Biologia molecolare applicata

VACCINO PER L'EPATITE B

In questi casi il problema si risolve e lo si può spiegare parlando del vaccino per l'epatite B. È un vaccino fatto utilizzando una proteina del capside virale, la proteina più espressa sulla superficie del pericapside. Se utilizzata e purificata come antigene funziona molto bene come vaccino.

Il problema del vaccino dell'epatite B è che l'HBV non è coltivabile come virus, per cui ci sono voluti anni e l'utilizzo delle tecniche del DNA ricombinante che hanno permesso di identificare il genoma codificante la proteina S, inserirla in un vettore di espressione di E. coli e produrla in batteri. Il processo fu molto facile, però il problema è che la proteina S così prodotta aveva un folding diverso da quello naturale, fornendo una risposta immunitaria però contro degli epitopi diversi da quelli della proteina S nella sua forma nativa sul virus. Nei pazienti infetti di epatite B

possono essere puri cate dal sangue delle particelle HbsAg, ovvero antigeni dell'epatite B e che sono dei corpuscoli fatti di proteina S detti perché rappresentano dei montaggi falliti del virus che escono dalla cellula come aggregato di proteine del capside, tra cui anche la proteina S, ma senza DNA e quindi non infettanti. Questi sono ottimi antigeni. Ma questa struttura è particolarmente importante perché ci fa capire che la proteina S nella sua struttura e conformazione nativa naturale, sono dei monomeri che tendono naturalmente a incollarsi tra loro formando una struttura relativamente rigida del capside. Questo incollamento avviene per l'interazione tra residui amminoacidici idrofobici. Nella proteina prodotta in Coli l'osservazione fu che la proteina era presente come monomero perché tendeva a richiudersi andando a nascondere i residui idrofobici. In questo modo si rende impossibile alla proteina di montarsi in questi Ghost esponendo.

antigenitotalmente diversi da quelli della proteina nativa e ettivamente funzionanti. Il tentativo in Coli si dimostròquindi un totale insuccesso. Visto questo insuccesso vennero quindi adottate ricerche per trovaremetodi più vicini all’espressione di proteine eucariotiche. Per cui dal batterio facendo un notevole salto,lievito,passarono a un eucariota unicellulare, il on un sistema di chaperoni molecolari nettamente daColi. Venne messo a punto un vettore di espressione che per il lievito non è troppo diverso da Coli.Molto lieviti, come S. Cerevisiae, contengono naturalmente deiplasmidi che non sono molto diversi da quelli visti nora. Uno di questivettore shuttle,vettori è il un plasmide che cresce sia in lievito che inColi, grandissimo vantaggio. In gura quindi possiamo vedere l’internovettore, ma nello speci co quella parte che è in rosso è la parte cheha senso in lievito, il nero è quella parte che assume senso anche inColi.

Da una parte, parte rossa è un plasmide che cresce in lievito e che contiene quindi un eterologo che nel lievito non ha senso, che ha OriC e uno o più geni come la resistenza a ampicillina. Questo che non ha senso in lievito, ha però senso in Coli. Sarà un vettore trasformato sia in lievito che in batterio. Questo plasmide avrà una parte, rappresentata come gialla, che reading frame proteina Sè l'open codi cante per la del virus dell'epatite. Questo vettore in questo sito GST, ha a monte un elemento, essendo una proteina di fusione, quel sito che si lega covalentemente al glutatione immobilizzato su una colonna per purificare la proteina di fusione. A valle invece c'è una sequenza che viene chiamata poli linker perché permette di poter inserire varie sequenze. Ci sono inoltre due moduli di taglio, una enterocinasi e una trombina, che ci aiutano a rimuovere il frammento.

proteina di fusione. Inoltre sempre a valle c'è ovvero l'origine di replicazione delLEU-2 lievito. In più c'è anche un altro gene, che serve alla selezione. Questo plasmide se trasformato in Coli cresce in coli e la comodità di un vettore shuttle è proprio questa, perché permette di ottenere una grande quantità di questo vettore con la sua trasformazione in coli. Una volta fatta un0abbondante crescita in liquido e purificato grandi quantità del plasmide, questo può essere di nuovo trasformato, ma adesso in lievito. Una volta che il vettore ha raggiunto il nucleo del lievito, non solo si replicherà, ma diventa vettore di espressione capace di esprimere la proteina inserita nel vettore e rappresentata in giallo nella figura di prima. Adesso vediamo cosa serve leu-2. Serve alla selezione. Si utilizzano infatti lieviti LEU-2 negativi, leucina. Ovvero leu-2 è un gene che serve a dar luogo alla biosintesi di

In lievitiLEU-2 negativi la leucina non viene sintetizzata, per cui in terreno è necessario un implemento di questo aa. Tuttavia se io vado a trasformare lieviti con DNA ottenuto in coli, anche qua la trasformazione di lievito è molto raro, ma anche se è solo 1 su 100.000, solo su questo ci sarà nel vettore quel gene codi cante per leucina, pertanto quella funzione complementa con il genoma di lievito carente di LEU-2. Quindi i lieviti contenenti questo vettore crescono anche in terreni con assenza di leucina. Questa sarà quella selezione che ci permette di riconoscere su una piastra quali colonie di lievito contengono il vettore shuttle in esame. È quel metodo usato quindi per fare il vaccino dell’epatite. Il vaccino viene fatto in lievito e è importante ricordare come dal lievito si ottengono delle proteine sotto forma di quelle particelle ghost. Quindi la proteina S quando viene prodotta in lievito ha quella capacità che non

