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- Caratteristiche che rendono il riso una buona specie modello per lo studio di monocotiledoni:

 è di dimensioni relativamente piccole (la pianta adulta può raggiungere 1-1,5 m)

 ha ciclo vitale breve (12 settimane da seme a seme)

 si autofeconda

 ogni singola pianta produce decine di semi

 ha rilevanza economica

 il genoma diploide di 430-460 Mb (relativamente piccolo) è stato sequenziato (2002)

o poiché il sequenziamento è stato condotto indipendentemente da un laboratorio asiatico e

uno americano, è presente una doppia serie di annotazioni diverse sul genoma

o la variabilità genetica tra le diverse varietà di riso è molto alta (“sottospecie” indica e

japonica)

 è trasformabile (passando per colture in vitro) ma è un protocollo lungo

- Dal 2005 in poi si assiste a un incremento esponenziale del numero di genomi vegetali sequenziati, con

genomi di dimensioni crescenti, grazie all’evoluzione delle tecniche di sequenziamento (next e next next

generation sequencing techniques) accompagnata dalla progressiva riduzione del costo del

sequenziamento per Mb (costi accessibili per i piccoli laboratori)

- Il concetto di specie modello, a fronte di queste implementazioni tecnologiche, perde di importanza: la

definizione delle specie modello è applicabile oggi a molte specie

Studio dei mutanti

- Nello studio della funzione e espressione genica, alla base dello sviluppo vegetale, è informativo

effettuare un paragone tra un individuo wild type (WT) normale e uno mutato a sviluppo/fenotipo alterato

(per definire i processi molecolari di un gene funzionante rispetto alla sua versione mutata e gli effetti della

sua espressione nell’organismo)

- Per poter utilizzare i mutanti come strumento di indagine molecolare è necessario:

1. ottenere i mutanti

a. poiché il tasso di mutagenesi spontanea è basso si ricorre a meccanismi di mutagenesi

indotta

2. caratterizzare i mutanti

a. caratterizzazione morfologica

b. caratterizzazione genetica

c. caratterizzazione molecolare

Ottenimento dei mutanti

- Per ottenere la popolazione di mutanti necessaria è necessario a ricorrere a dei meccanismi di mutagenesi

indotta in quanto la frequenza/tasso di mutazioni spontanee è molto bassa

- Meccanismi di mutagenesi utilizzati per isolare nuovi mutanti comprendono:

 metodi fisici (radiazioni ionizzanti)

o raggi X (rotture cromosomiche)

o raggi UV (dimeri covalenti di timina)

 metodi chimici (mutageni)

o EMS (agente alchilante generante mutazioni puntiformi)

 il trattamento con EMS produce nel genoma mediamente 1000-1500 polimorfismi

 inserzione

o trasformazione con Agrobacterium tumefaciens con produzione di piante cis- o trans-

geniche

 Agrobacterium tumefaciens è un batterio ubiquitario del suolo che infetta alcune

specie vegetali inducendo tumori (tumore del colletto) attraverso il trasferimento e

l’integrazione di parte del proprio genoma (T-DNA del T plasmid) in quello delle

i

cellule vegetali (CFR biotecnologie vegetali)

 il plasmide T di Agrobacterium è stato ingegnerizzato per funzionare come una

i

siringa molecolare che consente l’inserzione di sequenze di DNA d’interesse

(incluse nella porzione di T-DNA compresa tra R e L borders) nel genoma di un

organismo vegetale

 l’inserzione del T-DNA:

o a livello genomico è casuale

o a livello cromosomico privilegia le regioni trascritte

o a livello del gene è casuale

 poiché il T-DNA è inserito casualmente nel genoma (in un basso numero di copie

(1-4) per cellula), come conseguenza può:

 bloccare l’espressione di un gene se si inserisce in un esone

 non alterare il gene se si inserisce in un suo introne

 alterare l’espressione di un gene se si inserisce nel suo promotore

 portare all’espressione di un gene trasferito (con promotore) se è inserito

in una zona eucromatinica perché il T-DNA può veicolare qualsiasi

sequenza di DNA e qualsiasi tipo di informazione codificabile

geneticamente

o CFR golden rice (betacarotene, provitamina A); pomodoro nero che

sovraproduce antociani; papaya con la resistenza al virus del

mosaico

 poiché il T-DNA è a sequenza nota è possibile rintracciarlo con una sonda

complementare per saggiare se è avvenuta l’inserzione, il sito d’inserimento, quale

gene è stato inattivato in seguito all’inserzione, numero di copie di inserimento, …

 la mutazione, essendo un’integrazione all’interno di un genoma, è

stabile/ereditabile dalla progenie

 poliploidizzazione con colchicina

 genome editing

o utile quando si voglia modificare un gene d’interesse perché indirizzabile precisamente su

una sequenza genomica prescelta

Trasformazione di Arabidopsis con Agrobacterium

- Arabidopsis è facilmente e velocemente (2 mesi per ottenere progenie transgenica rispetto a minimo 1

anno per altre specie) trasformabile attraverso il protocollo del floral dip

- Il floral dip si basa sull’utilizzo di piante in fioritura che vengono fisicamente immerse in una soluzione di

Agrobacterium

- Agrobacterium infetta casualmente delle cellule di Arabidopsis

- Perché la tecnica sia efficace (il transgene sia ereditabile dalla progenie) deve avvenire la trasformazione

del gametofito femminile (che avviene con una frequenza del 1-5%), che produce la linea germinale

- Quindi si prelevano e coltivano i semi prodotti dalle piante trasformate

- Attraverso marcatori di selezione (precedentemente inseriti nel T-DNA) si effettua lo screening della

progenie per identificare le plantule trasformate da quelle WT

- