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Ipotesi modulare degli attivatori della trascrizione
Gognuno di 17bp, disposti a 275 bp a monte dal sito d’inizio della trascrizione del gene Gal1. Nel momento in cui è presente il galattosio, cioè l’induttore, l’attivatore cambia conformazione e diventa capace di legare la sequenza specifica e in questa circostanza la trascrizione del gene GAL1 aumenta di circa 1000 volte.
In generale gli attivatori hanno dominio di attivazione e dominio di legame al DNA separati, ovviamente senza il dominio di attivazione qualunque attivatore non è in grado di attivare il gene anche se si lega al DNA. La modularità degli attivatori è stata dimostrata con degli esperimenti di “domain-swapping” i quali hanno permesso di poter sfruttare la struttura degli attivatori (con i loro domini di attivazione e di legame al DNA) per capire se proteine sconosciute interagivano fra di loro (veramente questo è l’obbiettivo del saggio del doppio).
La tecnica del doppio ibrido saggia la capacità di interagire di due proteine ibride, di cui una ha un dominio di legame al DNA e l'altra ha un dominio che attiva la trascrizione. Questo esperimento (domain swapping) dimostra che il dominio che lega il DNA e quello attivatore sono indipendenti e connessi in modo da permettere al dominio attivatore di interagire con l'apparato basale indipendentemente dall'orientamento e dalla posizione esatta del dominio che lega il DNA. L'attacco al DNA è necessario per attivare la trascrizione, ma l'attivazione dipende dal particolare dominio che lega il DNA?
Dal gene VIII: "L'attivatore GAL4 ha un dominio che lega il DNA che riconosce una UAS e un dominio attivatore che stimola l'inizio a partire dal promotore bersaglio. Il repressore batterico LexA ha un dominio N-terminale che lega il DNA che riconosce un operatore specifico. Quando LexA si lega a questo operatore, reprime il promotore adiacente."
In un esperimento di "scambio", il dominio che lega il DNA di LexA può essere sostituito al dominio che lega il DNA di GAL4. Il gene ibrido può quindi essere introdotto nel lievito insieme ad un gene bersaglio che contiene la UAS o un operatore LexA. Una proteina GAL4 autentica può attivare un gene bersaglio soltanto se ha una UAS. Il repressore LexA è naturalmente privo della capacità di attivare entrambi i bersagli. L'ibrido LexA-GAL4 non è più capace di attivare un gene con una UAS, ma può adesso attivare un gene che ha un operatore LexA! Questo risultato si adatta all'ipotesi modulare degli attivatori della trascrizione. Il dominio che lega il DNA serve a portare la proteina nella giusta posizione e il modo e il punto preciso di legame sono irrilevanti, ma, una volta portato sul posto, il dominio attivatore può svolgere il suo ruolo. Secondo questo modello, non importa se il dominio che attiva lafunzionaredirettamente quando consiste di un dominio chelega il DNA unito a un dominio che attiva latrascrizione. L'attivatore interagisce tramite laformazione di contatti proteina-proteina con ifattori generali della trascrizione, come TFIID,ma può anche interagire con TFIIB o TFIIA. Ilfattore di trascrizione basale TFIID è il bersagliopiù comune degli attivatori, che possonoprendere contatto con una delle sue varie subunità TAF; ciò spiega perché TBP dasola può supportare un livello basale di trascrizione, ma TAF sono necessari per ilivelli più alti stimolati dagli attivatori. Inoltre, TAF diversi di TFIID possonointeragire con attivatori diversi. Alcuni attivatori interagiscono con singoli TAF,mentre altri interagiscono con più TAF.
- Indirettamente: l'attivatore non ha esso stesso un dominio per l'attivazionetrascrizionale, ma lega un'altra proteina (un coattivatore) che possiede il dominio
cheattiva la trascrizione. I coattivatori costituiscono dunque un mezzo di connessione fra gli attivatori e l'apparato basale. Essi funzionano mediante interazioni proteina:proteina, formando ponti fra gli attivatori e l'apparato basale della trascrizione. Il coattivatore non ha un dominio di legame al DNA, ha un dominio di interazione proteina:proteina attraverso il quale riconosce l'attivatore. Inoltre, presenta un dominio di attivazione.
