Biologia Molecolare

Biologia molecolare

DNA: dalla scoperta alla manipolazione

• Scoperta
• Struttura
• Progetto genoma: organizzazione
• Applicazioni delle biotecnologie
• Manipolazione

Scoperta

Griffith - 1929: esperimento con pneumococchi e identificazione del fattore trasformante come DNA

Hershey Chase:

• 1952: esperimento con batteriofagi fatto dai biologi e il DNA è responsabile della trasmissione ereditaria
• 1950: studi di diffrazione dei raggi X su microcristalli di DNA, importanti informazioni sulla struttura ad elica

Watson Crick - 1953: forniscono il modello spaziale di questa importante molecola. Nasce così la biologia molecolare.

Il DNA contiene le informazioni genetiche. Inizialmente non era chiaro se l’informazione genetica fosse contenuta nel DNA o nelle proteine, entrambi componenti dei cromosomi. L’opinione prevalente era che il DNA avesse un ruolo strutturale, le proteine informazionale. Questo perché il DNA sembrava una molecola troppo semplice. Da qui iniziarono gli esperimenti di genetica batterica.

Esperimenti di Griffith

Il primo scienziato che approfondì gli studi fu Griffith, il quale fece esperimenti sugli pneumococchi. I pneumococchi possono avere ceppi che formano colonie R (rugose) o colonie S (liscio). Il ceppo rugoso R non contiene la capsula polisaccaridica che è responsabile dell'infezione, mentre il ceppo liscio S la contiene e rappresenta dunque strutture più grandi.

L’esperimento consisteva nell’infettare topi con i due diversi ceppi. Il topo, dopo l’iniezione di cocchi R, stava bene (il ceppo R infatti non è virulento). Quando al topo veniva iniettato il ceppo S, virulento, il topo moriva di polmonite. Poi Griffith iniettò entrambi i ceppi, R non virulento ed S ucciso dal calore, e questo portò alla morte del topo: il ceppo S era stato annientato dal calore, dunque ci si spettava che il topo vivesse, in realtà il DNA che trasportava i geni delle cellule virulenti, uccise al calore, trasformava le cellule batteriche non virulente rendendole quindi letali per il topo. Ci doveva essere qualcosa che trasformava il ceppo R da non virulento a virulento: il principio trasformante era il DNA.

Bomba di Avery

Partendo da un ceppo di pneumococchi lisci e virulenti, Avery e collaboratori fecero un estratto cellulare che era in grado di trasformare pneumococchi del ceppo R ruvido benigno in S liscio e virulento. In seguito purificarono le diverse componenti molecolari dell’estratto (proteine, DNA, lipidi ecc.). Solo il DNA era in grado di operare la trasformazione, dimostrando che il DNA è il principio trasformante. In tutte le provette vengono inseriti pneumococchi ruvidi non virulenti. Solo quando metto DNA ricavo colonie S: dimostrazione che il DNA è il principio trasformante.

Esperimento di Hershey e Chase

Esperimento di (esp. del frullatore): vede come protagonisti il batterio e il virus. Il virus è formato da acido nucleico (il quale ha fosforo) e proteine (le quali hanno azoto): sono le proteine o il DNA responsabile del carattere ereditario?

Per capire chi fosse responsabile del carattere ereditario, gli scienziati presero una popolazione di fagi con fosforo-32 (32p) che marcava l’acido nucleico e un’altra popolazione con zolfo-35 che marcava le proteine. Acido nucleico e proteine erano quindi marcate da isotopi radioattivi (frullano i radioisotopi con DNA e proteine).

Poi Hershey e Chase separarono i fagi neoformati (quelli marcati) dai due terreni di coltura e, separatamente, li utilizzarono per infettare altre due colture di virus, in questo caso cresciute su terreni "standard" privi di isotopi radioattivi.

• Nel caso in cui i fagi infettanti avessero il DNA marcato, in seguito all'infezione gran parte della radioattività veniva misurata all'interno delle cellule batteriche colpite (e nel DNA di una parte dei nuovi fagi sviluppatisi in seguito a questa infezione) — la radioattività era sul fondo della provetta all'esterno
• Nel caso in cui i fagi infettanti avessero il rivestimento proteico marcato, la radioattività veniva misurata solamente delle cellule batteriche colpite (e non era presente sul rivestimento proteico dei nuovi fagi sviluppatisi in seguito a questa infezione) — la radioattività era sul sopranatante

Il processo utilizzato per determinare se la radioattività provenisse dall'interno o dall'esterno delle cellule fu il seguente: dopo un certo tempo dall'inizio dell'infezione, il terreno di coltura veniva posto in un omogeneizzatore. La conseguente agitazione provocava il distacco del rivestimento proteico dei virus dalla membrana cellulare.

