Biologia molecolare applicata alla ricerca biomedica

NHEJ

Inizialmente si pensava non esistesse in S. cerevisiae, ma si pensava che fosse l’unico pathway che riparava

il dsb nel ciclo mitotico nelle cellule eucariotiche. Ma ciò non è vero perché il meccanismo di riparo dipende

dalla fase del ciclo cellulare:

- G1 la via preferenziale è NHEJ, che in S. cerevisie è molto breve. In questo caso è difficile trovare

l’omologo per poter riparare secondo ricombinazione omologa e inoltre potrebbe essere pericolosa

e causare traslocazioni e riarrangiamenti.

- In fase S la via preferenziale è la ricombinazione omologa in quanto non porta ad errori ma ripara

fedelmente il danno e non si hanno possibilità di riarrangiamenti. NHEJ non è favorito in questa fase

perché porta ad accumulo di mutazioni e inoltre è sfavorito nei geni altamente trascritti.

Gli esperimenti che hanno portato alla scoperta di NHEJ sono stati condotti con plasmidi linearizzati che non

presentavano omologia di sequenza con lievito e in presenza di RAD52 questi plasmidi venivano riparati e

mantenuti nelle cellule di lievito se invece si usavano dei doppi mutanti di RAD52 e del gene KU (responsabile

del riconoscimento dei tagli a doppia elica del NHEJ) non si avevano trasformanti perché il taglio a doppia

elica non riusciva ad essere riparato. In S. cerevisiae la delezione di KU non da sensibilità alle radiazioni

ionizzanti, ma se combinata alla mutazione RAD52 aggrava la sensibilità dei mutanti indicano che il NEHJ ha

un ruolo importante anche in lievito.

In presenza di dsb, la scelta tra NHEJ e ricombinazione omologa dipende dalla fase del ciclo cellulare: NHEJ

agisce durante la fase G1, mentre nelle fasi S-G2 quando i due cromatidi fratelli sono vicini i dsb vengono

riparati via ricombinazione omologa e il cromatidio fratello intatto viene definito come donor sequence.

Quali sono i fattori che determinano una via o l’altra? Molto importanti sono le CDK. Se la scelta del pathway

non avviene in maniera corretta si hanno dei grossi riarrangiamenti, dove NHEJ può causare traslocazioni

con la formazione di cromosomi dicentrici e riarrangiamenti genomici. Il processamento dei dsb durante la

fase G1 in assenza del cromatidio fratello può portare ad una spinta verso i pathways di riparazione che

portano a delezione nel dsb a seguito di appaiamento di sequenze ripetute indotte da MMEJ, SSA. Il MMEJ

indica l’appaiamento di alcune basi e grosse delezioni.

Nel NHEJ si hanno delle proteine che riconscono il taglio alla doppia elica del DNA e sono il dimero KU70/80

che legano una protein kinasi DNA-PK molto abbondante nel nucleo e lega i dsb. Si hanno delle proteine che

processano il dsb dove si ha sempre un taglio sfalsato e delle basi danneggiate, come la nucleasi Artemis che

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processa il dsb e anche proteine che processano le estremità, polimerasi che possono inserire una o più basi

sulle quali può agire la ligasi accoppiata a XRCC4 in modo che agiscano in maniera sequenziale e ordinata.

Mutazioni nelle proteine coinvolte nel NHEJ trovate in pazienti immunodeficienti: Radiation sensitive severe

combined immunodeficiency (RD-SCID).

