Appunti di Biologia molecolare

Appunti di biologia molecolare

Università di Firenze

Indice

• Introduzione Pagina 1
• Organizzazione del genoma Pagina 8
• Replicazione del DNA Pagina 11
• La PCR Pagina 18
• Riparazione dei danni al DNA Pagina 24
• La trascrizione Pagina 34
• Maturazione dell’RNA Pagina 42
• Real-time PCR Pagina 53
• Il codice genetico Pagina 57
• La traduzione Pagina 58
• Le mutazioni Pagina 66
• Il controllo dell’espressione genica Pagina 69
• I lunghi RNA non codificanti Pagina 84
• Il destino delle proteine Pagina 92
• Il traffico vescicolare Pagina 110
• Il trasporto del glucosio Pagina 123
• La trasduzione del segnale Pagina 128
• Adesione cellulare Pagina 148
• Le cellule tumorali Pagina 153
• Apoptosi, necrosi e autofagia Pagina 162
• Animali transgenici Pagina 169

Introduzione

La molecola informazionale di un organismo è il DNA. Il DNA viene trascritto in RNA, che verrà poi tradotto in proteine. Solo il 4% dei geni codifica per proteine, tutto il resto produce molecole di RNA che hanno funzione di regolazione e che regolano svariati processi.

L'unica eccezione al dogma della biologia è rappresentata dai retrovirus che utilizzano la trascrittasi inversa per passare da RNA a DNA. I retrovirus compiono questa tappa per inserirsi all'interno di un genoma a DNA e, visto che il loro genoma è a RNA, devono utilizzare questo enzima per replicarsi.

Acidi nucleici

• Acido desossiribonucleico (DNA)
• Acido ribonucleico (RNA)

Gli acidi nucleici sono formati dall'unione di più monomeri, chiamati nucleotidi, che sono formati da diversi componenti:

• Gruppo fosfato
• Zucchero
• Basi
  • Puriniche (Adenina, Guanina)
  • Pirimidiniche (Citosina, Timina, Uracile)

Il gruppo fosfato è identico sia per il DNA che l’RNA, ciò che cambia è lo zucchero: desossiribosio per il DNA e ribosio per l’RNA. La differenza tra i due zuccheri sta nella presenza, nel ribosio, di un gruppo -OH sul C₂, mentre nel desossiribosio si ha un atomo di idrogeno nello stesso punto.

I componenti sono legati fra di loro nel seguente modo: il gruppo fosfato è legato al C₅, la base è legata al C₁ dello zucchero. Il legame del gruppo fosfato è detto fosfodiesterico ed il legame della base è detto glicosidico.

Uno zucchero più una base formano un nucleoside (non è presente il gruppo fosfato). Un nucleotide può essere mono/di/tri-fosfato a seconda di quanti gruppi fosfati sono legati.

I nucleotidi si legano fra di loro attraverso il legame fosfodiesterico (legame tra -OH in C₃ e gruppo fosfato in C₅, direzione 5’P-3’OH). Per la formazione di questo legame c'è bisogno di un -OH libero in C₃ e la sua formazione porta alla condensazione di una molecola d'acqua.

Il DNA è formato da due catene antiparallele (una va da 3’ a 5’ e l'altra va in direzione 5‘-3’) e complementari (A con T e C con G). Sono tenute insieme dai legami idrogeno delle basi:

• Tre legami a idrogeno fra C e G
• Due legami a idrogeno fra A e T

Il DNA si spiralizza come una doppia elica destrorsa (un passo dell'elica contiene 10 basi), le basi sono all'interno e all'esterno vi è uno scheletro zucchero-fosfato, il gruppo fosfato conferisce al DNA una carica negativa. Nel DNA si distingue un solco minore e un solco maggiore che si formano a causa dell'antiparallelità degli zuccheri. Le proteine che interagiscono con il solco maggiore hanno una forma di Alfa-elica. Queste si legano al solco maggiore poiché questo permette un numero maggiore di legami rispetto al minore. Le proteine riconoscono le possibili conformazioni di legame che possono essere effettuati a livello delle basi. Le proteine sono specifiche in modo che si leghino a basi complementari.

