Biologia Molecolare - Apoptosi

rispettive caspasi, chiamate caspasi attivatrici, aventi il ruolo di captare il segnale

apoptotico e di clivare se stesse, autoattivandosi, con un meccanismo chiamato

attivazione per prossimità, e di clivare l'altra classe di procaspasi; quando il prodominio è

piccolo, infatti, ovvero lungo circa 25 aminoacidi, si identifica una seconda classe di

procaspasi, rappresentata dalle procaspasi 3, 6 e 7, che ad opera del clivaggio effettuato

dalle caspasi attivatrici, si evolveranno nelle caspasi 3, 6 e 7, chiamate caspasi esecutrici,

responsabili del clivaggio di molte proteine, quali le proteine del citoscheletro, le

proteine della membrana nucleare, i fattori di inizio della trascrizione e della traduzione,

le proteine coinvolte nella duplicazione, così come le proteine che regolano il ciclo

cellulare; clivano, inoltre, una particolare proteina chiamata ICAD, inibitrice della

DNAasi CAD, una particolare DNAasi che ha la capacità di idrolizzare il DNA ogni 200

nucleotidi circa, agendo a livello del DNA linker; il clivaggio della proteina ICAD, quindi,

consente l'azione della CAD, con conseguente frammentazione del DNA.

La famiglia delle Bcl 2 è completamente coinvolta nel processo apoptotico; i suoi

• componenti possono essere suddivisi in 3 gruppi: le proteine antiapoptotiche, le proteine

proapoptotiche del gruppo Bax, e le proteine proapoptotiche BH3 only. Le proteine

antiapoptotiche posseggono 4 domini di omologia, chiamati domini BH1, BH2, BH3 e

BH4; posseggono inoltre un dominio transmembrana TM, che consente ad esse di poter

aderire alla membrana del mitocondrio; di questo gruppo fanno parte la Bcl 2

propriamente detta, la Bcl XL e la Mcl 1; l'apoptosi può essere bloccata da questa classe di

proteine, soltanto prima dell'attivazione delle caspasi esecutrici. Le proteine

proapoptotiche del gruppo Bax sono rappresentate dalla stessa Bax e dalla Bak; mancano

del dominio BH4, e posseggono anch'esse il dominio TM; tuttavia, tale dominio, in

assenza di stimolo, è nascosto, e quindi esse si trovano disperse nel citosol; in presenza di

uno stimolo, il dominio TM viene esposto ed esse potranno legarsi alla membrana

mitocondriale; le proteine proapoptotiche BH3 only posseggono invece esclusivamente il

dominio BH3; di questo gruppo fanno parte la Bid, la Bim, la Bad, la NOXA e la PUMA;

non posseggono il dominio TM e quindi non possono legarsi alla membrana

mitocondriale. Tutte le proteine della famiglia delle Bcl 2, tramite il loro dominio BH3,

comune a tutte, possono dimerizzare tra loro, omodimerizzando e eterodimerizzando;

in questo modo, anche le proteine proapoptotiche BH3 only possono migrare verso la

membrana mitocondriale, grazia alla capacità di dimerizzare con le proteine già

attecchite alla membrana. Il rapporto di concentrazione fra le proteine antiapoptotiche e

proapoptotiche regolano il processo apoptotico stesso, favorendolo o inibendolo.

L'apoptosi si avvia secondo due modalità diverse chiamate via estrinseca e via intrinseca,

comunque strettamente correlate, che terminano entrambe con l'attivazione delle caspasi

effettrici.