Il tutto veniva poi centrifugato: la parte cellulare (contenente eventualmente il DNA marcato) rimaneva sul fondo della provetta, mentre i rivestimenti proteici distaccati dalle membrane cellulari rimanevano in sospensione. A seconda di dove si misurava la maggiore radioattività era possibile dedurre se la molecola marcata si trovasse o meno all'interno della cellula.

Dal momento che il fago per replicarsi ha bisogno di introdurre all'interno della cellula ospite il suo materiale genetico per poter sfruttare l'apparato batterico di replicazione del DNA, appare evidente che questo materiale genetico deve per forza essere il DNA poiché, come dimostrato, le proteine non entrano nella cellula colpita mentre il DNA sì (ciò che era entrato nella cellula era materiale ereditario; dentro al batterio era infatti entrato il 32p). La cellula ospite si mette a disposizione del nuovo entrato, il DNA del virus, il quale distrugge la cellula.

Infatti si creano tante copie di DNA, tante copie di proteine della testa e tante copie di proteine della coda tramite replicazione, una volta che ho tutto il materiale (materiale ereditato e materiale proteico) avviene l’impacchettamento e si ricostituiscono le particelle virali; il batterio scoppia e avviene la lisi cellulare, ovvero scoppia l’infezione che distrugge la cellula. Ciò che è carattere, dunque, è scritto nell’acido nucleico, nel DNA (è qui che vi è eredità).

Struttura

Il DNA è un polimero di nucleotidi (ovvero tanti nucleotidi che sono monomeri degli acidi nucleici; il mattone fondamentale è quindi il nucleotide). Ogni nucleotide è composto da:

• Gruppo fosfato
• Zucchero
• Base azotata

Zucchero

• Zuccheri pentosi (5 atomi di C; da 1’ a 5’):
• Deossiriboso: zucchero penstoso del DNA, in posizione 2’ ha un H
• Ribosio: zucchero pentoso del RNA che ha, rispetto al deossiribosio, un atomo di O in più

Lo zucchero lega la base in 1’ e il fosfato in 5’: fa da ponte, è in posizione centrale.

Basi

Le basi possono essere:

• Purine: costituite da due anelli eterociclici — adenina e guanina, più grandi
  • Adenina: azoto 9 lega C 1’ dello zucchero, caratterizzata dalla forma amminica
  • Guanina: caratterizzata dalla forma chetonica, in 3 ha un gruppo amminico, l’azoto 9 lega il deossiribosio in 1’
• Pirimidine: DNA, costituite da un solo anello eterociclico — citosina e timina, più piccole
  • Citosina: gruppo amminico in 4, O in 2, l’azoto 1 lega il deossiribosio
  • Timina: in 5 ha un gruppo metilico CH₃, che è assente nell’uracile (che è la base azotata del RNA al posto della timina)
  • Uracile: è l’altra pirimidina contenuta nel RNA, al posto della timina (al contrario della timina, l’uracile non ha CH₃)

Se prendiamo uno zucchero e lo uniamo ad una base formo un nucleoside. Se aggiungiamo un fosfato abbiamo un nucleotide. Nomenclatura del nucleotide (si basa sul nucleoside e sul numero di fosfato -mono, di, tri- ):

• Deossiguanosina mono/di/tri fosfato
• Deossiadenosina mono/di/tri fosfato
• Deossicitidina mono/di/tri fosfato
• Deossitimidina mono/di/tri fosfato

Singola elica del DNA Come vengono insieme i nucleotidi? È necessario il 3’ OH (si parla quindi di uno zucchero), il quale si deve unire con il 5’ fosfato del nucleotide adiacente: in questo modo si forma un legame fosfodiestere con eliminazione di molecole di acqua. I nucleotidi sono nella forma monofosfato quando si forma la catena di acido nucleico. L’allungamento avviene sempre nella direzione di sintesi 5’-3’. Allunghiamo sempre il 3’ OH.

Regole di Chargaff

• Il contenuto in nucleotidi pirimidinici (C+T) è sempre uguale al contenuto in nucleotidi purinici (A+G).
• Il contenuto in C è sempre uguale al contenuto in G; così come il contenuto in A è sempre uguale al contenuto in T. Al contrario il contenuto in A+T non è necessariamente uguale al contenuto in G+C.