Il dimero KU70/80 ha alta affinità per i dsb che legandosi a questi circonda il DNA e richiama le altre proteine

del NHEJ, tra queste la DNA-PK che fosforila una serie di substrati e manda dei segnali per iniziare la

riparazione per NHEJ. La DNA-PK viene attivata dalla nucleasi Artemis. Il NHER elimina i nucleotidi

danneggiati oppure inserisce dei nucleotidi ad opera di pol-lambda e pol-nu. Ai diversi fattori implicati nel

NHEJ si aggiungono dei fattori accessori come PNK, PALF, APTX in modo da processare il dsb ed eliminare

eventuali basi danneggiate o estremità non compatibili con l’azione della ligasi. Quando le estremità sono

processate, agisce il complesso ligasico che è comporto da due fattori XRCC4-XLF e dalla ligasi 4, che è

specifica per il NHEJ, formando un complesso definito come complesso cernunnos in relazione alla sindrome

di cernunnos dove tale complesso risulta mutato. Il complesso cernunoos forma un’impalcatura che

permette alle proteine di processare il DNA e successivamente permette alla ligasi 4 di legarsi ad esso.

Questo meccanismo viene definito come classical NHEJ, dove si ha una riparazione veloce del dsb con

avvicinamento delle due estremità ad opera di KU70/80 e dalla DNA-PK che funziona da ponte tra i due

eterodimeri KU70/80 reclutando e attivando tutto il complesso delle nucleasi e polimerasi che possono

aggiungere nucleotidi anche in assenza di templato. Nella maggior parte dei casi si tratta di un’unione e

riparazione del dsb estremamente error prone. Molti di questi fattori sono stati trovati mutati nella RD-SCID,

dove si ha un’assenza di produzione di anticorpi e immunodeficienza severa. NHEJ può agire in presenza di

tanti tagli alla doppia elica e causare anche traslocazioni portando alla formazione di cromosomi acentrici e

dicentrici. Tutte queste traslocazioni sono tipiche delle cellule tumorali. Nel cromosoma 14 si hanno molti

frammenti genici delle Ig per la formazione della catena pesante è spesso interessato da traslocazioni che

sono tipiche dei linfomi. Il linfoma di Burkitt ha portato alla scoperta dell’oncogene myc e si ha una

traslocazione tra il cromosoma 8 e il cromosoma 14 causando l’overespressione di myc e causando il linfoma.

Questo è dovuto ad un malfunzionamento del NHEJ, dove RAG1 e RAG2 portano alla traslocazione. Nelle

cellule B il cromosoma 14 subisce spesso delle traslocazioni che possono essere molto gravi.

in presenza di dsb le estremità

vengono protette dal dimero

KU70/80 se avviene NHEJ si ha

l’introduzione di danni. Negli

altri pathways si ha il

processamnto dei dsb che

risulta essere utile e auspicabile

durante la fase S e G2 del ciclo

cellulare, ma se questo

processamento avviene

durante la fase G1 del ciclo

cellulare può dare origine ad un

pathway che viene eseguito

dalla MMEJ, dove piccole

ripetizioni a monte o a valle del

dsb vengono appaiate e quindi, similmente al SSA, si hanno grosse delezioni comprese tra le sequenze

ripetute. 63

Il processamento delle estremità deve essere estremamente regolato. Si è visto nelle cellule KU- hanno un

processamento del dsb che è molto rapido e si ha un joining mediato da micro-omologie che si appaiano e

le nucleasi tolgono dell’estremità e si assiste all’appaiamento e la ligasi restaura il DNA. Nel MMEJ si ha

l’azione di RAD1 che taglia l’estremità a singola elica ed è stata identificata perché mediante mutazioni

combinate con RAD52 e KU- aggrava ulteriormente il fenotipo. Si pensava che questo pathway venisse

attuato solo in condizioni estreme, ma si è visto che molte traslocazioni che riguardano tumori ereditari e

spontanei, ma anche malattie ereditarie come la fibrosi cistica, siano dovuti al MMEJ. Si ha una PARP e dei

fattori per il processamento delle estremità come MRN CtIP, polimerasi translesione pol delta e XRCC1 che

serve a ristaurare il DNA. Questo pathway di riparazione è uno degli ultimi in fase di studio in quanto alcune

fasi non sono ancora note.

