Biologia Molecolare

Biologia molecolare

La biologia molecolare nasce negli anni '30 e '40 con il fine di spiegare il fenomeno della trasmissione dei caratteri ereditari in termini molecolari, operando così un’unificazione tra genetica e biochimica. Il DNA è il materiale genetico, scoperto nel 1944, da qui nasce la biologia molecolare e studia in che modo viene immagazzinata l’informazione genetica e come viene espressa. Tra la scoperta del DNA e l’identificazione del DNA come materiale genetico la strada è lunga, circa 100 anni.

Nucleina

Inizialmente venne chiamata nucleina dal tedesco Miescher che la scoprì. Levene scoprì notevoli dettagli biochimici del DNA: era composto da nucleotidi formati da basi azotate, zuccheri e fosfati. Si pensava fosse un polimero regolare (subunità uguali), ma Levene scoprì che non poteva essere portatore di informazione poiché era troppo semplice. In seguito si capì che il DNA è la molecola informazionale e poi successivamente si scoprì la struttura.

Salvador Luria, italiano, ha formato il gruppo del fago, costituito principalmente da ricercatori che scelsero di utilizzare i batteriofagi per determinare la struttura e funzione dei geni. Erano considerati come i sistemi genetici più semplici e si pensava che potessero contenere uno o pochissimi geni (oggi sappiamo che ne contengono molti di più).

Principio "trasformante"

Intuito con esperimenti, in questo caso grazie a Griffith (1929) che ha reso possibile l’identificazione di un sistema sperimentale, studiando per un vaccino per prevenire la polmonite usando ceppi del batterio Streptococcus pneumoniae.

Un esperimento dimostrativo necessita di qualcosa di adatto che sia semplice e inequivoco. Usò due ceppi di pneumococco: uno virulento S (smooth) e uno non virulento R (rough). Il ceppo R, privo di una capsula polisaccaridica, non causa polmonite nei topi in cui viene iniettato; al contrario il ceppo S, che ha una capsula polisaccaridica, lo protegge dal sistema immunitario del topo causandone la morte. Il ceppo S inattivato messo in contatto con il ceppo R era in grado di trasferire qualcosa convertendolo in un ceppo S, rendendolo virulento e causando la morte del topo. Lui chiamò "principio trasformante" questo qualcosa.

Avery ha portato avanti l’esperimento identificando il principio trasformante, iniettando degli estratti dei batteri patogeni che distribuirono in varie provette per dimostrare la natura del principio trasformante. Quando R è virulento ha acquisito l’informazione dal ceppo S. Analizza gli estratti frazionandoli: parte di DNA, parte di proteine, parte di polisaccaridi; successivamente venivano aggiunti i batteri rugosi non patogeni che dovevano essere trasformati. Per frazionarli, ogni provetta conteneva diversi reagenti per la degradazione specifica di proteina, RNA e DNA. Solo inserendo il DNA, i batteri cambiavano morfologia in batteri di tipo S causando la morte del topo. Questo esperimento non fu preso sul serio perché il DNA non era in grado di trasportare informazioni poiché era considerato una molecola troppo semplice: considerato un paradigma, messe in discussione delle verità acquisite.

Altri esperimenti poi dimostrarono che il DNA era l’elemento trasformante. Hershey e Chase nel 1952 analizzarono i radioisotopi per seguire le molecole. Fagi marcati con P³² (fosforo radioattivo) nel DNA e con S³⁵ (zolfo radioattivo) nelle proteine della capsula e poi infettano il batterio. Quale componente entra nella cellula? Dopo infettata, eliminati i virus sulla superficie cellulare tramite frullatore e poi analizzato cosa è entrato e cosa rimane fuori. All’interno della cellula si trova il DNA virale e non le proteine e nel virus, formato dopo la lisi, era presente il DNA virale. Nella replicazione virale, le informazioni venivano portate dal DNA virale, e che le proteine non trasmettono informazione genetica.

Dalle cellule in coltura prelevare DNA purificato e far sì che le cellule acquisiscano alcuni caratteri ovvero la capacità di esprimere diverse proteine. Dimostrato nuovamente che il DNA porta l’informazione genetica. Basta solo il DNA per produrre proteine specifiche. Dagli anni '50 in cui venne accettato che il DNA è il vero materiale genetico, iniziò la corsa per comprendere la struttura fisica tridimensionale del DNA.

