biologia molecolare

Epigenetica

L’epigenetica è quell’aspetto della biologia che vuole studiare la relazione causale tra i geni ed i loro prodotti cioè le proteine. Una possibile definizione di epigenetica è “la serie di modificazioni al materiale genetico che cambia il modo in cui i geni vengono accesi o spenti ma non altera i geni in sé”.

Cromosomi e cromatina

Il materiale genetico sia dei procarioti che degli eucarioti si trova organizzato in strutture superiori chiamate cromosomi, i quali sono localizzati in specifiche regioni della cellula. Il DNA è molto compattato all'interno della cellula e ciò ci spiega come sia possibile che una molecola così grande (in Coli è formato da 4x10⁶ pb) possa entrare in uno spazio così ristretto (Coli ha un nucleoide, la regione in cui si trova compattato il DNA, di circa 1 μm). Si definisce in particolare quoziente di compattamento il rapporto tra la lunghezza del DNA e le dimensioni della struttura/comparto che lo ospita.

Virus

I virus possono avere come genoma sia il DNA che l'RNA e questi possono essere a singolo o a doppio filamento. In genere il volume del capside è appena sufficiente per contenere le dimensioni del genoma il quale viene racchiuso dalle strutture proteiche in due modi. Nel primo caso, tipico dei fagi filamentosi, il genoma viene circondato, mentre fuoriesce dalla cellula infettata, dalle proteine del capside che si autoassemblano su di esso. Nel secondo caso, tipico di fagi come lambda e il fago T4, prima viene assemblato un capside proteico vuoto nel quale successivamente viene introdotto il genoma con il processo ATP-dipendente di traslocazione. Nel caso specifico di lambda il genoma viene replicato nella cellula in un'unica molecola costituita da tante unità ripetute in tandem, separate da dei siti cos. In questi siti avviene il taglio del DNA che così diviene libero e completo e una volta introdotto nel capside viene condensato.

Batteri

I genomi batterici si trovano ammassati in punti della cellula chiamati nucleoidi e sono ancorati ad un punto specifico della membrana, utile per la segregazione del materiale genetico al momento della divisione cellulare, chiamato mesosoma. Il cromosoma di coli è costituito da un'unica molecola organizzata in anse che sono ancorate alla loro base a strutture non ben definite che gli conferiscono un'identità topologica che non si propaga dall'una all'altra.

Eucarioti

Durante l'interfase la cromatina è dispersa nel nucleo e ne occupa la maggior parte del volume, mentre nella più breve fase della mitosi si ha un ulteriore compattamento che porta alla formazione dei cromosomi ben distinguibili al microscopio ottico. La cromatina è il risultato dell'interazione del DNA con una classe di proteine dette istoni e durante tutto il ciclo cellulare subisce numerose variazioni. Durante l'interfase le fibre cromatiniche appaiono notevolmente disperse e i cromosomi non sono visibili: prendono il nome di eucromatina. In alcune regioni del nucleo, invece, si osservano delle masse di cromatina più compatta che prendono il nome di eterocromatina. Essa si può distinguere ulteriormente in:

• Costitutiva: resta sempre compatta e rappresenta porzioni del genoma non codificante e che potrebbero avere funzione strutturale nel cromosoma. In essa si individuano i DNA satelliti che si trovano spesso localizzati nelle regioni del centromero;
• Facoltativa: sono regioni codificanti ma che vengono esplicate solo in alcuni casi. Ad esempio possono essere espresse in un tessuto ma non in un altro oppure come nel caso del X dei mammiferi in cui, nelle femmine, una delle due X resta sempre condensata (corpo di Barr).

Negli eucarioti i geni attivi che fanno parte della eucromatina sono ipersensibili alla digestione da parte della DNAsi I. I siti ipersensibili precedono i promotori attivi.

Organizzazione particolare di alcuni cromosomi

• Cromosomi a spazzola: sono stati studiati soprattutto negli oociti degli anfibi e durante la fase meiotica. Essi sono cromosomi di natura molto distesa caratterizzati da un'attività trascrizionale molto intensa e per questo assumono un aspetto piumoso, dovuto alle anse di trascrizione che si dipartono dai lati dell'asse del centromero.
• Cromosomi politenici: sono dei casi particolari in cui in seguito a replicazioni non si ha la segregazione nelle cellule figlie. In particolare i cromatidi fratelli restano affiancati e vanno a formare dei fasci di fibre parallele che sono proprio i cromosomi politenici. Quando un gene presente in molte copie sta per essere trascritto si osservano dei puff: tratti di DNA che vengono estrusi del cromosoma in forma di anse.

