo la propria massa fino a quando non si ha la presenza di uno stimolo proliferativo, come il progesterone, che porta alla maturazione dell’oocita che compie la prima divisione meiotica e allinea tutti i cromosomi nella piastra metafasica e si divide. Si assiste anche alla divisione degli omologhi e l’uovo mantiene tutta la sua massa citoplasmatica con solo la formazione dei polar body che verranno successivamente eliminati. L’oocita matura rimane bloccato nella metafase della seconda fase meiotica fino a quando non avviene la fertilizzazione. Si ha un segnale che fa ripartire la metafase II che porta alla formazione di un secondo polar body e si arriverà alla formazione di un uovo fertilizzato con la perdita dei due polar body. L’uovo fertilizzato va incontro ad una serie di divisioni mitotiche. Le uova di Xenopus leavis hanno permesso di capire che le divisioni del ciclo cellulare sono regolate da un fattore MPF maturation promoting factor. Se si preleva il citoplasma di un oocita matura, dopo che è stato fornito il progesterone e si blocca in M2 e lo si inietta in un oocita immaturo, si induce la maturazione dell’oocita.

Una volta che si ha la fertilizzazione dell’uovo, questo va incontro ad una divisione molto rapida di divisioni mitotiche dove si hanno un susseguirsi di fasi S e M fino a quando non si ha la formazione della blastula e l’inizio della trascrizione dei geni importanti per l’embrione. Allo stadio di blastula segue la formazione dell’embrione.

Nel ciclo cellulare si distinguono degli eventi continui e discontinui che sono estremamente regolati. Gli eventi continui sono la crescita della massa cellulare e la crescita degli organelli all’interno della cellula il cui numero non deve essere strettamente regolato. Al contrario, si hanno dei processi discontinui che sono estremamente regolati come la replicazione del DNA che deve essere replicato una e una sola volta, oltre che la segregazione dei cromosomi e la duplicazione dei centrosomi. La segregazione dei due cromatidi fratelli nelle cellule figlie deve iniziare solo nel momento in cui la replicazione è terminata e si ha una totale replicazione del DNA e tutte le forche replicative si sono congiunte.

S. Cerevisiae ha permesso di studiare questi eventi continui e discontinui e di capire che esiste una stretta correlazione tra eventi continui e discontinui in quanto va incontro a divisione asimmetrica. Quando si ha la fine della mitosi e la separazione dei cromatidi fratelli tra la madre e la figlia, la cellula che deriva dalla gemma è sempre più piccola della madre e presenta una fase G1 più lunga, in modo che raggiunga una certa massa prima di iniziare la sintesi del DNA. Quando si oltrepassa il punto START e solo se vi sono stimoli mitogenici, si supera lo start e si inizia la fase s. Esiste uno stretto controllo delle varie fasi del ciclo cellulare. Se vi sono danni al DNA la divisione non inizia.

Checkpoints del ciclo cellulare

Checkpoints: punti di controllo che possono essere intrinseci ed estrinseci. In ogni cellula, dopo che si sono superati i checkpoint, ha inizio la replicazione del DNA. Anche alla fine della fase S vi è un punto di controllo dove la cellula si accerta che il genoma sia replicato correttamente e solo se è avvenuto tutto secondo la norma si ha inizio della mitosi. A livello della metafase della mitosi, la cellula presenta un altro checkpoint dove la cellula deve controllare che tutti i cromatidi siano perfettamente allineati, collegati ai filamenti del fuso e vi sia la corretta tensione. Il controllo di tutte queste fasi è dato dalla CDK chinasi dipendente dalle cicline. Come monomeri sono inattivi, ma se legati alle cicline, si attivano. Le cicline prendono questo nome perché ciclano durante il ciclo cellulare. Nel ciclo cellulare embrionale si è visto che vi sono due stati MPF attiva che porta all’assemblaggio dello spindle (fuso mitotico) e all’allineamento di tutte le coppie di cromatidi fratelli sulla piastra metafasica. Quando l’attività di MPF diminuisce si ha la segregazione dei cromatidi fratelli, divisione delle cellule e replicazione del DNA. Quando ritorna attivo l’MPF inizia la mitosi e si ha di nuovo l’allineamento dei cromosomi sulla piastra metafasica.

