Biologia molecolare applicata

Biologia molecolare applicata (A.A. 2019-2020)

Biologia molecolare applicata

Prof. G. Raugei

Libri di testo

• Watson, Biologia molecolare del gene (Feltrinelli) parte-5-metodi
• Dale, Von Schantz: Dai geni ai genomi (Edises)

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Esperimento di clonaggio

Il plasmide è l'elemento genetico aggiuntivo presente in molti batteri. È importante che ci sia sempre ORIc di 200-250 basi, l'origine di replicazione, e spesso ci sono anche resistenze agli antibiotici. Il plasmide lavorato è un vettore genetico. Si trovano anche geni per la produzione di tossine e per la coniugazione. Le resistenze sono fondamentali per tracciare quel batterio, per cui in un terreno con un antibiotico, solo quelli senza resistono, quelli con verranno eliminati.

L'inserimento si fa con l'uso degli enzimi di restrizione, enzimi che hanno sequenze specifiche di riconoscimento e per qualsiasi DNA di cui abbiamo una sequenza si può prevedere da quali enzimi di restrizione quel DNA può essere tagliato. Per cui, se taglio il DNA con ECOr1, posso poi inserire nel sito di taglio un DNA omologo ricavato con l'uso dello stesso enzima di restrizione.

Ampicillina Spesso la resistenza all'antibiotico è quella che taglia la regione della proteina di secrezione. Se ho DNA da inserire nel plasmide, posso tagliare il plasmide con l'enzima di restrizione, taglio il DNA che voglio inserire e tagliato con lo stesso enzima e poi con la ligasi posso inserire il plasmide ricombinante nelle cellule batteriche che ho precedentemente piastrato su terreno con ampicillina. Quelle poche cellule batteriche che lo accolgono (per trasformazione) saranno le uniche che formeranno colonie, per cui le individuo facilmente.

Ottenuto il batterio, posso crescere il batterio in liquido e posso estrarre il plasmide ricombinante in grandi copie. Posso fare questo perché il DNA è sempre lo stesso per tutte le specie; l'unica caratteristica del DNA che ho inserito è la sua caratteristica. Posso inserirlo anche perché il plasmide è molto elastico. Cori e lievito sono entità piuttosto elastiche. Un plasmide è qualche migliaio di basi, per cui in un plasmide di 3-4 kbasi, un DNA eterologo può essere 2-3 kbasi, ma anche il contrario. Per cui il plasmide fino a un certo limite è ancora il plasmide che sa duplicarsi, quindi vivere fondamentalmente.

In vivo e in vitro

C'è un'alternanza tra in vivo e in vitro; in questo contesto in vivo significa che sto lavorando su un DNA in provetta, per cui c'è il DNA purificato in sospeso in un tampone e serve per lavorarci sopra. Dopodiché ottengo in vitro tanti plasmidi purificati e ci lavoro enzimaticamente, taglio, aggiungo il DNA eterologo, leggo con ligasi e a questo punto ho il plasmide integro con il frammento in più. Adesso ho di nuovo bisogno del batterio, in vivo, e per trasformazione, tecnica semplice di inserimento del plasmide in un batterio vuoto senza plasmidi, il batterio riceve il plasmide e lo duplicherà in DNA, aumenterà la popolazione batterica e dopo poche ore avrò centinaia di milioni di cellule contenenti questi plasmidi. Infine, posso fare crescita anche su agarosio, per cui questo mi consente da una parte in vitro per fare le analisi e dall'altra in vivo per conservare la crescita in liquido. Per cui in vivo significa che diamo il plasmide al batterio per farne tante copie, in vitro invece per analizzare il plasmide.

Dettagli sull'esperimento di clonaggio

Guardiamo nel dettaglio. Se devo fare un esperimento di clonaggio di un vettore ho una colonia che contiene, senza contenere il DNA cromosomico. Prendo la colonia, inoculo in liquido, in vivo, circa un litro, e dopo delle ore metto in atto il metodo di purificazione. Recupero il batterio, lo liso e poi posso separare tutto il resto che non è DNA plasmidico. Adesso passo in vitro, ho il vettore vuoto e lo taglio con l'enzima di restrizione Ps-gamma-1. È importante usarne uno che taglia solo una volta il plasmide, per far sì che possa richiudersi facilmente con il DNA eterologo, perché altrimenti sarebbe troppo complicato ricongiungere tutti i frammenti se l'enzima di restrizione mi taglia il plasmide in tanti punti. Devo far attenzione che il taglio enzimatico può avvenire ovunque, ma non in ORIc e non nella resistenza all'ampicillina. Questo perché o il plasmide non crescerebbe più, inoltre perché sennò perdo il marker con l'antibiotico. Aggiungo adesso il frammento eterologo con abbondanza eccesso clonale di 1:3, assicurando che buona parte delle molecole ricombinanti saranno davvero quelle che ci interessano, del plasmide che si richiude con il frammento eterologo. Succede anche che il plasmide si richiuderà su se stesso. 3:1 ottimizza quindi questo fenomeno, ma non significa che succede solo questo, anche se poi posso selezionare con l'ampicillina. Bisogna avere in mente che sicuramente ne succede un'altra, cioè che il frammento eterologo ciclizza, ma non mi interessa più di tanto perché è DNA che non ha speranza nel batterio perché non avendo origine di replicazione non avrà sopravvivenza nelle colonie.

