Biologia Molecolare

DNA

4. Terminazione della trascrizione

Nella fase 1 l’RNA polimerasi avvia il processo di trascrizione legandosi ad una regione speciale, il promotore. I promotori sono

solitamente in prossimità del 5’ (negli eucarioti a volte potrebbero essere all’interno). La prima base che viene copiata è il +1. Questa

base +1 non coincide con l’AUG (ossia la proteina vera e propria), ma in genere è una regione non codificante. Una volta riconosciuto

il sito di inizio e la polimerasi è partita, la polimerasi si lega al promotore e comincia la trascrizione dal +1 fino alla sequenza di

unità di trascrizione:

terminazione. Questa sequenza che va dal +1 alla fine del terminatore viene chiamata questa è scritta nel DNA e

non è altro che l’informazione genica. Questa unità trascrizionale nei procarioti è definita policistronica poiché più geni sono

contenuti nello stesso trascritto. Negli eucarioti l’unità trascrizionale è invece monocistronica, ossia vi è un’unica sequenza

codificante. Solitamente, dunque, abbiamo l’informazione di un solo gene con qualche eccezione. Le eccezioni sono riferite ai geni di

classe I che sono le eccezioni all’unità monocistronica. Gli elementi policistronici nel DNA vengono chiamati anche ‘operoni’.

C’è un solo promotore che regola l’unità trascrizionale. E’ policistronica

poiché abbiamo una sequenza codificante 1 fatta a sua volta da gene 1,

gene 2 e gene 3. Queste tre diverse sequenze (geni) sono accomunate, ossia

partecipano alla stessa via metabolica. Quindi non sono geni

completamente diversi con funzioni completamente diverse.

Questi operoni dei procarioti possono essere puri quando i geni sono tutti

dello stesso tipo (immagine B) oppure misti (ad esempio nell’immagine C

abbiamo unità ribosomiali per 16S e per tRNA, sono quindi coinvolti più

tipi di RNA: ciò significa operoni misti).

RNA POLIMERASI PROCARIOTICA

Parliamo quindi di RNA polimerasi dei batteri, in particolare E. Coli.

α, β, β’, σ, ω. α α

Abbiamo un complesso formato da più proteine: Abbiamo due coppie di (α e ). Queste proteine, quando tutte

1 2

oloenzima.

insieme, prendono il nome di

Ruolo delle diverse subunità dell’RNA polimerasi di E. coli

- β: interviene nella formazione del legame con i ribonucleosidi trifosfati durante l’inizio e l’allungamento.

β.

Quindi l’agente polimerasica è affidata alla subunità

- α : sono responsabili dell’assemblaggio del complesso. Contengono 2 domini: il dominio carbossi-terminale

2

si lega ad una zona del promotore, quindi prende contatto con il DNA (vi è interazione tra elementi in cis,

ossia sequenze del DNA; gli elementi in trans sono invece le proteine che interagiscono con il DNA); il

dominio N-terminale è responsabile delle interazioni con le altre subunità della proteina stessa (RNA

polimerasi).

- β’: ha un’affinità generale per il DNA, dovuta in gran parte all’attrazione elettrostatica tra la proteina basica e

l’acido nucleico. Grazie a questa subunità, le RNA polimerasi di cui abbiamo molte copie nei procarioti si

legano in maniera aspecifica al DNA, ossia trovano un posto a cui legarsi poiché c’è attrazione tra la parte

basica della proteina e il DNA. Non si legano a livello del promotore ma in un punto qualsiasi del DNA,

quindi in maniera aspecifica.

- ω: promuove e mantiene stabile il complesso (non è una subunità fondamentale).

- σ: consente il riconoscimento del promotore.

α β’ ω

Il core della proteina è formato da , e quando l’RNA polimerasi è legato in maniera aspecifica al DNA

2 σ,

e quando, quindi, non c’è ancora trascrizione. Quando subentra questa permette il riconoscimento del

promotore e quindi consente alla RNA polimerasi oloenzima di poter cominciare la trascrizione dal suo +1.

Questa trascrizione infatti non può perdere informazioni, quindi deve per forza partire da +1 per essere precisa e partire da +1.

Modello a chela di granchio dell’RNA polimerasi

Possiamo notare che c’è la proteina e che c’è il filamento che sporge nella chela; il DNA ad un

certo punto si è denaturato e diventa aperto. Il DNA forma quindi la bolla di trascrizione, la

quale indica una regione di DNA aperta. Possiamo notare inoltre l’RNA che si forma. C’è inoltre

una regione in cui RNA e DNA sono attaccati, formando un ibrido.

RICONOSCIMENTO DELLO STAMPO σ.

La RNA polimerasi riconosce il promotore ad opera del fattore I promotori sono sequenze di RNA che servono per l’aggancio

dell’RNA polimerasi affinché questa possa iniziare la trascrizione nel punto corretto, ossia nel +1.

I promotori sono caratterizzati da BOX, ossia sequenze conservate (sono sempre le

stesse nei procarioti e negli eucarioti).

Nei procarioti possiamo avere tre tipi di box:

- Pribnow box TATA box

E’ la box più frequente, ossia quella vicino al +1, ed ha una sequenza a -10 formata

da 6-7 coppie di basi. Contiene una sequenza consenso TATAAT dove T è costante in

dominio di svolgimento del promotore.

tutti i promotori. Viene definita Svolgimento

significa che in questa regione avviene l’apertura della doppia elica di DNA per

cominciare la trascrizione; è infatti ricca di TA, ossia quelle basi che consentono più

facilmente l’apertura.

