Biologia dello sviluppo vegetale - Riassunto completo

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Sviluppo: insieme dei processi che dalla cellula uovo fecondata portano alla formazione di un individuo, con

tutte le caratteristiche della specie a cui appartiene.

Lo sviluppo comincia dalla formazione dello zigote

Tutte le cellule di un organismo pluricellulare sono identiche dal punto di vista genetico: si differenziano per

l’espressione > durante lo sviluppo si attuano dei meccanismi che portano al differenziamento dei tessuti.

Negli animali questo processo avviene durante lo sviluppo embrionale: al termine di esso l’animale

presenta quasi tutti i tessuti dell’animale adulto.

Nelle piante questo avviene soprattutto nello sviluppo post-embrionale

A livello embrionale sono già impostati i piani di sviluppo che verranno attuati nella fase post-embrionale.

FASI DELLO SVILUPPO:

 Aumento del numero delle cellule per divisioni cellulari successive

 Differenziamento delle cellule: ogni cellula, pur avendo lo stesso genotipo, acquisisce

caratteristiche specifiche > acquisizione di un’identità cellulare > formazione dei tessuti specializzati

 Organogenesi: formazione degli organi e loro sviluppo

Problematiche della biologia dello sviluppo:

→ Il differenziamento: poiché ogni cellula dell’organismo presenta lo stesso genotipo, come può

questa serie di istruzioni genetiche produrre differenti tipi di cellule

→ La morfogenesi e l’organogenesi: come possono le cellule formare strutture ordinate

→ L’accrescimento: come fanno le cellule a sapere quando smettere di dividersi

→ L’interazione con l’ambiente: come viene regolata l’interazione con fattori ambientali?

L’aumento del numero di cellule è estremamente complesso negli organismi pluricellulari: negli unicellulari

l’aumento del numero cellulare va a formare delle colonie circolari (in quanto tutte le cellule si dividono

tutte alla stessa velocita e allo stesso modo) mentre nei pluricellulari si va a formare un organismo con

forme complesse e ben definite > ogni cellula ha una ben precisa velocità di divisione e un numero di

divisioni a cui deve andare incontro.

Le cellule vanno a formare dei tessuti e degli organi: gli organi devono trovarsi nel posto giusto e avere

delle posizioni specifiche.

Una grossa differenza tra le piante e gli animali è che lo sviluppo avviene principalmente nella fase

embrionale: nella fase successiva si hanno principalmente degli aumenti di dimensioni > lo sviluppo negli

animali si arresta con il raggiungimento della maturità sessuale > SVILUPPO A CRESCITA DETERMINATA

Nelle piante questo non avviene grazie alla presenza di alcune caratteristiche genetiche delle cellule

staminali > SVILUPPO A CRESCITA INDETERMINATA; lo sviluppo, soprattutto in senso di organogenesi,

avviene principalmente nella fase post-embrionali

I fattori ambientali impattano sullo sviluppo tanto nelle piante che negli animali: ad esempio esistono una

serie di geni regolati dall’orologio circadiano

Lo sviluppo si studia a partire da un sistema modello

Un organismo modello è di piccole dimensioni, ha un ciclo vitale breve, è economico, ha una progenie

numerosa, c’è disponibilità di mutanti o sono facili da ottenere, è facile da manipolare e presenta un

genoma di piccole dimensioni e possibilmente sequenziato.

Nelle piante i due organismi modello sono Arabidopsis per le dicotiledoni e il riso per le monocotiledoni.

Il numero di geni non è correlato alla complessità dell’organismo.

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Per comprendere i meccanismi genetico-molecolari è necessario lo studio dei mutanti.

Supponiamo che il nostro interesse sia quello di studiare i meccanismi genetico molecolari che regolano lo

sviluppo del fiore: si va a fare un confronto tra una pianta con fiore wild type e delle piante con fiori con

alterazioni.

In natura il numero di mutanti disponibili non è soddisfacente per studia i processi di biologia dello

sviluppo; i mutanti, inoltre, hanno una fitness molto bassa e, quindi, difficilmente sopravvivono in natura.

Sono stati sviluppati dei processi per ottenere un maggior numero di piante mutanti: mutagenesi indotta.

Tra le principali tecniche di mutagenesi si ricorda

 EMS mutagenesi: mutagenesi chimica indotta da etil-metan-sulfonato che induce cambiamenti di

base nel DNA. Si trattano i semi, che contengono l’embrione, con EMS e si fanno germinare > la

maggior parte delle mutazioni sono recessive e, quindi, bisogna effettuare una autofecondazione

per osservare delle mutazioni

La mutazione non porta sempre a una funzione genetica compromessa, ha una maggiore variabilità

nelle mutazioni e un maggior numero di mutazioni in ogni individuo; inoltre sono difficili da clonare

 Inserzione di TDNA o elementi trasponibili

Agrobacterium tumefaciens: penetra a livello di una ferita della pianta e inserisce il proprio

genoma> questo provoca divisioni cellulari incontrollate (tumori).