Benché i componenti proteici siano organizzati in modo diverso, il meccanismo è lo stesso. Un attivatore che prende direttamente contatto con l'apparato basale possiede un dominio di attivazione unito covalentemente al dominio per il legame col DNA. Quando invece un attivatore funziona tramite un coattivatore, le connessioni consistono in legami non covalenti fra subunità proteiche. Le stesse interazioni sono responsabili dell'attivazione, indipendentemente dal fatto che i diversi domini siano presenti nella
stessa subunità proteica o in più subunità. IN CHE MODO UN ATTIVATORE STIMOLA LA TRASCRIZIONE? Si distinguono due tipi generali di modelli:
- Nel modello del reclutamento, l'unico effetto di un attivatore sarebbe quello di stimolare il legame della RNA polimerasi sul promotore.
- Secondo un modello alternativo, l'attivatore induce un qualche cambiamento nel complesso di trascrizione, per esempio nella conformazione dell'enzima, tale da accrescerne l'efficienza.
Attivatori e coattivatori stabiliscono contatti non covalenti con un elemento del mediatore oppure con un fattore basale (TFIIB, TFIID o TFIIA). Sommando tutti i componenti necessari per una trascrizione efficiente - fattori basali, RNA polimerasi, attivatori e coattivatori - si ottiene un apparato molto grande. È possibile che questo apparato si assembli in passaggi successivi sul promotore. Alcuni attivatori, coattivatori e fattori basali possono farlo, ed in tal caso possono
essere raggiunti da un complessomolto grande che consiste di RNAPpreassemblata con ulteriori attivatori ecoattivatori. Sono state trovate diverse forme diRNA polimerasi in cui l'enzima è associato a vari fattori di trascrizione. Il "complessooloenzima" più prominente nel lievito consiste della RNA polimerasi associata almediatore. Riguardo il mediatore, avevamo detto che la sua composizione è variabilenon solo da cellula a cellula ma anche da momento a momento della vita della cellulastessa. Molto studiati sono stati i mediatori del lievito, perché il numero di geni èestremamente più basso, dunque è stato più facile caratterizzarli. Sempre nel lievito, ilcomplesso dell'oloenzima è per lo più costituito da un mediatore che generalmentecontiene 20 subunità oltre ad alcuni fattori basali della trascrizione.
mediatore- fattori basali della trascrizione
In accordo con un’ipotesi corrente, la maggior parte del complesso trascrizionale arriva sul gene sotto forma di oloenzima, che contiene il mediatore, la RNA polimerasi ed alcuni dei fattori generali della trascrizione. Soltanto pochi altri complessi arrivano separatamente: fra questi TFIID e TFIIE. Questi ultimi componenti possono essere reclutati da attivatori o legarsi cooperativamente all’oloenzima. Si ricordi che, nel momento in cui si dice che l’attivatore regola il complesso trascrizionale, ovviamente si sottintende il complesso dell’oloenzima.
L’attivatore può contattare direttamente il mediatore o reclutare direttamente la RNA polimerasi, oppure, mediante l’interazione con TFIID (con l’apparato basale), può posizionare l’intero complesso. Si presume che l’interazione con TAF contribuisca al legame di TFIID con la TATA box, o che faciliti il legame di altri attivatori.
sito di risposta provoca una serie di eventi che portano all'attivazione della trascrizione. Questi eventi includono la formazione di complessi proteici che interagiscono con il complesso di trascrizione, la modifica della struttura del DNA e l'arrivo della polimerasi RNA. Gli attivatori possono agire in modo sinergico, cioè possono interagire tra loro per aumentare ulteriormente l'attività trascrizionale. Possono anche agire in modo antagonista, cioè possono competere tra loro per legarsi al DNA e influenzare l'attività trascrizionale in modo opposto. Inoltre, gli attivatori possono essere regolati da segnali cellulari, come ad esempio l'attivazione di vie di segnalazione intracellulari. Questi segnali possono influenzare l'attività degli attivatori, modificando la loro conformazione o la loro capacità di legarsi al DNA. In conclusione, gli attivatori sono proteine che riconoscono specifiche sequenze di DNA e regolano l'attività trascrizionale. La loro interazione con il complesso di trascrizione e con altri fattori di regolazione determina l'attivazione o la repressione della trascrizione dei geni.
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