Biologia molecolare

SECONDA SELEZIONE

SELEZIONE TRA QUELLI CHE HANNO IL PLASMIDE RICOMBINANTE E QUELLI

CHE HANNO IL PLASMIDE RICIRCOLARIZZATO

A seguito di TRASFORMAZIONE e SEMINA

ampicillina

Si mette su piastra contenente

 gene per ampicillina integro,

avendo, entrambe le popolazioni, il

o crescere

potranno tutte su terreno con l’antibiotico

PIASTRAMENTO IN REPLICA

 Cilindro a cui viene legato una stoffa di velluto, sulla quale vi sono

o dei ciuffetti di velluto

Lo stantuffo viene poggiato sulla prima piastra tale che alcuni

o batteri presenti in ciascuna colonia, possano aderire sul velluto

Il tessuto di velluto viene poi poggiato su due

o piastre Piastra con AMPICICLINA

  Crescono tutte

Piastra con TETRACICLINA

  Non tutte crescono

 Contenendo la tetraciclina,

coloro che hanno preso il

PLASMIDE RICOMBINANTE,

essendo avvenuta ,

L’INATTIVAZIONE INSERZIONALE

messi in piastre con

non cresceranno

tetraciclina,

Eseguita la replica della piastra, tutte le colonie nella piastra madre, dovranno crescere nella replica

Per poter essere sicuri di quali cellule sono CLONI POSTIVI si mette a confronto con la piastra iniziale ,

Quelli che NON crescono CLONI POSITIVI

→

o Vengono prelevati dalla piastra madre

 Mancano nella piastra con tetraciclina



Quelli che crescono → CLONI NEGATIVI

o DORIANA NITTO 25

PLASMIDE pUC

Vettore a struttura circolare di dimensioni molto più piccole di pBR322

- Si replica molto più velocemente

-

STRUTTURA

GENI MARCATORI DI SELEZIONE

Sito AmpR per la resistenza alla ampicillina

- Sito LacZ (al posto del sito TetR)

-

SITO ORIC

POLI-LINKER poliLinker;

I siti di restrizione sono tutti concentrati nella stessa regione detta

tutti i diversi SITI DI RESTRIZIONE, presenti in una

Tratto in cui si trovano

- sola copia

Tratto di circa 100pb, contenenti diversi siti di restrizione di diversi enzimi

- di restrizioni presenti in unica copia

pUC

I vari plasmidi della famiglia cambiano proprio i siti di restrizione presenti in questa regione

1. TAGLIO PLASMIDE

Linearizzato

→

2. TAGLIO GENOMA

→frammento

3. LIGAZIONE

a. Nella provetta vi sono due popolazioni

i. (con inserto) a

PLASMIDE RICOMBINANTE

seguito di INATTIVAZIONE INSERZIONALE

ii. (plasmide

PLASMIDE RICIRCOLARIZZATO

originario)

4. TRASFORMAZIONE

In cellule di Escherichia Coli Competenti

5. SEMINA IN PIASTRA

Si ottengono colonie

6. SELEZIONE CLONI

La selezione in questo caso viene fatta contemporaneamente

PRIMA SELEZIONE

Selezionare batteri che si sono effettivamente trasformati

(PLASMIDE RICOMBINANTE / PLASMIDE RICORCOLARIZZATO)

gene di resistenza (di selezione) all’ampicillina

Avviene sempre grazie al crescere

Se la piastra contiene ampicillina, potranno nella piastra solo i

o batteri preso il gene per la resistenza

che hanno ossia le colonie

trasformanti non hanno preso nulla non possono crescere

Le cellule che in quanto

o normalmente batteri sensibili all’ampicillina (per poter crescere

necessitano del gene selettivo della resistenza) DORIANA NITTO 26

SECONDA SELEZIONE

Selezionare i PLASMIDI RICOMBINANTI (CLONI POSITIVI) DA

PLASMIDI RICIRCOLARIZZATI (CLONI NEGATIVI)