Chargaff scoprì che se si studiano organismi diversi, il contenuto delle basi cambia. In organismi uguali il contenuto di basi rimane lo stesso. Inoltre scoprì che il contenuto delle citosine è sempre uguale a quello delle guanine, quello delle adenine è sempre uguale a quello delle timine.

Struttura del DNA

Il DNA è fatto da due filamenti (catene polinucleotidiche) a doppia elica che decorrono in maniera antiparallela (posizione 3’ e 5’); ciò fu scoperto da Watson e Crick nel 1953. Il diametro della doppia elica è di 20 Angstroms (10 Å = 1 nm). La doppia elica è destrogira o destrorsa. Il DNA è paragonabile ad una scala a chiocciola (i gradini sono le basi azotate; sono gradini instabili poiché nel mezzo di ogni gradino c’è una sorta di taglio, ossia i legami idrogeno che uniscono le due basi). Le basi, essendo idrofobiche, si posizionano all’interno della doppia elica per respingere l’acqua.

Tra A e T vi sono due legami H, tra G e C vi sono 3 legami H; quindi vi è maggiore forza tra G e C rispetto ai legami tra A e T. Un giro di doppia elica contiene 10 coppie di base (3,4 x 10 = 34 Angstroms) ed ogni giro è fatto da un solco minore e uno maggiore. Questi due solchi (minor e major groove) sono importanti poiché quando le proteine si legano al DNA vi devono essere degli interruttori molecolari che regolano le interazioni; su questi solchi avvengono proprio le interazioni con le proteine. Al livello del solco maggiore avvengono le interazioni principali, qui infatti vengono alloggiate le α-elica.proteine ad

Le forze che intervengono sulla stabilità della doppia elica sono:

• Interazioni idrofobiche (stabilizzano)
• Forze di Van der Waals (stabilizzano)
• Legami idrogeno (stabilizzano)
• Interazioni elettrostatiche (destabilizzano) dovute alla carica negativa dei gruppi fosfato e che modificano le interazioni all’interno dello stesso filamento e tra i due filamenti; tali repulsioni possono essere neutralizzate con delle cariche positive (es.: ioni Na⁺ o proteine).

La forma a doppia elica di Watson e Crick è conosciuta anche come forma B del DNA. La forma B è quella che prevale nel nostro organismo ed è quella più idratata. La doppia elica ha avvolgimento destrorso ed è paragonabile ad una scala a chiocciola: gli assi portanti sono costituiti da zuccheri e fosfato, mentre dentini sono invece le basi azotate. Sullo stesso piano troviamo A e T, su un altro C e G. Queste si legano mediante legami H: 2 legami tra A e T e 3 legami tra C e G. Questi legami vengono rotti quando il DNA va a incontro a processi ad esempio di replicazione o trascrizione. Se vogliamo fare in vitro il processo di rottura, dobbiamo somministrare calore: in questo modo andiamo incontro a denaturazione dell’elica, la quale si apre come una cerniera.

Forme di DNA

Nel nostro organismo troviamo la forma B, ossia quella idratata. Esistono altre forme di DNA non B:

• Forma A
• Forma Z
• Forma a tripla elica
• Forma tetraplex
• Forma cruciforme

Forma B

Parametri della forma B:

• Diametro
• Numero basi
• Passo (giro) dell’elica

La forma B è quella più idratata. La struttura presenta una doppia elica destrorsa, ossia le catene antiparallele sono destrorse. Presenta inoltre due scanalature, una minore e una maggiore. Ha uno scheletro covalente di unità deossiribosio e gruppi fosforici, i quali sono all’esterno. Nella parte interna dell’elica vi sono invece le basi. Le coppie di basi planari sono legate da legami H (A-T, G-C) e sono perpendicolari all’asse dell’elica: vi è quindi un appaiamento complementare delle basi.

Il passo dell’elica è di 34 Å, il diametro è di 20 Å, mentre il diametro delle basi è di 3,4 Å. Il numero di basi per giro è 10.