Trasformazione e cellule competenti

Per cui adesso trasformazione significa quel processo per cui maltrattando i batteri, cioè fare dei danni nella parete e membrana batteriche, in modo reversibile ovviamente, ottengo dei passaggi per cui il plasmide entra da solo nel batterio, che ovviamente deve essere vuoto. È la trasformazione, quindi produzione di cellule competenti. Se non usassi la trasformazione sarebbe impossibile inserire il plasmide, le cellule sono impermeabili a DNA esogeno. Il maltrattamento avviene con una soluzione di calcio-cloruro a temperatura di 0°C. Per cui le cellule diventano competenti, in modo tale che in qualcuna di queste cellule entri il plasmide. Faccio poi lo shock termico per cui da 0°C vado a 42°C, per far entrare il DNA. 1•10^-6 è la frequenza di ingresso. Però non mi interessa questa bassa frequenza. Se metto che faccio questo trattamento su 10 milioni di batteri e so che solo una volta ogni milione di volte entra il plasmide, avrò 10 cellule con il DNA. Uso una spatola per spalmare i batteri su una piastra contenente l'antibiotico. So che sono circa 10 milioni di cellule e di questi batteri quasi tutti non crescono (se uso ampicillina, che di per sé non ammazza il batterio), ma quelle poche cellule che possono proliferare, perché protette da plasmide con resistenza, invece vedrò la crescita. A questo punto abbiamo capito come ottenere le colonie con i plasmidi.

Metodi per isolare plasmidi ricombinanti

C'è da capire le due modalità, una storica più vecchia e una moderna per isolare quei plasmidi ricombinanti dai plasmidi a vettore chiuso che non sono utili.

Metodo vecchio

Il plasmide usato è pBR322, con OriC, resistenza all'ampicillina e anche resistenza alla tetraciclina. Ho una mappa di restrizione in cui identifico che taglia solo una volta e più o meno in posizione 1 del plasmide. È un vettore adatto che viene usato per selezionare le cellule per far avvenire ricombinazione. L'inserimento di un frammento eterologo usando l'enzima di restrizione taglierebbe in quelle zone vietate, per la resistenza all'antibiotico. Se usassi EcoR1 mi annullerebbe la resistenza all'ampicillina, però allo stesso tempo poco mi interessa, perché ho la resistenza anche per un secondo antibiotico. Quindi faccio la trasformazione e avrò ovviamente plasmidi ricombinanti (per sa resistenza all'ampicillina) e quelli con il ricombinante chiuso, anche loro con la resistenza. Per cui faccio crescere la colonia e faccio il blotting, ovvero trasferire materiale su un foglio di carta di nitrocellulosa sulla quale posso appoggiare materiale della piastra. Questa carta la stampo su una nuova piastra che contiene ampicillina, quindi faccio copia e incolla su un'altra piastra. Le colonie che crescono sulla nuova piastra ovviamente saranno resistenti all'ampicillina e alla tetraciclina. Per cui avrò una piastra master su cui ci sono tutte, una in cui invece crescono solo quelle con la resistenza alla tetraciclina. Per cui nella seconda piastra, contenente l'ampicillina, i plasmidi ricombinati con pst1 non crescono, ma mi interessano proprio loro. Il blotting mi permette di distinguere quelle colonie con e senza il DNA eterologo. Per cui adesso torno sulla master e so quali sono le colonie utili.