La via estrinseca è mediata da segnali di origine extracellulare. Vengono attivati recettori di

membrana apoptotici, che captano segnali extracellulari di tipo infiammatorio; i recettori in

questione possono essere distinti in 3 classi, tutte presenti sulla membrana plasmatica di ogni

cellula: i recettori FAS, TNFR e DR 4/5. I recettori FAS espongono la loro coda

carbossiterminale verso l'interno della cellula e quella aminoterminale verso l'ambiente esterno;

quest'ultimo prende contatto con le proteine esposte sulla superficie dei linfociti T citotossici,

chiamate antigeni di superficie o più precisamente FAS ligand; tali recettori quindi vengono

attivati durante un'infezione batterica. I recettori TNFR sono recettori transmembrana,

anch'essi con la coda aminoterminale rivolta verso l'esterno della cellula; essi legano il TNFα,

ovvero il fattore di necrosi tumorale, e quindi captano segnali proliferativi neoplastici. I recettori

DR 4/5, infine, sono deputati al riconoscimento di proteine proinfiammatorie quali ad esempio

l'interleuchina 1 sono stimolati anche dall'assenza di segnali proliferativi. Il meccanismo di

α;

attivazione dell'apoptosi è, comunque, comune a tutti i tipi di recettori.

Il recettore FAS, ad esempio, è un recettore a struttura monomerica costituito, come detto

precedentemente, da una coda aminoterminale rivolta verso l'esterno, una coda

carbossiterminale rivolta verso l'interno, ed una catena aminoacidica centrale di circa 70-80

aminoacidi, rappresentata da aminoacidi idrofobici, che prenderanno contatto con la membrana

fosfolipidica; l'estremo carbossiterminale possiede un dominio chiamato dominio della morte o

death domain DD. Quando il recettore FAS prende contatto con i FAS ligand dei linfociti T

citotossici, esso trimerizza; i domini DD di ogni recettore, quindi, prendono contatto tra loro;

viene stimolata una proteina citoplasmatica, chiamata FADD, che tramite la sua coda

aminoterminale lega i domini DD del trimero; la coda carbossiterminale della proteina FADD

costituisce invece il dominio DED o dominio effettore di morte, omologo ad alcune parti del

prodominio delle procaspasi iniziatrici; a questo punto quindi, il dominio DED richiama le

procaspasi 2, 8 o 10, e dimerizza con esse; viene a costituirsi il cosiddetti complesso di morte,

che determina una ulteriore modificazione conformazionale del trimero, che si evolve in un

esamero; grazie a ciò, 2 procaspasi si troveranno vicine fra loro, e tramite il meccanismo di

attivazione per prossimità, si clivano tra loro e costituiscono l'eterotetramero, evolvendosi in

caspasi attiva; a questo punto, la caspasi attiva, nella maggior parte delle cellule, agirà o sulla

procaspasi 3, oppure sulla proteina Bid; l'azione idrolitica sulla caspasi 3 provoca l'attivazione di

quest'ultima, che a sua volta agirà sulle procaspasi 6 e 7, attivando tutte le caspasi effettrici;

l'azione idrolitica sulla Bid, invece, provocherà il clivaggio di questa proteina, che nella sua forma

troncata migrerà verso il mitocondrio, dimerizzando con le proteine adese sulla membrana

mitocondriale. In alcune cellule linfoidi, invece, le caspasi attivatrici agiscono solamente sulla

procaspasi 3, e la via estrinseca è completamente indipendente dal mitocondrio.

La via intrinseca è scaturita da segnali mitocondriali, in particolare è dipendente dal bilancio

energetico. La membrana mitocondriale lega le proteine della famiglia Bcl 2; quando prevalgono

le proteine antiapoptotiche, il mitocondrio è integro e il potenziale di membrana è normale;

quando si ha incremento della trascrizione di proteine proapoptotiche, o quando la Bid viene

troncata, oppure quando le proteine Bad o Bax vengono attivate, sulla membrana mitocondriale

vengono aperti dei pori che vanno a compromettere la permeabilità della membrana, con

conseguente caduta del potenziale di membrana e fuoriuscita del materiale endocellulare, tra cui

il citocromo c, che nel citosol rappresenta una molecola segnale apoptotica; esso infatti lega la

proteina citosolica APAF 1, che reclutando ATP, forma un trimero; a sua volta, 7 trimeri si

strutturano in un eptacomplesso circolare, costituendo l'apoptosoma, che richiamerà verso se la

procaspasi 9, che sempre per meccanismo di attivazione per prossimità, cliverà se stessa,

attivandosi; la caspasi 9 attiva, infine cliverà le procaspasi effettrici 3, 6 e 7.

