biologia molecolare

2. IDENTIFICAZIONE DELLA REGIONE DI CONTATTO CON DNASI I

3. SAGGIO DI INTERFERENZA PER MODIFICAZIONE CON DMS

4. FOOTPRINTING

5. MUTAGENESI

→procarioti = 50 nt al secondo che corrisponde a 15 aa al secondo di sintesi proteica. Non c'è

bisogno di un primer e il legame della RNA-polimerasi con il promotore viene definito complesso

chiuso poiché il DNA è ancora integro. In seguito una serie di cambiamenti nell'enzima ne inducono

l'apertura con la conseguente formazione del complesso aperto. L'RNA- polimerasi inizialmente

sintetizza un filamento senza staccarsi dal promotore che viene rilasciato prima di raggiungere i 9 nt

e tale processo si ripete molte volte fino a che non si forma un ibrido DNA-RNA più lungo di 9, il

DNA infatti sembra fungere da regolatore allosterico. Tale fase è stata studiata con le tecniche di

DNA footprint e sembra che sia importante anche per rimuovere una regione del fattore sigma che

occupa inizialmente il canale di uscita. Il trascritto in genere inizia sempre con una A segno che nel

sito attivo ci deve essere una particolare affinità per il corrispondente nucleoside trifosfato.

Ci sono tre modelli che tentano di spiegare come la RNA-polimerasi avanzi sul promotore:

passaggio transiente = la polimerasi avanza per un tratto breve sintetizzando un corto

• frammento abortivo di RNA e poi indietreggia tornando sul promotore;

bruco = la polimerasi, che in questo modello dovrebbe essere molto flessibile, si allunga e si

• contrae sul DNA;

accartocciamento = inizialmente sta ferma sul promotore e ingloba dentro di sé del DNA che

• poi accartoccia. Questo potrebbe essere fatto anche nella fase di allungamento ed in

particolare si pensa che fornisca l'energia necessaria per promuovere il distacco dal

promotore.

→promotori e sigma = il promotore nei batteri ha tre componenti:

una sequenza a -35 TTGACA

una sequenza TATAAT a -10

una sequenza +1 che presenta la A del TSS.

Se si verificano delle mutazioni si possono avere due casi:quelle down diminuiscono l'efficienza del

promotore mentre le up ne aumentano l'efficienza.

Invece per quanto riguarda l'oloenzima esso potrebbe non riuscire a legarsi al DNA se sul filamento

codificante si hanno troppe mutazioni poiché è con esso che instaura la maggior parte dei punti di

contatto.

La RNA-polimerasi ha una sua affinità per il DNA ed in particolare nella cellula essa si trova legata

alla doppia elica con un equilibrio in cui il distacco sarà lento e il legame veloce. Essa però non è in

grado di legarsi specificamente e con grande precisione al sito di inizio infatti per fare ciò è

necessario il fattore sigma. Quest'ultimo deve essere legato alla RNA-polimerasi altrimenti essa non

è in grado di riconoscere la zona del promotore. In particolare inizialmente la RNA-polimerasi con

la subunità sigma già presente contatta la sequenza -35, poi sulla regione del promotore si forma il

complesso chiuso ed infine la fusione nella zone della regione a -10 permette la formazione della

forma aperta.

L'allungamento è la fase successiva che inizia quando il fattore sigma non blocca più l'uscita del

filamento e non si hanno più i trascritti abortivi. Questo non è affatto un processo senza interruzioni

e continuo. Spesso le RNA-polimerasi rallentano, fanno delle pause e creano dei complessi inattivi,

dove il 3'OH del trascritto si distacca dal sito attivo, e che possono essere riattivati in seguito.

Esistono dei fattori di allungamento come GreA e GreB che riattivano tali processi e aumentano la

velocità di sintesi. Inoltre GreB può partecipare alla correzione di bozze di tipo idrolitico in cui

deve essere idrolizzato un nt errato che è stato introdotto nella catena.

Inoltre mano a mano che la polimerasi avanza si generano dei superavvolgimenti positivi e negativi

lungo il DNA e ciò viene definito modello dei domini gemelli per la trascrizione: ogni 10 nt

polimerizzati si genera un superavvolgimento a valle e uno a monte. Se se ne creano troppi positivi

il DNA si compatta e la sintesi si arresta.

Infine si ha la terminazione in cui la sintesi si arresta grazie al transito della RNA-polimerasi su

alcune sequenze definite terminatori. In coli ci sono due diversi meccanismi per terminare la

trascrizione: si possono avere dei terminatori intrinseci ovvero delle sequenze palindromiche ricche

in G-C seguite da un tratto ricco in A-T, che da sole inducono il distacco dell'enzima e il rilascio

dell'RNA formando una forcina che destabilizza il complesso trascrizionale; oppure la terminazione

Rho-dipendente in cui la proteina rho si lega a una sequenza ricca di citosine e povero di G che è

privo di strutture secondarie ed è chiamata sito di utilizzo di rho. Questa usando ATP si muove in

direzione 5'→ 3' come un'elicasi, raggiunge l'RNA-polimerasi, la dissocia e poi separa l'brido DNA-

RNA.

Quando si ha sul DNA una mutazione non senso ed i ribosomi si distaccano precocemente Rho può

accedere alla RNA-polimerasi e terminare prematuramente la trascrizione.