Metodo nuovo

Il vantaggio è che se quello vecchio necessitava molte ore, questo è molto rapido. Sfrutto la selezione bianco-blu. Dall'operone Lac prendo la beta-galattosidasi (codificata da LacZ), uno dei tre enzimi codificati. C'è quindi la resistenza all'ampicillina, c'è l'origine di replicazione e la zona in cui inserisco il DNA eterologo. È stato anche ingegnerizzato il plasmide per avere una zona poli-linker ovvero una zona in cui ci sono tanti siti di restrizione per cui posso usare tanti enzimi di restrizione diversi senza danneggiare i siti importanti del plasmide. Ho circa 6 enzimi che posso usare. E questo poli-linker è a monte di LacZ, che codifica la beta-galattosidasi con il suo promotore. È quindi tra il promotore e il gene strutturale di LacZ. Se inserisco il frammento eterologo quindi lo inserisco qui, per cui se ho successo succede che la beta-galattosidasi viene distrutta e il plasmide in cui avviene la ricombinazione, non continuerà a produrre la beta-galattosidasi e la riconosco perché farò trasformazione usando la selezione di ampicillina. Per cui sulla piastra ci saranno sia batteri con plasmide richiuso, sia con il DNA eterologo nel sito della LacZ che non produce più la beta-galattosidasi. Adesso quindi inserisco nel terreno un analogo del lattosio, X-gal, substrato della beta-galattosidasi che se lo taglia diventa blu. Le colonie blu sono quelle con il vettore richiuso su se stesso, che quindi non hanno il DNA eterologo, mentre quelle bianche sono quelle che hanno il ricombinante perché essendo l'eterologo nel gene LacZ non produce la beta-galattosidasi.

Vettori di espressione

La cosa che ci interessa è essenzialmente di sfruttare il messaggio nel frammento eterologo, ovvero il messaggio di essere una sequenza codificante per una proteina per costringere il batterio a produrre una particolare proteina che voglio. Necessito di un vettore di espressione, leggermente diverso da quello visto finora. Devo infatti mettere in condizione che l'eterologo sia trascritto. Per cui serve un promotore e un terminatore. Se metto un promotore e un terminatore a cavallo di un gene, il batterio lo trascriverà e poi lo tradurrà. Per cui per trascrivere l'open reading frame, non solo clono l'eterologo, ma lo arricchisco anche di un promotore (meglio se forte) a monte e un terminatore a valle. Il plasmide ricombinante quindi adesso nel batterio non solo viene replicato dalle cellule, ma verrà anche trascritto in mRNA e se ha significato di sequenza codificante per proteina il batterio sarà costretto a tradurlo. Ancora, posso farlo perché il codice genetico è universale. Dal batterio quindi non solo posso recuperare il plasmide ricombinante ma anche la proteina prodotta.

Processo di traduzione nei batteri

Nei batteri il mRNA viene riconosciuto dal ribosoma grazie alla sequenza Shine-Dalgarno (alta specificità di legame, basta cambiare una delle basi per annullare l'affinità), detta ribosomal binding site, perfettamente complementare al RNA della subunità minore del ribosoma al 16S, formando legami a H ancorando quindi il mRNA al ribosoma e dando l'inizio alla traduzione. I vettori di espressione sono quindi molto semplici, c'è il promotore, forte (spesso del fago-lambda, spesso quindi di origine virale), il ribosomal binding site e il terminatore. Quindi taglio tra il RBS e il terminatore e ci metto il mio ORF. Essendo un ORF inizierà con un codone ATG (anticodone AUG) e terminerà con il terminatore. Quindi l'RNA che ne deriva sarà un messaggero, perché ha la RBS e ovviamente perché ha un ORF (sequenza con codone di inizio e di stop). Per cui questo mRNA non potrà essere ignorato dai ribosomi del batterio e si otterrà nel batterio stesso questa proteina derivante dalla traduzione dell'mRNA. Se è selezione bianco-blu, il vettore ricombinante, quindi con l'eterologo avrà in sequenza: RBS, ORF (AUG, stop), LacZ (AUG, stop). Per cui LacZ è un secondo ORF, ma non si traduce perché ho sfruttato il RBS, originariamente di LacZ per associarlo con ORF, per cui solo ORF si traduce e non LacZ, e non producendo quindi la beta-galattosidasi.

Produzione di proteine batteriche

Mettiamo che vogliamo produrre una proteina batterica, delle proteasi che per esempio non hanno dipendenza stretta da temperatura e che vengono usate nella pulizia degli strumenti chirurgici da residui di sangue e tessuti. C'è due modi per ottenerla, faccio crescere il batterio e con tecniche biochimiche si purifica la proteasi, ma costerebbe troppo, per la poca presenza di prodotto finale soprattutto. Per questo il tentativo di purificare la proteina dal batterio ha scarso successo. Posso risolvere usando quell'ORF clonandolo in un vettore di espressione, assicurandomi che sia sotto un promotore forte. Per cui se prendo l'ORF da quel batterio e lo inserisco in un vettore di espressione, faccio sì che venga prodotto in grandissime quantità in coli. In questo modo è un processo più redditizio e meno costoso economicamente. Quindi voglio prendere quel gene della proteasi dallo Staphylococcus. Ci sarà il promotore, ORF e il terminatore. Prendo la ORF dal batterio con PCR e lo inserisco nel contesto detto prima, ricostruisco quindi un gene con un promotore forte (posso perché lo scelgo io). Dalla mia coltura di Coli produco grandi quantità di questo enzima.

