Biologia molecolare

TRASCRIZIONE

Definizione: trasferimento dell’informazione dal gene all’RNA nel nucleo della cellula prima che

l’RNA esca dal nucleo per essere tradotto in proteina

Negli eucarioti la trascrizione è separata dalla traduzione sia a livello spaziale che temporale

RNA polimerasi: enzima responsabile della trascrizione

RNA polimerasi 1: geni di classe 1: nucleolo: r RNA

RNA polimerasi 2: geni di classe 2: nucleo: m RNA, sn RNA (small nuclear RNA), mi RNA

RNA polimerasi 3: geni di classe 3: nucleo: t RNA, 5Sr RNA (RNA ribosomi ali 5S), sn RNA

Inizio Promotore: unità strutturale che in collaborazione con proteine valuta se un gene deve

essere trascritto oppure no

TFIID (fattore generale di trascrizione) è responsabile del riconoscimento di tutti gli elementi noti

del nucleo del promotore, ad eccezione di BRE che è riconosciuto da TFIIB)

Elementi del nucleo del promotore

- TATA BOX (prima ad essere scoperta)

- BRE (elemento riconosciuto da TFIIB)

- INR (elemento iniziatore)

- DPE (elemento a valle del promotore)

- MTE (elemento del motivo 10)

Sebbene possa funzionare indipendentemente dalla TATA box e dal DPE il sito esibisce un forte

sinergismo con entrambi questi elementi

Il promotore deve avere una forza dovuta alla presenza di sequenze per trascrivere il gene con una

certa probabilità

Fattori di trascrizione: proteine che si legano al filamento di DNA

TBP (TATA binding protein)

TAF 1 e TAF 2 si associano a TBP

TFIIB (lega BRE)

TAF 9 e TAF 6 legano DPE E richiede INR

Motivi o sequenze consensus: indicano il sito di inizio alla RNA polimerasi

I siti di riconoscimento per i fattori di trascrizione tendono a presentarsi in gruppi:

- CAAT box

- GC box

Gli elementi prossimali del promotore fanno aumnetare la frequenza di inizio della trascrizione ma

soltanto quando si trovano vicino al sto di inizio della trascrizione

Reclutano elementi regolatori a lungo raggio, come enancher, al nucleo del promotore

Complesso TFIID: TATA binding protein, TAF 1, TAF 2, TAF 6, TAF 9, TAF 1

Complesso TFIIB

Enancher: si possono trovare sia a valle che a monte di un gene o anche dentro un introne e

possono funzionare in entrambi gli orientamenti rispetto al promotore. Ciascun enancher è

responsabile di una parte dello schema totale di espressione del gene. Fanno aumentare l’attività

del promotore in tutti i tessuti in maniera regolata.

Isolatori: sequenza di DNA con due funzioni:

- Marcatore di confine della cromatina: etero cromatina/eucromatina

- Attività di blocco di enancher e silencer

Regioni di controllo del locus (LCR): sequenze di DNA che organizzano e mantengono un dominio

funzionale di cromatina attiva e fanno aumentare la trascrizione dei geni a valle

Macchinario della trascrizione

RNA polimerasi 2: Complesso enzimatico composto da 12 subuntà

Fattori di trascrizione: proteine che legano sequenze specifiche di DNA che si legano a promotori

dei geni e agli elementi regolatori a lungo raggio e mediano l’attivazione o la replicazione specifica

della trascrizione

Coattivatori e corepressori della trascrizione: routine che fanno aumentare o diminuire l’attività

trascrizionale tramite interazioni proteina-proteina senza legarsi direttamente con il DNA

Componenti del macchinario generale della trascrizione:

- RNA polimerasi 2: sintetizza RNA, correzione delle bozze

- Fattori generali di trascrizione: TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH: riconoscimento del

promotore e svolgimento del DNA del promotore

- Mediatori: complesso di 20 subunità che trascduce informazioni regolatrici da attivatori e

repressori alla RNA polimerasi 2

Dominio CDT dell’RNA polimerasi 2: durante il ciclo di trascrizione subisce fosforilazione dinamica

dei residui di serina in posizione 2 e 5 delle ripetizioni. L’inizio della trascrizione richiede un CDT

non fosforilato, mentre l’allungamento richiede un CDT fosforilato. Quando è fosforilato il CDT può

legare i fattori di modificazione del’mRNA durante gli eventi di terminazione. Per il ricircolo

dell’RNA polimerasi 2 e il reinizio del trascrizione il CDT deve essere di nuovo defosforilato

Sequenza degli eventi della trascrizione

- Formazione del precomplesso di trascrizione TFIID (TATA binding protein con dominio di

regolazione a nastro di zinco)

- Formazione di TFIIB che indica la direzione

- Formazione del complesso H (elicasi+fosforilazione del CDT)

Quando si lega il mediatore tutto il complesso inizia la fase di allungamento per poi staccarsi

Con l’allungamento dell’mRNA il complesso promotore si dissocia per poi riassemblarsi se lo

stimolo continua.