Forme del DNA

Ci sono tre forme di DNA:

• Forma A: più panciuta, destrorsa, favorita in soluzioni a minor acqua (11 bp/giro, piano delle bp piegato di 20° rispetto all’asse dell’elica).
• Forma B: forma rilassata classica, destrorsa, è la più stabile in condizioni fisiologiche (10.5 bp/giro, bp perpendicolari all’asse dell’elica).
• Forma Z: sinistrorsa, forma più allungata (12 bp/giro), favorita da sequenze Py-Pu alternate, con probabile funzione regolativa nell’espressione genica.

Forme di DNA B si possono alternare a forme di DNA Z nella cellula, ma la struttura delle basi fra DNA B e Z è diversa, in particolare le basi si possono trovare in conformazione Anti o Syn:

• Anti: negate dall'altra parte rispetto allo zucchero
• Syn: legata dalla stessa parte rispetto allo zucchero

La rotazione del legame glicosidico è sfavorita nelle pirimidine (C e T) che si trovano solo in conformazione Anti.

Altre forme di organizzazione più rare che si possono ritrovare nel DNA sono:

• DNA H: DNA in forma di tripla elica. Il terzo filamento si inserisce nel solco maggiore della molecola di DNA e sono presenti nei telomeri.
• Quartetti di G: si formano eventi di ricombinazione a livello dei telomeri. Queste sono strutture stabilizzate dalle interazioni di Hoogsteen, ossia attraverso legami a idrogeno non canonici. Per formare interazioni di Hoogsteen la base purinica svolge una rotazione di 180° attorno al legame glicosidico.

Il superavvolgimento del DNA

Affinché il DNA possa stare all’interno del nucleo è necessario che si pieghi, ripieghi, si ammassi e si stratifichi per accorciarsi ispessendosi.

DNA superavvolto negativamente, sottoavvolto: è un DNA sottoavvolto perché ha meno giri d’elica rispetto alla forma B, questa sottospiralizzazione favorisce l’apertura dell’elica. I superavvolgimenti negativi fanno girare il DNA attorno al suo asse in direzione sinistrorsa (antiorario).

DNA superavvolto positivamente, superspiralizzato: fanno girare il DNA attorno al suo asse in direzione destrorsa (orario). È un DNA sovravvolto perché ha più giri d’elica rispetto alla forma B, l’apertura dell’elica è sfavorita.

Topoisomerasi

Le topoisomerasi sono enzimi in grado di rimuovere i super avvolgimenti del DNA:

• Topoisomerasi I: rimuovono dei superavvolgimenti più semplici
• Topoisomerasi II: rimuovono dei superavvolgimenti più complessi

Grazie alla complementarità delle basi, la doppia elica del DNA ha la capacità di separare (denaturare) e poi riunire (rinaturare) i due filamenti rompendo solo i legami a idrogeno e non quelli covalenti. Quando tutti i legami a idrogeno sono rotti si ha la separazione delle due eliche, questa avviene in un intervallo di temperature molto ristrette, circa 100°C.

La rinaturazione del DNA, che dipende dall’appaiamento delle basi complementari, avviene in due tappe:

• Singoli filamenti di DNA si incontrano casualmente
• Se le sequenze sono complementari, le due eliche si appaiano e formano una prima piccola regione a doppio filamento, che poi piano piano si estende

Il DNA, quindi, presenta una caratteristica peculiare, ossia quella di potersi denaturare e rinaturare:

• Denaturazione: rottura dei legami a idrogeno a causa dell'aumento della temperatura. Si ottengono due filamenti singoli
• Rinaturazione: se si ritorna a temperatura ambiente i due filamenti si riuniscono riformando la stessa molecola di prima, è una caratteristica tipica del DNA (anche le proteine si denaturano ma poi non ritornano allo stato nativo, non si rinaturano)

Spettro di assorbimento del DNA

Le proteine assorbono a 280nm, il DNA a 260nm. L'effetto ipercromico è dovuto al fatto che il DNA separato assorbe di più a causa del fatto che le basi sono meno “riparate” rispetto alla forma nativa.

L’RNA (acido ribonucleico) è una molecola a singolo filamento, ma in alcune zone la molecola si ha la possibilità di disporsi a doppio filamento (forcina, stelo, ansa) seguendo la complementarità delle basi.

Organizzazione del genoma

Il DNA deve essere complessato poiché negli eucarioti è molto lungo e deve essere contenuto nel nucleo (circa 2m di DNA devono essere contenuti in un nucleo di circa 10µm di diametro). I gruppi fosfato conferiscono una carica negativa al DNA. A compattare il DNA ci sono delle proteine dette istoni, che sono basiche (cariche positivamente).