In questo caso, il gene marcatore che permette di evidenziare i cloni positivi,

LacZ

è beta-galattosidasi

gene che codifica per la che si occupa di

o scindere il Lattosio (disaccaride formato da galattosio e glucosio

legati da un legame 1,4 beta-glicosidico)

Si mette nel terreno di crescita, un che si chiama

GALATTOSIDE X-GAL

essendo analogo, può essere substrato della beta-galattosidasi

o GALATTOSIO INDOLO

contiene e

o incolore nella struttura originale

 liberato

indolo,

Nel momento in cui viene rotto il legame tra galattosio e questo viene e

 diffondendo colora di Blu il terreno

nel terreno,

Alcune di queste colonie, in realtà appariranno blu

COLONIE BLU cloni NEGATIVI

→

o Contengono il

 PLASMIDE RICIRCOLARIZZATO

 con entrambi i geni funzionanti

Colonie BIANCHE cloni POSITIVI

→

o Contengono il

 PLASMIDE RICOMBINANTE

 Con LacZ non funzionante per azione dell’INATTIVAZIONE INSERZIONALE

RENDERE COMPETENTI LE CELLULE BATTERICHE

inglobare il plasmide

Il ceppo ospite è il batterio Escherichia Coli che viene utilizzato, per poter nel processo di

TRASFORMAZIONE, forma COMPETENTE.

in

Questo in quanto, presenta una doppia barriera che impedisce al plasmide di poter attraversarla ed inoltre non ha dei

sistemi attivi ed enzimatici in grado di acquisire materiale genetico dall’esterno.

Per eseguire la trasformazione (inserzione plasmide all’interno del batterio) si devono rendere competenti

Capaci di prendere il DNA

- Operazione che si esegue trattando le cellule di escherichia con una soluzione salina a base di CaCL2 (cloruro

- di calcio) a concentrazione di 0,1 M in ghiaccio a 0°C

Si lascia incubare per circa una mezz’oretta

o Gli ioni calcio (o altri ioni bivalenti) non si sa che funzione abbiano , ma crea dei microcanali attraverso

o cui può passare il DNA DORIANA NITTO 27

SCREENING BANCHE DI E.COLI

LE COLONIE BIANCHE SONO EFFETTIVAMENTE CLONI POSITIVI?

Colonia bianca è la condizione minima, ma non sufficiente per dire che sono cloni positivi.

Affinché si possa effettivamente capire se sono cloni positivi, bisogna andare a verificare la presenza effettiva

- dell’inserto.

Per fare ciò , bisogna estrarlo di nuovo dai batteri

- Possbile andando a far crescere le colonie raggiunta una certa massa si rompono si tira fuori il

→ →

o plasmide si digerisce nuovamente per vedere se vi è il frammento

→

LA MINIPREP SCREENING BANCHE (analisi

Per fare questo si procede con quella che prende il nome di delle colonie bianche) ed in

MINI-PREP

particolare si parla di

È l’insieme delle operazioni che permette di estrarre il DNA Plasmidico

- Si chiama Mini in quanto si preleva estremamente poco

- Processo preliminare a cui, se ha successo, segue la MAXI PREP.

- In particolare, consiste in:

- Con uno stecchino si va a pizzicare la colonia e la si immerge in un tubo di crescita contenente terreno

o coltura liquido ampicillina

di con

37

Si lascia crescere a °C per una notte (10 - 12 h)

o Una volta estratto il plasmide questo verrà tagliato con enzimi di restrizione ed i frammenti che ne escono

o elettroforesi su gel di Agarosio

vanno in contro ad analisi per DORIANA NITTO 28

TECNICHE DI CLONAGGIO CON ALTRI TIPI DI VETTORI

Quanto può essere grande il frammento rispetto al Vettore Plasmidico? Si può clonare un frammento più grande

del vettore stesso? Si. In quanto può essere grande il frammento del vettore? Vi è un limite.

limite TRASFORMAZIONE

Tale nella grandezza, principalmente è dato dallo step successivo alla LIGAZIONE ossia la

plasmide è piccolo,

Fino a quando il il plasmide riesce ad entrare tranquillamente

 15-20.000 pb

Fino a si ha successo nel clonaggio

o

COSTRUTTO dimensioni importanti, non

Se il (il risultato di un clonaggio) ha riesce a passare nella cellula per

 semplice trasformazione

Si ricorre all’utilizzo di altri sistemi di clonaggio

o 

IL VETTORE GENOMA FAGO

Hanno usato come vettore costituito dal genoma del fago (batteriofago) lambda.

