Biologia molecolare

Livelli di controllo dell’espressione genica

NEGLI EUCARIOTI

Il processo di espressione genica, che inizia con la trascrizione e finisce con l’espressione della proteina attiva, è relativamente semplificato nelle cellule procariotiche ed è invece più complesso nelle cellule eucariotiche, dove vede tanti passi di controllo. Adesso, descriveremo il controllo trascrizionale, che è il punto 1, rappresentato dal controllo a livello dell’attivazione della trascrizione.

RNA polimerasi

Questa è una lista delle RNA polimerasi coinvolte nel processo di trascrizione dove la I, la II e la III sono le famose 3 RNA polimerasi comuni a tutti gli organismi eucariotici. Sono molecole complesse, costituite da un numero notevole di subunità. L’RNA polimerasi II, la più importante, è quella che determina la sintesi dell’RNA eterogeneo nucleare, ovvero dei trascritti primari, che una volta processati diventeranno RNA messaggeri. Questa RNA polimerasi II guida anche la formazione di alcuni small nuclear RNA, tranne l’U6 che è invece sintetizzato dall’RNA polimerasi III. Tutti gli altri vengono sintetizzati da un unico precursore, e poi con il “triggering” (spezzettamento) vengono prodotte le varie specie molecolari degli RNA ribosomali. L’RNA polimerasi III si occupa della sintesi del tRNA, del 5S ribosomiale, dell’U6, e poi del 7SL e 7SK che sono molecole che entrano a far parte di complessi molecolari con le proteine. Poi ci sono altre 2 RNA polimerasi, tipiche delle piante, che sono coinvolte nella sintesi di RNA non codificante. In

particolare, sono essenziali nel processo di silenziamento genico di precursori di micro-RNA. È importante ricordare che esiste un’altra RNA polimerasi negli eucarioti, che è quella mitocondriale. Questa, a differenza delle altre, è l’unica ad essere monomerica e ha una forte analogia con quelle procariotiche. È una proteina più semplice che cura la sintesi di tutti gli RNA di cui c’è bisogno di attuare la sintesi. Quindi a livello del genoma mitocondriale, che risulta piuttosto povero, porta alla sintesi dei tRNA, degli RNA ribosomiali e dei 10 RNAm che determinano la creazione di quelle poche proteine prodotte nel mitocondrio.

Anche nei procarioti, la struttura del complesso dell’RNA polimerasi è più semplice. Come numero di subunità ce ne sono 5 che prevedono la presenza del sigma70. La modalità di riconoscimento è a -10 e -35. Anche nei procarioti, l’RNA polimerasi è un complesso enzimatico fatto da varie subunità, pur avendone un numero inferiore.

RNA polimerasi fagica (T7)

Monomerica - 100 kDa

Sempre nell’ambito dei procarioti, ci sono delle particolari RNA polimerasi che sono codificate da batteriofagi. Non sono batteriche, nel senso che non sono codificate dal genoma batterico, ma vengono codificate da fagi e servono per la trascrizione ad altissima efficienza del DNA virale che

Importante è la partecipazione di ioni bivalenti magnesio che sono fondamentali per il buon andamento dell’RNA polimerasi, l’efficiente catalisi enzimatica. Il magnesio, da una parte, è legato all’RNA polimerasi e, dall’altra, è legato ai nucleotidi in ingresso, ed è funzionale alla formazione del nuovo legame fosfodiesterico.

La coda CTD è importante per la scansione temporale della trascrizione. Si hanno delle modificazioni a livello di questa coda. Questo è uno schema semplificato, anche se aderente alla realtà. In questi eptapeptidi presenti in almeno 52 ripetizioni nell’RNA polimerasi II dell’uomo, ci sono soprattutto 2 serine in posizione 2 e 5, che sono fosforilabili. Il loro stato di fosforilazione (solo 5, solo 2 o entrambe) è legato a momenti diversi della trascrizione.