REGOLAZIONE

i batteri sono particolarmente sensibili alle molecole presenti nel terreno di cultura poiché esse

possono fungere o come attivatori implicati nella regolazione positiva, contribuendo a incrementare

il livello di trascrizione, oppure come repressori implicati nella regolazione negativa. In particolare

il momento in cui esse agiscono è la fase iniziale della trascrizione, infatti influenzano il legame

della RNA-polimerasi al promotore. Il repressore si lega a una sequenza chiamata operatore, che si

può trovare sovrapposta o adiacente al promotore, mentre l'attivatore si lega con due domini: uno

interagisce con la RNA-polimerasi e l'altro riconosce una sequenza vicina al promotore

promuovendo la formazione del complesso aperto e della isomerizzazione della molecola di RNA-

polimerasi.

Nei procarioti i geni sono organizzati in operoni ovvero sono posti gli uni adiacenti agli altri e

vengono trascritti in un unico mRNA che per questo motivo viene definito policistronico.

Un tipico operone in particolare è formato da: uno o più geni strutturali che codificano per delle

proteine, un unico promotore che si trova a monte rispetto a tutti questi geni, un operatore

sovrapposto o adiacente al promotore ed infine un gene regolatore che produce la proteina

regolatrice ma che non viene considerato parte integrante dell'operone in quanto tale sequenza si

può trovare anche dislocata in un punto del genoma lontano da esso.

Gli operoni possono essere di due tipi diversi: ci sono quelli inducibili e quelli reprimibili. I primi

sono normalmente silenti e possono essere indotti mentre gli altri sono normalmente attivi e

possono essere repressi. → si può trovare dove è l'operatore con la tecnica del DNA footprint

Inoltre tali operoni possono essere soggetti a due diversi tipi di controllo: positivo e negativo e

queste due modalità possono combinarsi indipendentemente con le due tipologie di operoni.

Nel caso del controllo positivo si ha una proteina trans-agente prodotta dal gene regolatore si lega a

sequenze cis-agenti e promuove la trascrizione mentre nell'altro caso la proteina trans-agente si lega

a sequenze cis-agenti per inibire la trascrizione.

→OPERONE LAC (operone inducibile) = è soggetto a due meccanismi di regolazione :

1. regolazione negativa o specifica = l'operone lac è formato dai geni LacZ che codifica per

l'enzima β galattosidasi, il gene LacY che codifica per una permeasi che consente l'ingresso

di lattosio nella cellula e dal gene LacA che codifica per la tiogalattoside-permeasi che

trasferisce un gruppo acetilico ai β galattosidi.

A monte di essi troviamo il promotore, l'operatore ed infine molto più a monte il gene LacI

che è un gene regolatore costitutivamente trascritto a partire da un proprio promotore. Esso

codifica per un repressore che se legato all'operatore inibisce la trascrizione dei geni

dell'operone Lac: in particolare con un dominio lega proprio la sequenza dell'operatore

mentre l'altro lega le molecole segnale come lattosio e simili.

L'induttore naturale è l'allolattosio, un analogo del lattosio e sottoprodotto della β

galattosidasi, che si lega all'operatore favorendo la trascrizione. In assenza di esso il

repressore si lega al repressore che non è più in grado di legare il DNA (le due teste al

livello della cerniera del repressore si inclinano e non possono più legarsi alla doppia elica)

e inibisce la trascrizione. c

I mutanti costitutivi Lac producono una β galattosidasi funzionale ma non regolata dalla

presenza/assenza dell'induttore. Di essi ne esistono due categorie: quelli che mappano

c c

nell'operatore (O ) e quelli che mappano nel gene regolatore I (I ). In entrambi i casi ciò che

avviene è che viene impedito il legame del repressore all'operatore. Se però tali mutanti si

pongono in parziale diploidia con una copia del tipo selvatico posta su un plasmide

rispettivamente si avranno un fenotipo costitutivo e wild-type. Le mutazioni Oc infatti

interessano la sequenza nucleotidica dell'operatore ed esse hanno permesso di identificare

l'operatore come un elemento che non funziona attraverso un prodotto genico ma solo in

quanto capace di essere legato e riconosciuto dal repressore. In questo modo i geni

strutturali adiacenti in questo tipo di mutazioni saranno espressi costitutivamente mentre

quelli sul plasmide saranno regolati normalmente. L'operatore è definito dominante in cis

poiché controlla solo i geni strutturali a valle o adiacenti ad esso.

c

Le mutazioni LacI invece, portano alla mancanza della produzione del repressore attivo e

in grado di riconoscere l'operatore; perciò se poste con il plasmide bastano i repressori

funzionanti prodotti da quest'ultimo per riottenere un fenotipo wt. Esso viene definito

dominante in trans in quanto con il suo repressore riesce a controllare i geni anche distanti

sul genoma.

Il repressore Lac in particolare è una molecola dimerica in cui ciascun monomero è formato

da: un dominio N-terminale o testa che si lega al DNA, un dominio centrale che contiene il

sito di legame per l'induttore, una regione C-terminale che contiene una α-elica implicata

nella formazione del tetramero con il quale il repressore lega due operatori. Il repressore si

lega al DNA grazie alla presenza di un motivo detto elica-giro-elica che è formato da due α

eliche di cui una è detta elica di Riconoscimento e l'altra stabilizza l'interazione DNA-

proteina. La zona in cui avviene il legame è in presenza di due emisiti parzialmente ripetuti

ed invertiti a cui si lega ogni monomero. S

Le mutazioni che i