CDK: proteine chinasi. Come monomero non è attivo, ma si attiva solo con il legame con la ciclina, che è presente solo in alcune fasi del ciclo cellulare. Nelle cellule embrionali, durante le prime fasi dello sviluppo di Xenopus, si ha un sistema semplice dove la CDK può essere attiva o non-attiva, si ha un sistema ad “orologio”. Precedentemente la CDK era stata identificata come MPF maturation promoting factor, un fattore presente nell’oocita di Xenopus maturo che induce la maturazione dell’oocita. Nel ciclo cellulare embrionale vi è alternanza di MPF: alta attività induce le cellule ad entrare in mitosi, con l’assemblaggio del fuso mitotico, la condensazione dei cromosomi e il loro allineamento sulla piastra metafasica; quando i livelli di MPF si abbassano si ha la segregazione dei cromosomi e la divisione cellulare.

In tutte le cellule somatiche non si ha un solo tipo di cicline, ma sono diverse e regolano diverse fasi del ciclo cellulare. Nella fase G1 del ciclo cellulare non si ha la presenza di cicline, che vengono sintetizzate in risposta a stimoli ambientali e accrescimento della massa cellulare, verso della fine della fase G1 si ha la produzione delle cicline G1/s che attivano la CDK. La cellula entra nel ciclo, duplica il DNA, inizia la fase S, e nella tarda fase S e inizio G2 vengono sintetizzate le cicline di fase M che contribuiscono a mantenere attiva la CDK e a passare il punto di controllo all’inizio della fase cellulare e cicline e CDK rimangono attive fino alla transizione da metafase ad anafase, dove si assiste all’allineamento dei cromosomi nella piastra metafasica e se tutto avviene in maniera corretta si ha l’inizio della metafase. Nella transizione metafase-anafase si ha la distruzione delle cicline.

In genere si parla di checkpoint intrinseci ed estrinseci:

• Intrinseci: servono a monitorare le diverse fasi del ciclo e non permettono l’inizio di una fase se quella precedente non è finita in maniera corretta. Sono sempre presenti e attivi in assenza di perturbazioni esterne
• Estrinseci: attivati nel momento in cui si ha un evento che perturba la cellula, come il danno al DNA che dà luogo al DNA damage response checkpoint.

Tutti i checkpoints hanno il compito di bloccare il ciclo cellulare nel momento in cui si ha un malfunzionamento della cellula. Le cellule possono anche uscire dal ciclo cellulare e diventare post-mitotici (G0), ma se vuole iniziare a duplicare il suo DNA deve superare il checkpoint di fase 1 o start che dà luogo ad una fase irreversibile contraddistinta dalla replicazione del DNA e dalla successiva mitosi. Il passaggio dello start avviene solamente se la cellula ha una certa massa, se vi sono nutrienti e il mezzo in cui si trova la cellula è un mezzo ricco (vale sia per S. cerevisiae ma anche per le cellule umane), se vi sono fattori di crescita e se il suo DNA non è danneggiato. Un altro punto di controllo del ciclo cellulare è la fase G2/M e la cellula supera questa fase solo se il DNA è stato completamente replicato e non vi sono errori nella sua replicazione e non vi sono danni. Superato questo checkpoint inizia la fase M con la condensazione dei cromosomi, l’allineamento dei cromatidi fratelli sulla piastra metafasica e successivamente inizia il checkpoint di fase M o spindle checkpoint che prevede che i cromatidi fratelli siano tutti collegati al fuso e sottoposti alla corretta tensione. Solo se la metafase è stata raggiunta in maniera corretta si ha la transizione metafase-anafase con la separazione dei cromatidi fratelli e citochinesi con la formazione delle due cellule figlie. Se i checkpoint non vengono superati correttamente si ha l’arresto del ciclo cellulare. Le cellule tumorali molto spesso presentano dei problemi in questi checkpoint e le proteine implicate sono frequentemente mutate.