Nel 95% dei casi di leucemia mieloide cronica si ha una traslocazione 9-22 che porta alla fusione di BCR e ABL

con la formazione di una chinasi iperattiva. Si nota che sia a monte che a valle della traslocazione si hanno

zone altamente ripetute causate probabilmente da MMEJ. Questo stesso meccanismo è stato visto in

retinoblastoma e fibrosi cistica. 64

16/05/18

Ricombinazione omologia: diversi sotto-

pathways

La ricombinazione omologa è il meccanismo di riparazione più fedele e avviene durante le fasi S e G2 del

ciclo cellulare quando è presente il cromatidio fratello che può essere usato come templato. Se questa

avviene durante la fase G1 del ciclo cellulare e non è presente il cromatidio fratello, può essere utilizzata la

sequenza di un altro cromosoma si possono avere dei riarrangiamenti. Questo pathway viene sempre

eseguito durante la meiosi nel crossing-over. Ci sono diversi sotto-pathways. Il primo step è il processamento

dei dsb. Una volta che si ha il dsb processato possono seguire due eventi distinti: o le estremità sono protette

o delle nucleasi iniziano a processare le estremità (reseption) che porta alla formazione di ssd 3’ protruding.

Nel caso in cui le estremità siano protette si segue il NHEJ che rendono le estremità compatibili e si ha l’azione

della DNA ligasi 4 che riunisce le estremità. È un pathway non fedele in quanto porta alla delezione dei

nucleotidi e se avviene in zone codificanti del genoma è disastroso per la cellula. Se le endonucleasi

digerisocno il DNA si ha la formazione delle estremità 3’ protruding e diverse strade vengono seguite. Se si

ha la ricombinazione omologa si ha l’invasione di una sequenza omologa a cui segue una fedele riparazione

del taglio alla doppia elica del DNA. Nel caso in cui non si abbia vicino una sequenza omologa, come nella

fase G1 del ciclo cellulare, si seguono altre vie come il MMEJ e il SSA. Il MMEJ viene anche chiamato

alternative end joining e si hanno delle sequenze ripetute a monte e a valle del dsb che si possono appaiare,

i flap di ssDNA possono essere tagliati e il DNA è processato dalla polimerasi e la ligasi 3 restaura il DNA ad

una situazione di dsDNA. Questa riparazione va a spese dei nucleotidi che si trovano tra queste sequenze

ripetute. Nel SSA si hanno sequenze più lunghe che si appaiano (DNA ribosoma) e il ssDNA si può appaiare e

i flap vengono tagliate dalle nucleasi e la ligasi 1 lega il DNA e porta ad una situazione di DNA intatta. Si hanno

delezioni si sequenze tra le sequenze ripetute.

Nella ricombinazione omologa si hanno diversi sottopathway ma condividono un meccanismo comune dove

il ssDNA viene legato da RAD51 che forma un filamento nucleoproteico che si avvolge attorno al DNA e ha

la capacità di invadere una sequenza omologa. I sottpathways sono 3:

- SDSA

- BIR

- Ricombinazione omologa classica

I primi dati che sono stati raccolti sulla ricombinazione omologa provengono dall’osservazione della meiosi.

All’inizio del ‘900 Morgan aveva notato che in Drosophila avveniva un riassortimento genico e che questo

fosse dovuto ad eventi di rottura dei cromosomi. Nella ricombinazione omologa classica si deve avere il

riconoscimento del dsb mediante specifici elementi, il processamento ad opera di nucleasi che porta alla

formazione di ssDNA 3’ protruding e grazie alla ricombinasi RAD51 si assiste all’invasione della sequenza

omologa che funge da donor (templato) e si ha la sintesi del DNA (5’->3’). Nella ricombinazione classica anche

la seconda estremità viene processata e si ha la formazione delle Holiday junction. Durante la ricombinazione

meiotica si hanno delle nucleasi che risolvono queste strutture