Nel batterio si trova un plasmide detto Plasmide Ti (tumor inducing): sono i geni ospitati in questo

plasmide a provocare l’insorgenza del tumore. I geni si trovano sul plasmide tra due zone definite

LB e RB (left e right border). Il batterio è stato ingegnerizzato modificando la regione tra left e right

border con DNA sintetico: in questo modo non contiene più i geni del tumore ma i geni che si

vogliono inserire nelle cellule mutate.

Se si mettono a contatto i gameti con il batteri alcuni verranno infettati e l’embrione avrà i geni

dell’inserzione.

Tra LB e RB vengono inoltre inseriti dei geni reporter come, ad esempio, geni da resistenza agli

antibiotici o geni che conferiscono fluorescenza.

Il TNDA si inserisce casualmente nel genoma e, quindi, in alcuni casi, può inserirsi in regioni

codificanti e provocare delle mutazioni più o meno importanti: questo avviene anche perché il

TDNA si inserisce preferenzialmente in regioni trascritte in quanto queste sono più facilmente

accessibili.

Le mutazioni sono solitamente mutazioni KO, si ha minore variabilità nelle mutazioni e minori

mutazioni in ogni individuo, inoltre i geni sono facili da clonare se mutati

Una volta operata la mutazione si va incontro all’analisi dei mutanti

ANALISI MORFOLOGICA: si osserva la morfologia delle piante wild type rispetto alle piante mutate.

Solitamente si usano tecniche sia macroscopiche che microscopiche.

Ad esempio se studiamo i petali wild type e nel mutante agamous si osserva che i petali si sviluppano al

posto di foglie, sepali, carpello: il mutante non può generare gameti e quindi in natura non potrebbe

sopravvivere

ANALISI GENETICA: si studiano le mutazioni genetiche; si isola il gene e si studia se la mutazione è

dominante o recessiva. In caso di mutazione di TDNA è facile trovare quale gene sia mutato in quanto è

marcato; con altre tecniche è più complesso trovare il mutante.

Il gene va isolato: forward genetic > isolamento genico da mutante

Bisogna caratterizzare il gene isolato in modo da capire dove viene espresso: si può fare mediante

ibridazione in situ o mediante geni reporter (i principali geni reporter sono GUS e GFP).

Grazie al gene reporter si può studiare sia dove viene trascritto il gene sia dove viene espresso: in alcuni

casi la proteina viene prodotta e poi trasportata in altre cellule

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Ibridazione in situ: si vuole studiare l’espressione genica di un dato gene.

Si fissa in paraffina il fiore, si taglia con microtomo in fette da 7μm > si ibrida con RNA antisenso in modo

che vada a legarsi con l’mRNA messaggero.

Nell’RNA antisenso si trovano residui di ossigenina che sono facilmente riconoscibili mediante un substrato

adatto > in questo modo è possibile trovare dove era espresso l’mRNA complementare a quello della sonda

e, quindi, capire dove era espresso

Tutte le piante terrestri presentano un ciclo apo-diplonte > le due forme pluricellulari che si alternano nel

ciclo vitale sono:

 SPOROFITO: è un organismo pluricellulare diploide che produce le spore aploidi mediante meiosi

 GAMETOFITO: le spore in seguito alla meiosi danno origine ad un organismo pluricellulare apolide

che darà origine ai gameti mediante mitosi

Il gametofito maschile delle angiosperme di sviluppa a partire delle cellule madre delle microspore: le

cellule madre vanno incontro a meiosi e danno origine alle spore > le spore vanno incontro a mitosi,

formando un gametofito costituito da due cellule spermatiche e una cellula vegetativa

Il gametofito femminile si forma a partire dalla cellula madre delle macrospore che va incontro a meiosi > 3

delle 4 spore femminili degenerano > il gametofito si forma per mitosi ed è costituito da una cellula uovo,

da una cellula vegetativa centrale (diploide per endomitosi) e da altre cellule

Le due cellule spermatiche maschili vanno a fecondare la cellula uovo (forma lo zigote, 2n) e la cellula

centrale (forma la cellula prima dell’endosperma, 3n) >> DOPPIA FECONDAZIONE

Alla fine dello sviluppo, il seme sarà formato da embrione (una copia del patrimonio genetico materno e

paterno MF), un endosperma (MFF) e (FF)

Endosperma: tessuto contenete sostanze di riserva che si sviluppa dall’unione del nucleo maschile con i

nuclei polari della cellula centrale del sacco embrionale > viene digerito dall’embrione in accrescimento

prima o dopo la germinazione del seme

Tutte le cellule che si formano dallo zigote, essendosi formate per mitosi, hanno tutte lo stesso patrimonio

genetico > l’accrescimento delle cellule deve essere coordinato sia come numero di divisioni sia come

espressione genica.