I centromeri

Sono strutture essenziali per permettere la traslocazione dei due cromatidi fratelli nelle cellule figlie. Essi sono costituiti da complessi proteici che si assemblano su specifiche sequenze del DNA e ad essi poi si lega l'estremità (+) dei microtubuli. In particolare il microtubulo si ancora a una regione fibrosa chiamata cinetocore. Dall'analisi dei centromeri di S. cerevisiae si è potuto osservare che tali regioni sono di circa 120 pb e che sono costituite da 3 elementi: CDEI, CDEII e CDEIII.

Telomeri

Stabiliscono la sequenza di DNA che costituisce l'estremità di ciascun cromosoma eucariotico. Sono sequenze ripetute in tandem ricche in TG e formano una struttura chiamata T-loop.

La struttura della cromatina

Gli istoni sono proteine basiche, caratteristica che gli consente di interagire efficacemente con il DNA che è di natura acida a causa dei gruppi fosfato. Essi rappresentano la maggior parte delle proteine presenti nella cromatina, mentre le altre sono proteine non istoniche denominate HMG (high mobility group). Queste ultime rimuovono l'istone H1 e mantengono la cromatina in uno stato condensato facilitando la trascrizione.

Le unità elementari della struttura della cromatina sono i nucleosomi che una volta legati al DNA gli conferiscono la struttura chiamata a collana di perle. I nucleosomi sono l'unità dell'informazione epigenetica. È stato possibile scoprire quante basi si legano intorno ad ognuno di essi con una digestione spinta con nucleasi del DNA. È stato possibile così capire che sono 147 le basi legate ad ognuno di essi, ovvero il DNA fa quasi due giri. È stato determinato inoltre che l'interazione DNA e core istonico è di circa 140 legami a H e la maggior parte di essi si instaurano con l'ossigeno del solco minore. Il nucleosoma è composto da un ottamero istonico formato da due copie di: H2A, H2B, H3 e H4. Queste ultime due sono tra le proteine più conservate conosciute e tutte e 4 formano quello che è il core del nucleosoma. Al di fuori di esso, nella regione tra due nucleosomi, si trova la proteina istonica H1 che è quella che fra tutte le proteine istoniche è la meno conservata.

Le proteine istoniche hanno una struttura molto conservata che è denominata histone-fold formata da tre regioni ad α-elica e una coda N-terminale. La histone fold permette la formazione delle coppie eterodimeriche H2A con H2B e H3 con H4 mediante un'interazione testa coda. Il processo di legame al DNA inizia con un tetramero H3-H4 che si unisce al DNA e sul quale vengono poi reclutati due eterodimeri H2A-H2B. Le code degli istoni non sono necessarie per mantenere l'ottamero e infatti dopo digestione con trispina che agisce unicamente su di esse si ha l'ottamero intatto. Queste code hanno numerose modificazioni come acetilazioni e metilazioni che cambiano la carica netta della molecola.

In condizioni di bassa forza ionica e in assenza di H1 si ha la struttura meno condensata della cromatina che detta a collana di perle o fibra a 10 nm. In condizioni fisiologiche invece, la cromatina appare come una fibra a 30 nm, chiamata anche solenoide, in cui i nucleosomi sono organizzati in una struttura in cui ce ne sono 6 per giro e in questa struttura intervengono anche le code mediando le interazioni con nucleosomi vicini. La forma che si ha nelle cellule si ottiene grazie ad un ulteriore impaccamento in cui si pensa ci sia la formazione di anse bloccate alla base da una matrice nucleare.

La presenza dei nucleosomi comporta una serie di eventi che devono avvenire al momento della trascrizione dei geni. L'RNA polimerasi non può girare intorno ai nucleosomi in quanto ci sarebbe sicuramente una situazione di ingombro sterico date le grandi dimensioni delle due macromolecole in questione. Da una serie di studi si è potuto capire che:

• I geni che vengono trascritti contengono nucleosomi come le sequenze non trascritte.
• Quando il gene viene attivato trascrizionalmente i nucleosomi perdono la loro posizione.
• I geni trascrizionalmente attivi sono digeriti più velocemente dalle nucleasi e ciò suggerisce che in queste zone l'organizzazione nucleosomica, pur essendo mantenuta, sia più dipanata.