Espressione inducibile

Uno dei difetti di questo metodo è che il promotore è forte. Un promotore forte produce tante sequenze di mRNA che poi il batterio tradurrà. È un effetto così forte che se non faccio altro, ci sarà un'iper espressione di quella proteina, tanto che il batterio si impegna così tanto a produrre questa proteina che però non prolifera più e per un batterio è molto grave. Allora si fa quella che viene chiamata espressione inducibile, ovvero così che l'espressione del gene non è attiva finché non decido io. Sempre nell'operone Lac c'è l'operatore, sequenza adiacente al promotore che può venir legata dal repressore, che nel caso dell'operone Lac è sempre presente inibendo la trascrizione dell'operone a meno che non ci sia l'allolattosio, alias lattosio. Quindi arricchisco il promotore di un operatore per il lattosio. Quindi verrà riconosciuto dal repressore presente nelle cellule normalmente. Il batterio quindi non esprime quel gene, fin tanto che non aggiungo io il lattosio. In realtà non lattosio, ma un analogo del lattosio, IPTG, capace di riconoscere il repressore con lo stesso effetto allosterico dell'allolattosio, ma non aggredibile dall'enzima che produce. In definitiva se non facessi niente il batterio non prolifererebbe più dopo un po', quindi aggiungo l'induttore e il batterio inizia di nuovo a proliferare.

Gel di elettroforesi

Per vedere quanto siano efficienti questi meccanismi, uso un gel di elettroforesi e si ha passaggio di temperature da 25°C a 42°C perché uso un repressore a comando di temperatura in questo caso. Per cui quando passo da 25°C a 42°C vedo che quella proteina è quasi solo quella a essere prodotta, a volte anche così tanto che fa correre male il gel.

Clonaggio di geni batterici in E. Coli

In precedenza abbiamo visto il modo per cui si può clonare un gene batterico, che non ha introni, per cui il DNA è identico al mRNA. Se voglio clonare un gene procariotico in un vettore espressione, di cui mi interessa la proteina, prendo direttamente l'informazione dentro al DNA, ne copio la sequenza codificante dal batterio con PCR, per cui ottengo un amplificato che va a AUG al terminatore inserendolo in un vettore di espressione. Per cui adesso la domanda che mi devo porre è: posso usare la stessa strategia anche in un gene eucariotico? NON POSSO FARLO. È impossibile copiare il gene eucariotico perché negli eucarioti, piante e animali superiori, il numero di introni per gene è sempre maggiore di uno, ma spesso anche intorno alla decina di introni. Sarebbe necessario fare tanti eventi di splicing però il batterio questo non può farlo non avendo il complesso dello spliceosoma. L'unica possibilità nei geni che hanno introni di cui voglio copiare la sequenza codificante, dovrei prendere l'RNA messaggero.

Retrotrascrizione

Sarebbe impossibile prendere un gene messaggero dal DNA che contiene introni oltre a esoni e clonarlo, per cui è necessario retrotrascrivere la sequenza del messaggero da RNA a DNA, che viene detto DNA copia o cDNA. È un procedimento che posso copiare e prendere dalla natura perché i retrovirus fanno proprio questo, ma d'altronde anche i retrotrasposoni. In questo modo prima di tutto purifico l'mRNA. Posso fare la lisi cellulare, purificare la cellula, eliminando l'eccesso e purificando l'RNA totale, ovviamente anche i tRNA e rRNA, ma anche mRNA. Questi hanno anche poliA, la coda di poliA aggiunta dalla poliA polimerasi nel momento di trascrizione. Il trascritto che ottengo ovviamente sarà un insieme di RNA messaggeri, che saranno sicuramente diversi tra di loro ma che hanno in comune tutti la presenza della coda di poli-A. Si avrà una colonnina dove alla matrice ci sono oligo-dT (sono i primer più comunemente usati per la retrotrascrizione, perché come dice il nome sono delle sequenze di qualche desossinucleotide di timina, complementari alla coda poliA) sintetici per cui faccio passare l'RNA e in apposite condizioni le code delle poliA si legano alle code poliT, lavando tutti gli altri RNA, messaggeri e i transfer, che sono i più abbondanti, che non contengono i poliA possono essere rimossi.