Alcune proteine sono responsabili dell'inibizione del meccanismo di apoptosi; queste sono la

proteina Sentrina, la proteina FLIPP e la proteina IAP. La proteina Sentrina inibisce la

trimerizzazione del recettore di membrana, agendo quindi prima che il trimero venga a

costituirsi; la presenza di uno stimolo esterno che stimola il recettore può essere arrestato da alti

livelli di Sentrina nel citosol, che si legherà sulla coda carbossiterminale del recettore (dominio

DD) evitando che esso vada in contro a trimerizzazione. La concentrazione della Sentrina è

costante all'interno della cellula, e la diminuzione della concentrazione di molecole segnale,

quali ad esempio le citochine proinfiammatorie e i FAS ligand, fa sì che la concentrazione

endocellulare di Sentrina sia sufficiente a bloccare i recettori, revertendo il processo apoptotico.

La proteina FLIPP, invece, agisce sul trimero venutosi a formare, legandosi all'estremo

carbossiterminale di esso, ed impedendo il reclutamento della FADD. Le proteine IAP agiscono

indiscriminatamente sia sulla via intrinseca che sulla via estrinseca dell'apoptosi, poiché il target è

rappresentato dalla caspasi 3, attivata da entrambe le vie; le IAP legano il sito catalitico della

caspasi 3, impedendole l'attivazione delle caspasi 6 e 7 e quindi bloccando l'azione delle caspasi

effettrici. In quest'ultimo processo interviene un'ulteriore proteina, chiamata proteina DIABLO,

che possiede la capacità di legare le proteine IAP; il legame tra la proteina DIABLO e la IAP evita

l'inibizione delle caspasi 3 da parte della IAP, che risulterà sequestrata ad opera di DIABLO;

quest'ultima si trova solitamente all'interno del mitocondrio, ma quando il segnale apoptotico

è forte, il livello delle Bcl2 proapoptotiche sulla membrana mitocondriale aumenta, vengono a

formarsi i pori sulla membrana e fuoriesce il materiale endocellulare, tra cui anche la proteina

DIABLO, che a questo punto potrà inibire la proteina IAP consentendo l'azione della caspasi 3.

Un altro evento che avviene nel momento in cui si viene a costituire il trimero recettoriale è

l'attivazione di una particolare proteina transmembrana chiamata Scramblase; questa proteina

possiede attività flippasica, ed in particolare trasferisce la fosfatidilserina presente nella membrana

dall'interno all'esterno di essa; la fosfatidilserina, a questo punto, trovandosi all'esterno

comunica alle cellule circostanti lo stato apoptotico della cellula, fa perdere i contatti

intercellulari con le cellule adiacenti ed attiva la capacità fagocitaria di esse.

Un punto di connessione ulteriore tra ciclo cellulare ed apoptosi è mediato dalla proteina p53,

un oncosoppressore; la sua modificazione è strettamente correlata all'insorgenza di alcuni

carcinomi, e infatti la sua forma difettosa è presente nell'80% degli adenocarcinomi ed in tutti i

carcinomi colorettali. E' un fattore di trascrizione che si trova costitutivamente nella cellula, ma

è normalmente legato ad una proteina Mdm 2 che ne causa una rapida ubiquitinazione e quindi

una rapida eliminazione. Tutti quei segnali che inducono morte cellulare determinano

l'attivazione di proteine chinasi specifiche per p53 che, fosforilata, si distacca da Mdm 2, si attiva

e si lega a svariate