Ci sono quattro tipi di istoni (H_2A, H_2B, H₃, H₄). I quattro istoni formano l’ottamero (core istonico) e H₁ partecipa ad un ulteriore compattamento.

Ottamero: due dimeri H_2A, H_2B ed un tetramero H₃, H₄. Prima il DNA si lega al tetramero e poi si uniscono i due dimeri a formare l’ottamero e il DNA si avvolge per due volte a formare una struttura detta nucleosoma. Due nucleosomi adiacenti sono tenuti insieme da un tratto di DNA detto linker, non legato a proteine.

Le code istoniche N-terminali non sono necessarie per l'associazione del DNA con l’ottamero istonico, ma vengono invece modificate per regolare le funzioni del nucleosoma. L'istone H₁ si lega al singolo nucleosoma ed avvicina due nucleosomi adiacenti mediante un legame testa-coda, compattando ulteriormente il DNA.

Si possono avere due modelli a seconda del DNA linker:

• Zig-zag: linker è lineare
• Solenoide: linker è curvo

Strutture di ordine superiore della cromatina

Si assiste ad un ulteriore impacchettamento: formazione di anse bloccate alla base da una struttura proteica detta impalcatura nucleare. Gli istoni possono muoversi e spostarsi. Il DNA diviene una fibra da 30nm. Con la spiralizzazione forma strutture da 300nm, la più grande è il cromosoma (1400nm). Si formano anse via via sempre più fitte fino a che non si forma un cromosoma.

Nel colorare il DNA al microscopio si percepiscono regioni più chiare e più scure, tale discromia sta a indicare il diverso complessamento del DNA con gli istoni e l’attività del DNA. Esistono diversi tipi di cromatina:

• Eterocromatina: regione di DNA altamente impacchettata, inattiva, non trascritta e appare più scura
• Eucromatina: regioni di DNA trascritte, attive, appare più chiara

Più il DNA cromatina è complessato e più sarà scuro e viceversa. La cromatina più scura ha geni che non vengono trascritti poiché gli istoni bloccano la trascrizione. I due stati del DNA sono intercambiabili poiché il legame dell’ottamero istonico è dinamico. Le modificazioni epigenetiche possono convertire le due forme di cromatina nell’altra e viceversa.

Replicazione del DNA

La replicazione del DNA avviene con una natura semi-conservativa. In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti di DNA viene usato come stampo per la formazione di un filamento complementare di DNA. Due filamenti madre (stampo), da cui si creano due nuovi filamenti complementari, generano due doppie eliche figlie uguali nella sequenza di basi ma antiparallele. Per iniziare la replicazione si deve aprire la doppia elica in particolari siti chiamati ORI, ricchi di A e T (due legami a idrogeno in meno rispetto ai tre di C e G). La separazione avviene grazie ad enzimi chiamati elicasi che utilizzano ATP. Un nuovo filamento di DNA viene formato dalla DNA polimerasi, che legge lo stampo ed inserisce il nucleotide complementare.

La DNA polimerasi forma il nuovo filamento da 5’ a 3’ (3’-OH è libero) ed è primer-dipendente, a differenza della RNA polimerasi.

• DNA primasi: legge lo stampo e crea un primer di RNA da 5’ a 3’ (è una RNA polimerasi DNA dipendente)
• DNA elicasi: utilizza ATP per rompere i legami a idrogeno del DNA. Le basi complementari tenderebbero a riformare i legami, per questo entrano in gioco delle proteine che ne impediscono la riformazione (SSB).
• DNA polimerasi: legge il filamento stampo e vi inserisce il nucleotide complementare formando un nuovo filamento. La DNA polimerasi utilizza nucleotidi trifosfato in direzione 5’-3’ formando legami fosfodiesterici.

Quando il pirofosfato viene scisso dal nucleotide trifosfato si genera energia che viene utilizzata nella polimerizzazione. La DNA polimerasi è un enzima primer dipendente (il primer è fatto da RNA) sintetizzato dalla DNA primasi (RNA polimerasi-DNA dipendente).