STADI DI SVILUPPO DELL’EMBRIONE: fase di morfogenesi > l’embrione assume una forma precisa in base

alla specie e le cellule un’identità specifica in base alla posizione.

I. Fase 1, MORFOGENESI: la prima fase prevede una divisione asimmetrica: lo zigote, nella maggior

parte delle specie di piante, si allunga e si polarizza lungo l’asse apicobasale immediatamente dopo

la sua formazione (con polarizzazione si intende la distribuzione asimmetrica degli organuli interni).

La parte apicale presenta un citoplasma denso ed è sede di intensa sintesi proteica; la parte basale

contiene il vacuolo centrale.

A causa della polarizzazione, dopo la mitosi si vanno a costituire due cellule strutturalmente diverse

in quanto i determinanti sono distribuiti asimmetricamente> le due cellule andranno incontro a

processi differenti in quanto la cellula apicale andrà a formare l’embrione mentre la cellula basale

andrà a dare origine al sospensore e all’ipofisi (gruppo di cellule che si trova alla base

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dell’embrione).

A seguito di questa prima divisione si forma lo STADIO A DUE CELLULE

Successivamente viene stabilito l’asse longitudinale che darà origine al corpo primario della pianta,

si sviluppano i cotiledoni e si determina il differenziamento radiale dei tessuti

II. Fase 2: MATURAZIONE: l’embrione accumula sostaze di riserva che serviranno per supportare la

germinazione e a crescita della giovane plantula nella sua fase eterotrofa

III. Fase 3 DISIDRATAZIONE: è caratterizzata da processi biochimici e fisiologici che permettono

all’embrione di entrare in un periodo di dormienza

IV. Fase 4 GERMINAZIONE: iniziano di nuovo i processi di crescita e morfogenesi

Già nella fase a 4 e 8 cellule si avrà un differenziamento dell’espressione genica tra le cellule apicali e basali

(successive alla cellula apicale) e cellule dell’ipofisi (successive alla cellula basale)

Divisione di tutte le cellule dell’ottante: strato più esterno (protoderma), che si dividerà anticiclicamente e

darà origine ai primi tessuti embrionali tra cui il protoderma > stadio a 16 cellule.

Si andranno poi a verificare delle divisioni che porteranno alla formazione dello stadio globulare: in questa

fase si sviluppano internamente le cellule del procambio che daranno origine al tessuto vascolare

Lo stadio globulare si sviluppa nello stadio di transizione a triangolo> da questo stadio si svilupperà lo

stadio a cuore in cui si sviluppano i primi organi (i cotiledoni) > dallo stadio a cuore si svilupperà lo stadio a

torpedo (in cui sono ben definiti i cotiledoni e i meristemi apicale e basale)

DEFINIZIONE DEL PATTERN APICO-BASALE E TRASVERSALE: la forma dell’embrione è il risultato della

sovrapposizone di due programmi di sviluppo o patterns: uno lungo l’asse longitudinale e uno lungo l’asse

radiale > vengono attivati set di geni differenti a seconda della posizione.

Lungo l’asse longitudinale si specificano la posizione e l’identità dei due meristemi (RAM e SAM), degli

organi (radice, ipocotile, cotiledoni) e assunzione di bilateralità

Lungo l’asse radiale si specificano la posizione e l’identità degli elementi del pattern radiale (protoderma,

meristema fondamentale e procambio)

Oltre allo sviluppo dell’embrione sono ben coordinati anche lo sviluppo dell’endosperma (inizialmente solo

alla periferia e, solo successivamente, riempie il seme)

ESEMPI DI FORWARD GENETICS per lo studio della biologia delo sviluppo

Si prendono dei semi di Arabidopsis che presentassero delle mutazioni nello sviluppo: invece che verdi e

rigonfi erano biancastri e flosci > questi semi abortivano e degeneravano.

Si studia lo sviluppo di questi semi per capire in quale fase avvenissero le mutazioni: si trovano dei mutanti

che, invece di avere lo stadio a due cellule costituito da due cellule completamente diverse, avevano una

mutazione che portava alla formazione di due cellule piccole, corte e molto simili > i mutanti YODA (1 e 2,

due mutazioni sullo stesso allele) presentano una prima divisone che è quasi simmetrica > solo raramente

questi embrioni riescono a germinare.