Struttura chimica del DNA

Zucchero 2-deossiribosio, basi azotate purine (A e G) e pirimidine (C, T e U), gruppo fosfato che serve per unire tra di loro diverse subunità al carbonio 5' o 3' del ribosio.

• Gruppi monofosfato, difosfato o trifosfato.
• AMP adenosina 5'-monofosfato
• dAMP deossiadenosina 5'-monofosfato

Ossatura di gruppo fosfato e deossiribosio (idrofila). Le basi azotate fuoriescono dall’ossatura in posizione 1 del carbonio dello zucchero, costituendo un nucleotide. Il gruppo fosfato conferisce alla molecola una valenza acida ed è legato al carbonio dello zucchero in posizione 3’ e 5’ attraverso un legame estere chiamato fosfodiesterico. Questo legame va a conferire una sorta di asimmetria, o meglio una polarità.

I nucleosidi sono 5 e sono formati dalla base azotata e dallo zucchero: adenosina, guanosina, citidina, timidina e uridina. Il legame è chiamato N-glicosidico in cui partecipano il carbonio 1 dello zucchero e l’azoto 1 delle pirimidine oppure l’azoto 9 delle purine.

Risultati preliminari alla scoperta della struttura del DNA

Chargaff misurò la percentuale delle basi azotate derivanti da DNA di origine differente. Il DNA preparato da diversi tessuti della stessa specie hanno sempre la stessa composizione in basi. Osservò che, qualsiasi sia la fonte del DNA e nonostante la diversa composizione in basi, veniva sempre rispettata una regola di Chargaff (regola della complementarità). La composizione delle basi è variabile ma il rapporto tra coppie di basi AT e GC viene sempre mantenuto ed è quasi 1. Le piccole variazioni non sono rilevanti ma è importante che il rapporto rimanga costante nelle varie specie. Watson e Crick avevano dei risultati su cui progettare la struttura. La struttura ottenuta grazie all’analisi scientifica tramite la diffrazione a raggi X, che consiste nel passaggio di fasci di elettroni per ottenere la molecola da analizzare in forma di cristallo in cui le molecole (e quindi gli atomi) sono allineati in maniera ordinata. La tecnica si basa sulla formazione di cristalli della molecola. Rosalind Franklin, scomparsa prematura, non ha permesso di vincere il premio Nobel.

Pauling già fatto studi importanti su proteine le quali componevano i geni (ancora non si era scoperto che il DNA fosse il materiale genetico), ha scoperto l’alfa elica delle proteine. Watson e Crick avevano capito dalla fotografia della Rosalind la struttura a doppia elica, con le basi azotate interne che interagiscono tra loro dando la stabilità della doppia elica. Si poteva identificare la polarità del DNA ovvero una direzione, infatti i filamenti erano anti-paralleli. Gli appaiamenti erano limitati solo ad alcune coppie. La complementarità stabilizza le basi azotate e dà la struttura a doppia elica.

Complementarità tra le basi azotate: Citosina con Guanina con 3 legami idrogeno, Timina con Adenina con 2 legami idrogeno; le purine con le pirimidine. Le basi azotate sono composti idrofobici e vanno a posizionarsi all’interno per sfuggire all’acqua. È una proprietà fondamentale, poiché rende stabile la doppia elica. Le basi azotate, parte di anelli planari, sono complanari, sono impilate, anche questo stabilizza la struttura poiché le interazioni idrofobiche tra le basi e quelle di impilamento provocano una diversa orientazione delle basi, infatti non sono parallele tra di loro. I due filamenti, composti da zuccheri e gruppi fosfato che formano l’ossatura, hanno una polarità: 5’-> 3’ oppure 3’ -> 5’, hanno polarità inversa.