Polimerasi negli eucarioti

• DNA polimerasi α: genera inneschi per entrambi i filamenti di DNA
• DNA polimerasi β e ε: giocano un ruolo essenziale nella riparazione del DNA
• DNA polimerasi δ: allunga i filamenti
• DNA polimerasi γ: replica il DNA mitocondriale

Quando si duplica il DNA si genera una struttura asimmetrica che, in una parte si allunga in modo continuo (filamento leader) e in un’altra in modo discontinuo (filamento ritardato), con i frammenti di Okazaki. La DNA polimerasi sintetizza in direzione 5’-3’. Sul filamento che va in direzione 3’-5’ il processo di formazione dell’elica è continuo, sull’altra, ogni poco, deve riformarsi sempre il primer. I primer vengono in seguito rimossi con un RNAasi H e le interruzioni lasciate vengono riempite dalla DNA polimerasi ed unite dalla DNA ligasi, che riforma il legame fosfodiesterico utilizzando ATP.

Pinza scorrevole: tiene la DNA polimerasi associata al DNA a singolo filamento e la rilascia quando incontra un doppio filamento di DNA (frammento di Okazaki) sul filamento ritardato. La pinza opera insieme al caricatore della pinza. L’ATP si lega al caricatore della pinza che ne induce un cambiamento conformazionale. L’idrolisi dell’ATP induce il distacco del caricatore della pinza che è legata al DNA. A questo punto la pinza si lega alla DNA polimerasi che inizia ad operare e ne aumenta anche la processività.

Nella replicazione del DNA, la sintesi avviene in contemporanea fra filamento lento e veloce (avvengono con la stessa velocità). Ogni DNA polimerasi è legata ad una pinza. Nel filamento lento si crea una struttura detta “a trombone” in modo tale da mantenere la stessa velocità con il filamento leader. La DNA polimerasi viene caricata una volta nel filamento leader ma nel filamento ritardato se ne carica una per ogni filamento di Okazaki (ogni volta si ripete l’attacco del caricatore e della pinza e poi della polimerasi).

Durante l’azione della elicasi, la torsione a valle della molecola di DNA aumenterà, creando degli attorcigliamenti (il DNA si super-spiralizza) e questo evento deve essere evitato poiché limiterebbe il processo della elicasi.

Topoisomerasi

Le topoisomerasi sono enzimi che agiscono evitando la super-spiralizzazione che avviene sia durante la replicazione che durante la trascrizione. Questi enzimi rompono i legami fosfodiesterici. Ne esistono due tipi:

• Topoisomerasi I: hanno un residuo di tirosina nel sito attivo che rompe il legame fosfodiesterico legando un fosforo all’ossidrile della tirosina rivelando l’-OH nel C₃ dello zucchero. Il filamento non rotto, a questo punto, fa da perno per lo srotolamento del DNA. Quando si è srotolato si deve riformare il legame fosfodiesterico e si rilega il fosforo all’-OH del C₃ rigenerando il sito attivo dell’enzima (non si utilizza ATP). L’energia di rottura del legame fosfodiesterico viene immagazzinata dal legame del fosforo e dell’-OH della tirosina.
• Topoisomerasi II: rispetto alle topoisomerasi I, rimuovono superavvolgimenti più complessi. Sono formate da due subunità e legano due segmenti di DNA in due domini differenti. Quando si lega l’ATP induce un cambiamento nella conformazione che rompe un legame fosfodiesterico, creando lo spazio per far passare l’altro filamento intatto.

Telomeri

Estremità dei cromosomi costituite da sequenze non codificanti ripetute molte volte (non codificano per proteine). Questo non significa che non servano a niente, infatti producono RNA non codificanti che hanno una grande importanza. Alla fine della duplicazione si ha un ultimo primer di RNA che verrà rimosso, ma non potrà essere rimpiazzato dal DNA riportando il cromosoma alla giusta lunghezza con la telomerasi (ribonucleoproteina), che è una composta da una molecola di RNA (TERC) e da un dominio ad attività di trascrittasi inversa (TERT). L’enzima lega al 3’ l’estremità con l’RNA telomerico complementare. Dopo essersi legato attiva la trascrittasi inversa e attacca al 3’-OH un gruppo di 6 nucleotidi che sono sempre gli stessi. Questo permette di avere abbastanza spazio per formare un primer. A questo punto la DNA polimerasi α utilizza l’estremità 3’-OH come stampo per formare un primer riformando la molecola di DNA. I telomeri devono essere tutti alla giusta lunghezza, perciò, il filamento allungato se è troppo lungo viene tagliato.

Shelterin dei telomeri: i telomeri presentano la regione 3’-OH sempre più lunga della 5’-P. A questa regione si lega un complesso di 6 proteine chiamato shelterin, che blocca l’azione.