Procedimento per l'espressione di cDNA in lievito

1. Facciamo una library di cDNA in Coli, per cui retrotrascriviamo il messaggero della proteina in esame e inseriamola per trasformazione in Coli.
2. Isoliamo il clone desiderato, facciamo quindi uno screening con gli oligonucleotidi con sequenza degenerata, ricordiamo che essendo una proteina eucariotica ovviamente avrà la sequenza poli-A che verrà sfruttata proprio per fare lo screening.
3. Una volta isolata la colonia che desideriamo, facciamo crescita in coltura in liquido (grande quantità, ordine dei mg) per poi isolare il plasmide contenente il nostro cDNA.
4. Tagliamo quindi il cDNA dal plasmide di coli per inserirlo nel nostro vettore shuttle che ha una porzione riconosciuta da lievito e una da coli.
5. Quindi...

facciamo trasformazione in Coli e facciamo selezione con ampicillina (perché il vettore shuttle ha il gene di resistenza all'ampicillina) e facciamo di nuovo coltura in liquido con successiva purificazione del vettore shuttle contenente il cDNA. VI. Trasformazione in cellule di lievito e selezione leucina dipendente (grazie a LEU-2). VII. Crescita in liquido, espressione e purificazione. In teoria noi potremmo anche evitare il passaggio in Coli, perché potremmo prendere un plasmide di lievito, lavorarci sopra in vitro, inserirci il cDNA e poi trasformare il tutto in lievito. Nella pratica non lo facciamo perché ci sono due motivi che danno di coltà. Un motivo è che abbiamo detto che in Coli il numero di plasmidi per cellula è un centinaio, in lievito 10 volte di meno, in più i lieviti se facciamo coltura liquida di lievito o coli c'è una differenza a favore di coli di 100 volte in coltura densa. Quindi per

esempio da 1 litro di coltura liquido possiamo ottenere 1mg di coltura di coli, mentre dallo stesso litro di lievito possiamo ottenere 100 volte meno cellule, che corrispondono a 1000 volte meno plasmide perché nelle singole cellule a loro volta c'è 10 volte meno plasmide. Sarebbe estremamente complesso purificare il plasmide da lievito, si preferisce quindi ottenere un plasmide in lievito, lavorarci in vitro e come ultimo passo fare trasformazione in lievito e poi selezione con LEU-2.

2) necessità di modi che post-traduzionali, è il secondo problema, dopo il folding non corretto, delle proteine ricombinanti espresse in Coli. È un caso in realtà questo assolutamente prevedibile, infatti se vogliamo produrre una proteina che sappiamo necessitare di modi che post-traduzionali, sicuramente non possiamo usare Coli. Per esempio, se volessimo fare anticorpi ricombinanti, gli anticorpi hanno la necessità assoluta di non solo avere ossidazione dei

ponti S-S, ma anche di essere glicosilata, due cose impossibili da fare in Coli, ma anche in lievito, perché per esempio, pur essendo un eucariota, la glicosilazione ce l'ha, ma piuttosto diversa. Se abbiamo proteine che devono subire modificazioni post-traduzionali molto probabilmente saranno modificazioni come ossidazioni, glicosilazioni, operate dal RE e Golgi, e anche ovviamente il controllo qualità operato dal RE. L'unica chance che abbiamo è di andare a usare cellule geneticamente molto vicine a cellule animali, tra cui cellule o cellule di mammifero in coltura o, ancora meglio, di cellule di insetto: colture cellulari mammiferi, è uno dei principali metodi che viene oggi usato. Fondamentalmente sono propagazioni di cellule al di fuori dell'organismo. Per le cellule animali si trovano maggiori complicazioni date dal fatto che il terreno di cui hanno bisogno deve essere particolarmente ricco di nutrienti, ossigeno e pH, ma anche fattori di

crescita senza i quali le cellule non potrebbero proliferare. Si trovano però molteplici vantaggi riguardo alle colture cellulari. Questo perché l'ambiente extracellulare può essere manipolato (per esempio si può introdurre nell'ambiente un tipo di genoma per far esprimere una proteina a nostra scelta), si può decidere di usare esclusivamente un tipo di cellule ben definite, si ottengono cellule in grandi quantità e quindi si può avere uno studio di varie funzioni cellulari molto specifico e efficace. Per i tipi di colture cellulari che possiamo trovare sono due:

1. Colture cellulari primarie, che si usano più raramente. Sono degli espianti di tessuto di cellule normali o non (anche di tipo tumorale) che possono essere coltivate in vitro. Le cellule normali in generale, dipende in realtà fortemente dai tessuti, il loro destino è fermarsi nella proliferazione, e poi degenerare e morire. Alcune cellule in realtà ancora più

fi ffi fi fi ffi fi fi fi fidi altre. Sono culture su cui possiamo fare esperimenti e si usano perché è un tipo di