Modificazione post traduzionale degli istoni e modulazione dell’attività di trascrizione della cromatina: le code degli istoni sono molto importanti nella modulazione della struttura e del grado di accessibilità della cromatina. Esse possono subire una serie di modificazioni post traduzionali come acetilazioni e metilazioni delle lisine e delle arginine, la fosforilazione di serine e treonine, l'ubiquitinazione (Con il termine di ubiquitinazione ci si riferisce alla modificazione post-traduzionale di una proteina dovuta al legame covalente di uno o più monomeri di ubiquitina), la sumoilazione delle lisine e l'ADP-ribosilazione. Vi sono specifici moduli proteici che riconoscono particolari tipi di modificazioni: per esempio i cromodomini riconoscono le lisine metilate mentre i bromodomini riconoscono le lisine acetilate.

Nota bene: quando i geni vengono attivati trascrizionalmente non solo si osserva un rimodellamento della cromatina ma anche un loro cambio di posizione.

Regolazioni epigenetiche

Il termine eredità epigenetica si riferisce alla trasmissione ereditaria di caratteri fenotipici causata da meccanismi diversi da alterazioni di sequenze nucleotidiche nel DNA. La metilazione del DNA, ad esempio, è implicata nei procarioti nel riconoscimento del filamento di nuova sintesi rispetto a quello di vecchia sintesi e la metilazione di alcune basi può servire ai procarioti da difesa contro enzimi che degradano il DNA in quel fenomeno chiamato ristrettività dell'ospite.

Nei mammiferi sono metilate principalmente le citosine seguite da G e tali sequenze sono chiamate CpG. Se consideriamo una sequenza di queste nel DNA si può constatare che essa costituisce una mini-palindrome ovvero si legge 5'-CpG-3' su entrambi i filamenti e dopo un ciclo replicativo si ottiene un filamento metilato e l'altro no. Tale DNA si dice emimetilato ed in futuro il filamento non metilato verrà modificato in modo da essere come quello di partenza. La metilazione avviene ad opera di DNA metil transferasi o metilasi che aggiungono un gruppo metilico in posizione 5' della citosina. Esse si dividono in metilasi de novo, ovvero che aggiungono gruppi in nuove posizioni e metilasi di mantenimento che sono quelle che si occupano di metilare i filamenti emimetilati. Allo stesso modo le demetilasi rimuovono il gruppo CH3.

Le sequenze CpG (metilate o non) non si trovano distribuite in modo uniforme nel DNA ma sono raggruppate in gruppi che sono stati chiamati isole CpG, che si trovano più o meno alle estremità 5' di molti geni. È stato visto che tali isole sono regioni ipometilate. Questo è dovuto al fatto che innanzitutto le isole CpG non sono dovute a un eccesso di CpG ma sono le zone adiacenti ad essere svuotate di C. Questo accade perché spesso le C vicine alle G che possono essere metilate subiscono mutazioni, possono divenire timine mediante deamminazione spontanea o possono essere lette “erroneamente” dalla DNA-polimerasi. Questi eventi hanno determinato nel corso dell'evoluzione un impoverimento di C che possono essere metilate nel DNA. Le isole CpG sono protette dalla metilazione in quanto spesso si trovano in regioni vicine ai promotori dove spesso si trovano legati numerosi complessi proteici che le rendono poco accessibili alle metilasi. Quindi più un gene è espresso più le sue isole sono protette e in accordo con ciò è stato trovato che nei geni housekeeping (espressi ovunque) contengono molte più CpG degli altri geni.

Dal punto di vista della trascrizione in genere un'ipermetilazione delle CpG in corrispondenza del promotore corrisponde a un'inibizione della trascrizione e viceversa. Ciò è possibile osservarlo con un esperimento in cui si coltivano delle cellule in presenza di un analogo della citosina che è la 5-azacitosina che viene messa al posto delle C nel processo di replicazione e poiché presenta un azoto in posizione 5 non può essere metilata e i geni che la presentano sono in genere attivi trascrizionalmente. Non si può concludere però che la metilazione e la demetilazione siano responsabili della regolazione della trascrizione infatti spesso sono necessarie ma non sufficienti.