Si verifica se la mutazione YODA è una mutazione dominante o recessiva mediante reincroci > la mutazione

yoda è una mutazione recessiva.

YODA codifica per una proteina simile alla proteina Ste11p del lievito: nel lievito è una MAPKK chinasi

necessaria per la divisione asimmetrica di Saccaromyces. Sono stati identificati 3 mutanti con fenotipo

simile a yoda: una MAPKK chinasi (YODA), una MAPK chinasi (MAPK6) e una MAP chinasi (GRD) > queste tre

chinasi si fosforilano a vicenda lungo il pathway di segnalazione necessario per la polarizzazione dello

zigote.

APPROCCI DI REVERSE GENETICS: si caratterizzano dei geni specifici che si ritenogono imporanti per un

determinato processo di sviluppo mediante mutagenesi indotta >> si caratterizza poi il fenotipo ottenuto.

Un grosso contributo per identificare geni importanti per lo sviluppo è stato dato dal professor Thomas

Laox che si è focalizzato sulla caratterizzazione della funzione di una famiglia di fattori trascrizionali

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chiamata WOX >> questi fattori hanno in comune lo stesso dominio di legame al DNA che è caratteristico

della superfamiglia homeobox.

Il numero di questi fattori trascrizionali in Arabidopsis è di 14: il nome WOX deriva dal fatto che sono molto

simili al primo fattore identificato di questa famiglia che prende il nome di WUS (WOX= WUS homeobox).

Per caratterizzare la funzione di un gene, la prima cosa da fare è studiare l’espressione di un gene >> si è

studiata l’espressione di WOX mediante ibridazione in situ e medianti geni reporter:

 IBRIDAZIONE IN SITU, esempi: si è verificato che WOX2 viene espressa nello zigote e, dopo la prima

divisione, solo nella cellula apicale; WOX9, al contrario, non è espressa nello zigote ma, dopo la

prima divisione, viene espressa unicamente nella cellula basale > nell’embrione si verica che è

espressa unicamente nell’ipofisi e non nel sospensore >> nelle fasi successiva è espresso solo in

alcune cellule basali dell’embrione; WOX8 ha un’espressione simile a

WOX9 ma viene espressa anche nelle cellule del sospensore >>> da

questa analisi è chiaramente deducibile che l’embrione, già dalle prime

fasi di sviluppo, è costituito da cellule differenziate in quanto esprimono

geni differenti.

 GENI REPORTER: la regione genomica di WOX è stata clonata a monte

della Yellow-FP (YFP); nello zigote si nota che WOX8 viene espresso nello

zigote e che, negli stadi successivi, viene localizzato esclusivamente nel

sospensore e nell’ipofisi >> viene confermato ciò che è stato trovato

mediante ibridazione in situ

Il vantaggio di utilizzare i geni reporter sta nel fatto che, a differenza dell’ibridazione in situ (in cui si

cerca il mRNA diffuso nel citoplasma della cellula), in questo caso si va a formare una proteina

ricombianante che verrà trattata esattamente come la proteina di partenza >> si riesce a studiare

anche la localizzazione cellulare (si verifica la presenza di WOX solo all’interno del nucleo)

Si verifica come l’espressione di geni regolatori marca specifiche cellule che, quindi, acquisiscono un

destino specifico.

Dopo la prima divisione mitotica si ha l’espressione di una serie di geni che vanno di pari passo con

l’aumento del numero e il differenziamento delle cellule.

L’embrione ha due assi di sviluppo: lo sviluppo lungo l’asse di apico-basale porta al differenziamento dei

due cotiledoni e dell’embrione; lo sviluppo lungo l’asse trasversale porta al differenziamento del

procambio, dei meristemi e del protoderma.

Analisi funzionale dei geni WOX

Si selezionano linee di mutanti dei geni di interesse:

 MUTANTE wox2: già nelle prime fasi di sviluppo dell’embrione presenta un fenotipo alterato

rispetto a wt > le divisioni mitotiche intervengono nella formazione dell’embrione sono alterate.

Questi difetti si accumulano lungo lo sviluppo embrionale e portano alla formazione di una

struttura che è molto dissimile all’embrione wt: questi embrioni sono parzialmente non in grado di

sviluppare un individuo nella fase post-embrionale

 MUTANTI WOX8 e WOX9: si studiano con un approccio di reverse genetics > si studia il fenotipo

delle piante con mutazioni nei geni. Mutanti con