- Sequenza a -35

Contiene una sequenza di circa 9 nucleotidi che si mantiene più o meno costante

dominio di riconoscimento del promotore.

nei diversi promotori. Viene definita

- Elemento UP

Esistono poi dei promotori che, oltre al dominio di riconoscimento e quello di svolgimento, hanno un elemento UP. L’elemento UP

modula e aiuta ulteriormente la trascrizione genica; è il promotore meno sottile.

Questi sono i tre tipi di elementi (box) che sono presenti nei promotori. In base alla presenza di questi elementi nei promotori, si

distinguono tre tipi di promotori:

1. Promotore con -35 e -10

2. Promotore con elemento UP, -35 e -10

3. Promotore con -10 Interazione tra RNA polimerasi e promotore

σ

Il è il promotore più frequente.

70 σ σ σ

Nell’immagine il si lega con -10 mentre si lega a -35. E’ quindi il che determina

2 4

l’interazione tra RNA polimerasi e il promotore; la parte carbossi-terminale prende infatti

contatto con il promotore.

L’RNA polimerasi contatta inizialmente la sequenza -35 poiché abbiamo il dominio di

riconoscimento; in questo modo si forma un complesso chiuso. Nel momento in cui la

RNA polimerasi prende contatto con la regione -10, il complesso da chiuso diventa

aperto poiché a -10 abbiamo il dominio di svolgimento. Aprendosi la doppia elica, si

forma la bolla di trascrizione. σ

La bolla di trascrizione è grande 25 coppie di basi. Quando c’è la bolla, significa che ha

2

contattato il dominio di svolgimento; ciò significa che il filamento viola è lo stampo. In alto vi

deve essere il 3’ poiché dobbiamo rispettare l’antiparallelismo (nel segmento ibrido abbiamo

5’-3’, quindi in quello in alto ci deve essere l’opposto).

Il DNA ha formato un angolo retto poiché quando il DNA entra nella RNA polimerasi subisce

una curvatura. Sullo sfondo del disegno vi è RNA polimerasi. Per come è fatta la DNA

polimerasi e i legami avuti a -35 e a -10, il DNA riesce ad aprirsi in una determinata regione in

cui si forma la bolla. timone,

Nella RNA polimerasi c’è una zona chiamata in corrispondenza della bolla. Poi

muro ponte.

abbiamo una parte che accoglie il DNA chiamata e poi c’è un

Tra il ponte e il muro vi è un imbuto; dall’imbuto entrano i nucleotidi, ossia i mattoni del

polimero. In corrispondenza del muro si forma l’RNA.

Quando si forma l’ibrido RNA-DNA, la forma assunta dalla molecola ibrida è la forma A. Ha

quindi le caratteristiche della forma A della doppia elica.

C’è inoltre un foro di entrata per i nucleotidi e un foro di uscita per il filamento di RNA che si

sta formando: man mano che l’RNA si allunga prima ha un tratto a doppio filamento e poi

continua a singolo filamento. Da sopra il foro di uscita esce il DNA non più aperto.

Al contrario della bolla di replicazione che si allarga e poi continua allungandosi sempre di più, la bolla di trascrizione rimane sempre

costante. Abbiamo sempre un tratto che varia di volta in volta di 25 bp.

L’inizio della trascrizione è difficoltoso, si parla infatti di inizio abortivo. All’inizio i nucleotidi vengono messi e tolti fino al

raggiungimento di 9 nucleotidi. Superati i 9 nucleotidi, l’inizio è terminato. L’inizio è dunque il momento più lento della trascrizione.

Mentre compie la trascrizione, l’RNA polimerasi determina una tensione

torsionale. Si creano cioè dei superavvolgimenti a monte e a valle della bolla di

trascrizione. Questi saranno negativi al 5’ e positivi a valle della 3’. Quindi ogni

10 nucleotidi trascritti di genera un avvolgimento positivo davanti e uno negativo

dietro. Questi superavvolgimenti danno fastidio alla trascrizione, infatti vengono

rimossi dalle topoisomerasi. Esiste una topoisomerasi specifica per i

superavvolgimenti positivi e un’altra specifica per quelli negativi.

La velocità di sintesi nella trascrizione è di 50 nucleotidi al secondo a 37° (per l’E. coli), molto più lenta di quella di replicazione del

DNA. Il tempo necessario alla polimerasi per lasciare il promotore è almeno di 1-2 secondi garantendo così ad un’altra polimerasi di

avviare nuovamente l’inizio della trascrizione. β’ σ

Le polimerasi stanno tutte attaccate al DNA tramite il in maniera aspecifica; quando arriva che ha lasciato un’altra polimerasi

rivanno sul promotore e continuano a lavorare contemporaneamente più polimerasi. σ

La terminazione dell’inizio significa che il fattore si è distaccato

dall’oloenzima e l’RNA polimerasi ha lasciato il promotore. La RNA

σ; σ

polimerasi è diventata core e non ha più il il va a prendere

un’altra polimerasi e ricomincia la trascrizione. Immaginiamo

quindi che possono lavorare contemporaneamente sullo stesso

stampo più RNA polimerasi. Nei procarioti, man mano che l’RNA,

se l’RNA è messaggero e quindi contiene informazioni per le

proteine, verrà copiato, verrà subito processato e e avverrà subito la

sintesi delle proteine. Questo non avviene negli eucarioti p