La presenza della proteina tradotta genera un autoloop a feedback positivo sulla trascrizione del

gene per la proteina del PGC1α

Per trascrivere bisogna spiazzare gli istoni diminuendo la sua interazione col DNA:



- HAT: istone acetil trascferasi (sottrae un gruppo acetile maggior legame con il DNA)



- HDAC: istone deacetilasi (aggiunge un gruppo acetile repulsione con il DNA

Fattori di trascrizione per il differenziamento mitocondriale tessuto specifiche

PAX 3 e PAX 7: fattori di trascrizione che permettono il legame del DNA e permettono la

trascrizione del gene dalla quiescenza

Myo D: fattore di trascrizione per i miotubi nella fase attiva di proliferazione

Miogenina: fattore di trascrizione nel differenziamento dei miotubi

Quando un soggetto è sedentario MEF2 (fattore di trascrizione) viene bloccato da HDAC

impedendo a MEF 2 di posizionasi sul DNA e de acetilare gli istoni

Quando c’è attività nel muscolo

- L’aumento della concentrazione di calcio attiva le CAMK che migrano dentro al nucleo

fosforilando HDAC

- L’aumento della concentrazione di AMP a partire da ATP attiva l’AMPK che fosforila HDAC

La fosforilazione di HDAC genera il distacco di HDAC da MEF2

Maturazione dell’mRNA

Ipossia, esercizio, restrizione calorica, età portano i fattori di trascrizione di PGC1α a legarsi per

produrre PGC1α

L’esercizio tramite innalzamento della concentrazione plasmatica di calcio e aumento del rapporto

tra la concentrazione di AMP e la concentrazione di ATP libera MEF2 dal suo inibitore HDAC e

MEF2 si lega al DNA (PGC1α)

CnA: calcineurina (fosfatasi) – stacca il fosfato a NFAT che normalmente è confinato nel citosol

nella forma fosforilata

Splicing: rimozione di sequenze introniche e ricucitura delle sequenze esoniche (aviene quasi

contemporaneamente alla trascrizione)

Processo molto delicato perché la fusione di due esoni contigui deve essere precisa al nucleotide

3 fasi:

- Taglio tra l’esone 1 e l’introne 1

- Loop dell’introne

- Legame tra gli esoni

Lo splicing può essere costitutivo (ordine normale degli esoni) o alternativo ( fusione alternativa

degli esoni con eliminazione di alcuni esoni)

Lo splicing alternativo permette di ottenere varianti proteiche

Il 95% dei geni ha uno splicing alternativo:

- Inclusione o esclusione di un esone

- Esclusione a vicenda d un esone

- Sito alternativo al 5’

- Sito alternativo al 3’

- Sito alternativo di poliadenilazione

- Formazione del cappuccio (estremo 5’)

Aggiunta di un guanosil gruppo ad opera dell’RNA guanosil trasferasi

Modificazione con l’aggiunta di un gruppo metile

Il cappuccio ha una serie di funzioni:

- Maggiore stabilità all’RNA alle ribonucleasi

- Aumenta l’efficacia dello splicing

- Favorisce l’esportazione dell’mRNA

Formazione di coda di poli A (estremo 3’)

La presenza della sequenza AAUAAA porta al taglio un po più a valle

La sequenza di adenina stabilizza la molecola

La presenza della coda e del cappuccio determina la cinetica di degradazione dell’mRNA

PGC1α

Esistono diversi splicing alternativi di PGC1α: le diverse forme hanno emivite diverse

La porzione codificante per la proteina è contenuta nell’esone 9

Sull’esone 3 e sull’esone 4 ci sono sequenze che legano la calmoduline che stabilizzano il filamento

di RNA che permette maggior quantità di BDNF (fatore neutrofico cerebrale prodotto dal muscolo

che stimola il neurone a formare nuove placche motrici)

In base ai segnali intracellulari ci possono essere due siti di trascrizione alternativi di PGC1α:

- Forma lunga: studiate nell’esercizio aerobico

- Forma breve: studiate nell’esercizio di forza

Diverse intensità di esercizio stimolano la trascrizione di diverse forme di PGC1α:

Bassa intensità promotore distale (forma lunga)

Alta intensità promotore prossimale (forma breve)



PGC1α-A esercizio endurance bassa intensità



PGC1α-a,PGC1α-b, PGC1α c esercizio di endurance alta intensità



PGC1α-4 esercizio di forza

FIT PRINCIPLE: principio alla base della plasticità muscolare

Sintesi proteica

- Stress meccanico alto

- Stress metabolico basso

- Piccole alterazioni del flusso di calcio

- Stress ossidativo basso

Biogenesi mitocondriale

- Stress meccanico basso

- Stress metabolico alto

- Stress ossidativo elevato

- Grandi alterazioni del flusso di calcio

Genicinetica di trascrizione dell’esercizio aerobico

Le alterazioni del flusso di calcio stimolano i mitocondri a produrre PTP che stimola la transizione

di fibra da glicolitica a ossidativa

Reazione all’ipossia

Se la concentrazione di O scende si acumulano elettroni nei complessi 3 e 4 della catena di

2

trasporto degli elettroni. A livello del complesso 3 avviene una fuga di elettroni

Questa produzione di ROS è inibita fisiologicamente dai sistemi di buffering dei ROS

ENDURANCE TRAINING

- Metabolismo ossidativo

- Mitocondri trascrizione di PGC1α

- Myosina sow

Le fibre di tipo 2a sono le più plastiche

L’aumento della capacità ossidativa avviene se c’è:

- Biogenesi mitocondriale

- Rimodellamento del network mitocondriale

- Turnover proteico del mitocondrio (mitofagia)

NRF: fattore di respirazione nucleare

PPAR: fattori metabolici

ERR: recettore relativo agli estrogeni

P38 e MAPK: attivata dallo stress meccanico della fibra (ERK)

Prima dell’esercizio PGC1α presenta modificazioni covalenti (acetilazioni)

Con l’esercizio CAMK e AMPK aggiungono gruppi fosfato a PGC1α attivandolo

Oltre a questo le sirtuine staccano il gruppo acetile a PGC1α attivandolo ulteriormente

PGC1α può essere regolato:

- A livello trascrizionale (CAMK, AMPK)

- A livello proteico (P38, AMPK, SIRTUINE)

Appena inizia l’esercizio la regolazione a livello proteico inizia (fosforilazione e de acetilazione)

L’accumulo di mRNA è più lento (picco a due ore dal termine dell’esercizio)

Nel sogge