Forme non-B nel DNA

Forma A

Il numero di basi per giro è circa 11: c’è una base in più rispetto alla forma B che ne aveva 10. Presenta anch’essa un solco minore e un solco maggiore, di cui il solco minore è poco profondo. La forma A si può trovare durante il processo di trascrizione, in particolare quando si formano gli ibridi DNA e RNA. Inoltre il singolo filamento di RNA (l’RNA è formato, infatti, da un singolo filamento) si ripiega su se stesso e talvolta può dare origine alla forma A che si forma al posto della forma B poiché in posizione 2’(quindi nel ribosio) l’RNA possiede un O in più rispetto al desossiribosio; la presenza dell’O crea un ingombro sterico che non può determinare l’origine della forma B ma può determinare quella della forma A. Dunque possiamo trovare la forma A più frequentemente:

• In presenza di ibridi di DNA e RNA
• Nel ripiegamento su se stesso del singolo ripiegamento del RNA

In condizioni di deidratazione, possiamo notare un cambio conformazionale reversibile del DNA B: la forma A, rispetto alla B, è più larga e meno profonda. L’elica è destrorsa, il passo dell’elica è di 28 Å, il diametro è di 23 Å, il diametro delle basi è 2.9 Å. Il numero di basi per giro è di 11.6. I piani delle basi sono ruotate di 33° rispetto all’asse dell’elica.

Forma Z

Rispetto alla forma presa di riferimento (B) possiamo notare che la forma Z è più sottile, allungata e stretta, dunque avrà un diametro più piccolo e un numero di basi per giro dell’elica maggiore. Inoltre il tipo di avvolgimento è opposto alle forme A e B, poiché nella forma Z l’avvolgimento è sinistrorso. Il giro dell’elica è di 46 Å, il diametro è di 18 Å (è infatti la forma più stretta). Il diametro tra le basi è di 7.4 Å e il numero di basi per giro d’elica è 12. Ha una stretta e profonda scanalatura minore (nella forma A, invece, era poco profonda) e una scanalatura maggiore poco profonda, dove si forma la conformazione Z poiché si trova in regioni in cui si alternano purine e pirimidine. Le pirimidine (basi a singolo anello) rimangono nella posizione classica nel loro legame con lo zucchero (ossia nella formazione anti), mentre le purine sono invertite in posizione sin. Nella forma B abbiamo una conformazione classica, canonica, del nucleotide (in questo caso nucleoside poiché non c’è legato il fosfato). Nella forma Z, invece, il legame nucleosidico si sposta in un altro piano, ovvero le purine ruotano in posizione sin rispetto al loro legame con lo zucchero. Quando avviene questa rotazione delle purine, potrebbe molto probabilmente originarsi la forma Z. La conformazione Z non è frequente nelle cellule degli organismi eucariotici e procarioti, tuttavia la forma Z si potrebbe originare tra due doppie eliche che hanno il DNA affine. Ciò avviene durante la trascrizione (quando la doppia elica si apre per copiare l’RNA, avvengono cambiamenti conformazionali da cui si può originare questo tipo di forma) oppure in geni (ossia in regioni) alterati e quindi coinvolti nella malattia di Alzheimer. Si va quindi a modulare il prodotto del gene. Normalmente, fisiologicamente, questa forma non dovremmo averla, tuttavia in casi patologici viene osservata. Si assume la conformazione Z ad alta concentrazione di sali: il sale stabilizza la struttura Z riducendo la repulsione elettrostatica fra i gruppi fosfato dei filamenti opposti (nell’elica Z sono più vicini rispetto all’elica B: 8 Å vs 12 Å). Più frequentemente si originano forme Z quando ci sono sequenze che vedono alternanza di G e C (di cui la guanina è la purina e la citosina è la pirimidina) o anche metilcitosina. Si origina quindi anche durante la trascrizione, quando il complesso dell'RNA polimerasi si lega al DNA e quindi le due eliche si aprono srotolandosi, generando superavvolgimenti negativi. In alcuni geni specifici la formazione di DNA-Z è correlata con la loro espressione o repressione, in quanto è presente spesso nei promotori di alcuni di essi. La formazione di DNA-Z altera l’organizzazione nucleosomica della cromatina e annulla i legami con le proteine contemplati nella forma B.

Tripla elica del DNA

È un’altra forma non B, chiamata a tripla elica, che si trova nei tratti in cui vi è alternanza di purine (sull’elica complementare ovviamente vi sarà alternanza di pirimidine). Dunque, laddove c’è un tratto ricco in alternanza di purine o pirimidine, si può formare un terzo filamento a livello del solco maggiore del DNA. Dunque al filamento di purine corrispondono due basi complementari: quella canonica e quella che non ci aspettavamo che fosse.