Genoma a struttura LINEARE estremità sfalzate a doppio filamento

Fago caratterizzato dal possedere un con delle

- 45kpb.

grande circa

PER IL VETTORE PER I FRAMMENTI DA CLONARE

Si prende il DNA genomico umano e si taglia con un altro

Sfruttarono l’enzima BAM H1 SauIIIA

enzima

Taglia il genoma in 3 frammenti in corrispondenza di

- Non si usa lo stesso enzima in quanto BamH1 è un enzima che taglia a media

due siti di restrizione frequenza

Due frammenti che costituiscono le

o Taglia ad alta frequenza, siti da 4 pb → taglia con

-

estremità del genoma, definiti BRACCI molta più frequenza e la probabilità di trova dei suoi

Braccio destro

 siti di restrizione è di conseguenza molto più alta

Braccio sinistro



Porzione centrale

o È stata staccata

 Le estremità generate da Sau3A e da BamH1 sono entrambe

sfalzate, nonostante siano enzimi diversi, le estremità sporgenti

Staccata la porzione centrale ed isolati i due bracci sono compatibili ossia appiccicose tra di loro

Se 2 enzimi seppur diversi generano estremità

-

Il TAGLIO può essere compatibili, allora si può fare

PORTATO A TERMINE (CONCLUSIONE)

- nel momento tutti i siti vengono tagliati

o L’enzima, relativamente ad un punto del genoma , genera

- DIGESTIONE PARZIALE parziali sovrapposti.

dei frammenti che sono e

di tutti i possibili siti dove l’enzima potrebbe

o tagliare, non effettua il taglio Di tutta la popolazione di frammenti ottenuta, caricati su gel di

in alcuni siti taglia ed in altri no

o agarosio , distribuiti sulla base del peso molecolare, grazie ad

si può fare

o selezionare solo

un marker si va a quelli che sono i frammenti

con poco enzima rispetto a quello

 più grandi da 15 pb.

necessario Questa regione del gel viene tagliata, e si prosegue

-

abbastanza enzima ma si concede

 con solo i frammenti di 15 pb, tutti gli altri vengono

poco tempo (non quello necessario scartati.

per tagliare in tutti i siti)

UNA REAZIONE DI

Si esegue successivamente

 LIGAZIONE con il frammento (15 kpb) e braccio dx

e sx. Si ottiene:

Braccio sinistro

- (in verde) si lega con la sua

estremità generata da Bam , con un

frammento la cui estremità è generata da

Sau3A

braccio destro braccio sinistro,

- Il si lega con il

in quanto le estremità del fago sono sfalzate e

complementari una all’altra

Situazione che si ripete, ottenendo una lunga molecola

che si chiama CONCATENAMERO DORIANA NITTO 29

ALL’IMPACCHETTAMENTO IN

Si passa

 VITRO

TECNICA DI IMPACCHETTAMENTO IN VITRO 

incubare CONCATENAMERO proteine appartenenti al FAGO

Consiste nell’ il ottenuto, con una preparazione di

impacchettare una parte del genoma, nel fago

L’obiettivo è quello di

- ricostruire il fago in vitro, insieme DNA e proteine

L’obiettivo è quello di (la particella fagica) mettendo (ottenute da

estrazione e purificazione delle proteine del capside)

particelle fagiche ricombinanti

Si riescono ad ottenere delle in quanto una delle proteine che compongono la testa del

ENDONUCLEASI

fago lambda ha at