Ulteriore proprietà è che sono presenti dei solchi derivanti dall’asimmetria: solco maggiore, il più profondo e solco minore, il meno profondo che derivano dall’avvolgimento dei due filamenti. La molecola che interagisce con il DNA deve interagire con le basi interne e questo avviene grazie alla presenza di questi solchi, soprattutto quello maggiore il quale ha molti più atomi che possono essere donatori o accettori di legami idrogeno. La stabilità è data anche dalla composizione in basi del DNA, in quanto un DNA ricco di CG, con 3 legami idrogeno, è più stabile di un DNA ricco di AT. L’effetto idrofobico dipende dall’impilamento e quindi dalla sovrapposizione di coppie di basi adiacenti e quanto due coppie di basi sono sovrapposte dipende dalla particolare sequenza di nucleotidi. Il diametro del DNA è di 20 Å, il passo è di 34 Å ovvero è la distanza tra un giro e l’altro (ampiezza del solco). Ogni coppia è ruotata rispetto alla successiva di 36°, per fare un giro completo servono 10 coppie di basi (360°), l’avvolgimento dell’elica ha una sua direzione, in senso orario ovvero elica destrorsa. Inizialmente ipotizzata da Watson e Crick. La complementarità fornisce idea sul meccanismo di replicazione del materiale genetico. Infatti avviene attraverso la separazione dei due filamenti parentali e la sintesi di due filamenti nuovi, usando come stampo i filamenti originari, dando origine a due doppie eliche. La nuova sintesi avviene attraverso la proprietà dell’appaiamento delle basi. La struttura di tipo B non è l’unica forma, può esistere in conformazioni alternative o strutture di tipo A. Struttura di tipo A è più spessa, con diametro maggiore, con solchi meno profondi, ha 11 coppie di basi per giro. Struttura di tipo Z, diametro inferiore con avvolgimento meno regolare con 12 basi per giro, inoltre ha un avvolgimento inverso, è sinistrorsa. Doppie eliche di RNA assumono struttura di tipo A. La struttura di tipo Z è presente in rare condizioni.

Strutture superiore

La struttura a doppia elica ha molti vantaggi, come una stabile e protetta conservazione dell’informazione genetica al suo interno. Per ottenere una duplicazione è necessario la separazione di due filamenti originari per poterli usare come stampo. Vengono separati in un punto, nella forcella di replicazione o forca. La forcella scorre lungo i filamenti creando uno stress ovvero un superavvolgimento, ovvero la doppia elica tende ad avvolgersi più strettamente. Sono strutture superiori del DNA. Possono essere positivi quando l’elica è meno allargata (sottospiralizzato) e negativi quando l’elica è più allargata (superspiralizzato), e può convertirsi nella separazione locale dei due filamenti. In entrambe le circostanze c’è un accumulo di energia, stress torsionale. Possono interferire con l’espressione dei geni, la duplicazione e la segregazione dei cromosomi, contiene infatti energia necessaria per aprire i due filamenti o alle origini di replicazione o nelle regioni dei promotori, investe una considerevole quantità di energia per mantenere lo stato topologico sotto controllo. Ci sono diversi modi per accumulare l’energia dovuta al superavvolgimento: si possono formare delle strutture che assorbono l’energia torsionale con strutture cruciformi o strutture di tipo Z. La doppia elica sotto stress interagisce con proteine che assorbono questa energia. Troppo stress non è compatibile con le reazioni fisiologiche che deve subire il DNA come replicazione e trascrizione. La molecola così superavvolta contiene un eccesso di energia libera che può permettere al DNA di subire delle transizioni strutturali che non sarebbero possibili nel DNA rilassato. Una di queste transizioni consiste nella separazione (denaturazione) dei due filamenti per un breve tratto. Ogni giro di superelica può essere “riassorbito” dalla denaturazione di una sequenza di circa 10 paia di basi. È evidente che questo avviene con più facilità in tratti di DNA ricchi in paia di basi AT. Topologia del DNA ovvero un altro nome per identificare il superavvolgimento. Gli enzimi che modificano l’avvolgimento sono le topoisomerasi di tipo I e di tipo II. Queste sono in grado di rompere uno o due filamenti e consentire il passaggio dell’altro filamento, o una porzione, e successivamente richiudere il DNA. Sono enzimi indispensabili alla vita della cellula. Le topoisomerasi possono agire in due modi: attuare una rotazione controllata in cui avviene una rottura di uno dei due filamenti, la rotazione di quest’ultimo, diminuendo il numero di giri e poi richiuderlo; attuare un passaggio del filamento in cui, dopo avvenuta la rottura, viene fatto passare un filamento o la doppia elica attraverso la rottura che verrà in seguito risaldata.