RIPETIZIONI EPTAPEPTIDICHE DELLA CODA CTD

Nel momento dell’inizio della trascrizione, non è che con la fosforilazione della coda CTD in posizione di serina 5 la trascrizione parte e va fino in fondo. In realtà, ci sono varie fasi decisionali. Parte una trascrizione incerta che può essere ancora fermata con un altro momento di trascrizione. Per cui, questa trascrizione va avanti per una 50ina di basi. Poi la polimerasi va in una sorta di stallo da cui la si può togliere solo l'interazione con il Fattore P-TEFb. Questo è un fattore che stimola la ripresa della trascrizione. È in equilibrio con il Fattore NELF che tende ad inibire il P-TEFb. P-TEFb ha attività chinasica ed è capace di fosforilare NELF che diventa, a quel punto, inattivo. Per cui è un equilibrio fra questi 2 elementi. Se è preponderante P-TEF avremo l’avanzamento della trascrizione, altrimenti avremo un suo stallo che porta al distacco dell’RNA polimerasi dal DNA. Quest’ultimo caso avviene molto di frequente. Quando, invece, viene superato tale checkpoint, allora avremo l’allungamento produttivo che arriverà fino al terminatore in maniera totalmente processiva. È stato osservato (sappiamo poco al riguardo) anche un fenomeno di trascrizione divergente che si chiama trascrizione retrograda. È una trascrizione che avviene al contrario, poco efficace, che determina la formazione di un trascritto di 100 basi. La trascrizione retrograda procede in direzione opposta rispetto all’altra trascrizione. Si formano, quindi, degli RNA che sono copiati sul filamento antiparallelo rispetto a quello dell’RNA e hanno una sequenza complementare al filamento senso del DNA. Non si sa bene quale possa essere l’eventuale funzione di tali RNA, qualcuno pensa che possono avere una funzione regolativa.

La trascrizione è totalmente processiva. Nel senso che se l’RNA polimerasi va in stallo e questo stallo non viene velocemente recuperato, succede che l’enzima si stacca e ricominciamo da capo. Nei momenti di stallo, interviene un altro fattore di allungamento, detto fattore TFIIS o Fattore S, che si lega nella posizione dove c’è l’estrusione dell’RNA e permette all’RNA polimerasi, che è in stallo, di tornare indietro e di eliminare gli ultimi nucleotidi che sono stati aggiunti con un taglio endonucleasico e poi permette, di nuovo, la ripartenza della trascrizione. È un fattore che stimola l’attività endonucleasica intrinseca all’RNA polimerasi. Per cui, il Fattore S non è lui stesso l’endonucleasi, ma lo diventa l’RNA polimerasi. In questa maniera, l’RNA polimerasi taglia l’ultimo pezzo di RNA e poi ricomincia. Questa cosa ci ricorda un po' il fenomeno del proof-reading.

I trascritti degli istoni «canonici» non presentano poli-A.TURNOVER MOLTO VELOCE

FIGURA 7.6 — Generazione di mRNA privi di coda poli(A). Nei pre-mRNA degli istoni viene a formarsi è nudoesoma il quale genera una struttura a forcina che richiama la proteina SLBP, che a sua volta lega la denendoasi CPSF da stessa mostrata in Figura 7.6). Quest'immagine opera un taglio e—Oeff mRNA subito e alla coda forcina. La Forcina viene legata alla durante legami inter-caten (a).

Ci sono dei trascritti degli istoni canonici che fanno parte dell'ottamero che sono privi di coda poliA.Questi vengono generati in maniera diversa. Abbiamo la presenza di una struttura a forcina, molto solida perché ci sono varie coppie GC. Questa forcina si forma, in analogia con quello che succede nei procarioti, subito dopo che questa zona è stata trascritta. Tale struttura recluta la proteina SLBP, che si lega alla forcina. Viene poi reclutato il CPSF che è l'endonucleasi che introduce un taglioendonucleasico. Questi RNA, come gli altri, vengono prodotti con un taglio endonucleasico, ma non dovuto al riconoscimento di un sito di poliadenilazione, ma per formazione della forcina, anche se in entrambi i casi interviene CPSF.

È IMPROBABILE RIUSCIRE AD OTTENEREUN ^{cDNA "FULL-LENGTH"}

DIFFICOLTA' NEL DEFINIRE

L'INIZIO DELLA PORZIONE TRASCRITTA (GENE STRUTTURALE)E QUINDILA POSIZIONE DELLE SEQUENZE DI CONTROLLO (PROMOTORE)

COME SI DETERMINAIL SITO DI INIZIODELLA TRASCRIZIONE ?

Sappiamo molto sulla regolazione della trascrizione di vari geni, ma di tanti altri geni (di cuiconosciamo esistenza, identità e anche funzione della proteina) non sappiamo poi molto dellaregolazione trascrizionale. Di 25 mila geni, ne abbiamo qualche migliaio di cui abbiamo notizie solidesulla regolazione della trascrizione, ma su molti altri geni sono meno conosciuti tali fenomeni di regolazione. Per cui, è importante sapere quali sono le metodologie per studiare il controllo