Imprinting genomico

Esso insieme al rimodellamento della cromatina rappresenta il principale meccanismo di regolazione epigenetica. Riguarda solo un numero ridotto di geni. Esso risulta nell'espressione di una copia genica proveniente da un genitore e non dell'altra anche se le due sequenze hanno la stessa sequenza nucleotidica. Questo accade perché possono essere diversamente metilate e poiché la metilazione “contrassegna” una delle due copie come di provenienza paterna o materna si parla di imprinting.

Il numero di CpG metilate è alto nell'embrione e va progressivamente diminuendo durante il differenziamento di organi e tessuti. Solo nelle cellule germinali, sia nel maschio che nella femmina, a livello embrionale si demetilano completamente. Poi nella spermatogenesi e oogenesi le metilazioni vengono riportate de novo con un meccanismo ancora non chiaro con alcune differenze tra maschi e femmine. Comunque sia al momento dell'unione di questi gameti si avrà un embrione con almeno una delle due copie di un determinato gene attiva e se esse saranno uguali, che si esprima l'una o l'altra non farà differenza. Se una delle due sarà mutata e non funzionale ci sarà un effetto diverso a seconda di quale delle due sarà attiva.

Rimodellamento della cromatina

Sono i meccanismi regolativi basati sul rimodellamento della cromatina e sono strettamente regolati e avvengono con un preciso ordine temporale e spaziale durante lo sviluppo. In genere sono meccanismi ereditabili. Sono divisibili in tre tipi:

• Modificazioni post traduzionali degli istoni: le modificazioni già sopra citate hanno un effetto sulla stabilità del cromosoma. Ad esempio le acetilazioni e le fosforilazioni diminuendo la basicità degli istoni, rendono il legame nucleosoma-DNA meno stabile favorendo lo scorrimento del primo sul secondo. Un esempio è la reclutazione da parte di un attivatore a monte del promotore di una istone acetil transferasi che acetila le code degli istoni contigui e promuove l'apertura del promotore che adesso diviene accessibile per la RNA-polimerasi.
• Complessi di rimodellamento ATP dipendenti: questi complessi grazie all'uso di ATP destabilizzano i nucleosomi, li scalzano o li riposizionano e in ogni caso rendono libero il DNA. Essi a loro volta sono reclutati da dei fattori che interagiscono con la regione del DNA bersaglio.
• Sostituzioni di varianti istoniche: l'incorporazione di una variante istonica sembra non dipendere dalla replicazione e implica quindi la sostituzione di un istone in un nucleosoma già formato. Il codice istonico viene letto dalle proteine implicate nell'espressione genica.

Compattamento dei cromosomi mitotici

Durante la mitosi l'espressione genica si spegne e alcuni istoni vengono modificati per far compattare la cromatina. Agiscono in particolare coesine e condensine: le prime collegano i cromatidi fratelli in un anello di coesione che viene rilasciato al momento della mitosi mentre le seconde sono responsabili della condensazione che avviene proprio nella mitosi. Dal punto di vista molecolare sono complessi proteici formati da dimeri di proteine SMC formate da una struttura coiled coil-cerniera-coiled coil. Al loro N terminale c'è il sito di legame per ATP e DNA e lo stesso al C-terminale. Tale struttura fa pensare che esse possano formare dei legami crociati in cui le estremità si ancorano a due filamenti di DNA.

Modificazione post traduzionale di proteine

Ci sono tre diverse vie che permettono di aumentare la variabilità delle proteine trascritte senza dover considerare un numero di geni maggiore che codifichi per ognuna di esse. Il primo, anche se poco frequente, consiste nell'utilizzo di metionine diverse all'inizio della traduzione, il secondo prevede alcuni meccanismi di processamento post-trascrizionale come splicing alternativo ed editing ed infine il terzo riguarda proprio le modificazioni post-traduzionali delle proteine. Alcune modificazioni sono irreversibili come nel caso di digestione di proteine da parte di proteasi che ne permettono l'attivazione funzionale.

Un'altra modificazione è la poliubiquitinazione che di solito è un messaggio di indirizzamento della proteina verso il proteosoma che è un organello cellulare deputato alla degradazione di proteine. L'ubiquitina è una piccola molecola di circa 76 aa che è molto conservata in tutti gli eucarioti e recentemente è stato visto che è implicata in numerosi processi. Essa in particolare invia la proteina alla via degradativa quando è ancorata ad essa in 4 o più subunità e il destino delle proteine legate ad essa dipende anche dal compartimento in cui tale modificazione avviene. Essa deve innanzitutto essere attivata e tale processo consiste nella formazione di legami covalenti con le proteine bersaglio.