• Tipo I sono in grado di rompere uno dei due filamenti e di consentire all’altro di entrare nel punto di rottura e successivamente di richiuderlo. Questo è un modo per diminuire gli avvolgimenti.
• Tipo II tagliano entrambi i filamenti e consentono ad una parte della doppia elica di passare e poi vengono saldate. Risolvono vari tipi topologici: possono togliere che aggiungere gli avvolgimenti sia positivi che negativi. Alcuni di questi enzimi per funzionare richiedono ATP.

Le topoisomerasi non sono gli unici enzimi presenti ma ci sono anche:

• Polimerasi che sintetizzano DNA o RNA come trascrittasi inversa DNA polimerasi e RNA polimerasi;
• Ligasi che formano dei legami tra estremità di DNA o RNA, sono le endonucleasi che tagliano un filamento al suo interno, le esonucleasi tagliano il filamento a partire dalle estremità tagliando un nucleotide alla volta;
• Nucleasi che creano delle rotture sui singoli o doppi filamenti.

Proprietà del DNA

L’appaiamento delle basi (associazione) è una reazione reversibile e in alcune circostanze può essere eliminato, quindi avviene una dissociazione oppure denaturazione mentre il processo contrario è detta rinaturazione ovvero quando si forma di nuovo l’appaiamento. L’equilibrio dipende dalle condizioni chimico-fisiche in cui si trova il DNA. Scaldando il DNA si ha una denaturazione poiché il calore fornisce energia necessaria per provocare la rottura dei legami. Per favorire la rinaturazione serve agire anche sul pH aumentando la concentrazione salina. Anche la forza ionica ha la capacità di favorire o sfavorire la stabilità della doppia elica. Il DNA quando contiene basi azotate ovvero anelli aromatici è in grado di assorbire la luce ultravioletta. A 260 nm l’assorbimento permette di analizzare la quantità di DNA presente in soluzione.

Il DNA nella forma della doppia elica o denaturata assorbe la luce ultravioletta in maniera diversa: effetto ipercromico. La forma denaturata è in grado di assorbire più luce ultravioletta, aumenta la sua assorbanza. Questo permette di studiare il DNA in caso se quest’ultimo sia denaturato o meno. All’aumentare della temperatura, l’assorbanza rimane quasi costante all’inizio, il DNA ha una sua stabilità ma ad un valore limite di temperatura il DNA inizia a denaturarsi ovvero ad aprirsi fino ad un altro valore di temperatura in cui il DNA è tutto denaturato. La temperatura in cui sono metà DNA denaturato è definita temperatura di fusione. È caratteristica di diverse molecole di DNA in quanto hanno una stabilità diversa, ciò dipende dal diverso appaiamento delle basi azotate: AT meno stabili con temperatura di fusione più bassa, CG più stabili con temperatura di fusione più alta. Una membrana che immobilizza i singoli filamenti esposta con altri filamenti, può avvenire un appaiamento tra filamento immobilizzato e uno libero.

Sequenze palindromiche in cui a partire da un asse di simmetria, si può ottenere l’appaiamento del filamento su se stesso, si forma una struttura a forcina dove all’apice ci sono basi non appaiate definita ansa. Sono sequenze di DNA duplex identica su entrambi i filamenti se letti nella stessa direzione, può assumere una struttura cruciforme. La struttura crociforme deriva dall’appaiamento di due strutture palindromiche ed è in grado di sottrarre giri al superavvolgimento, si nota spesso con i filamenti di RNA dove le basi si appaiono tra di loro con appaiamenti più o meno complessi e comprendere più o meno basi. Infatti le molecole di RNA non sono singoli filamenti lineari distesi ma piuttosto strutture tridimensionali complesse comprendenti forcine a doppio filamento e regione non appaiate. Se è presente una gemma, base non appaiata, si forma una struttura di tipo A favorevole per il legame con le proteine. Le strutture cruciforme sono in grado di sottrarre giri dal superavvolgimento della molecola, diminuendo così l’energia accumulata.

Struttura “pseudonodo” dove le basi non appaiate nell’ansa possono formare ulteriori ripiegamenti, provoca un ulteriore ripiegamento.

Alterazioni della sequenza: mutazioni

Possono essere una modifica chimica di una base oppure un’incorporazione di una base sbagliata. L’effetto è un’alterazione dell’informazione oppure l’alterazione della struttura. Grazie all’appaiamento, gli acidi possono assumere strutture bidimensionali o tridimensionali.

"Dogma centrale"

È un’ipotesi fatta appena chiarito che il DNA contiene l’informazione genetica.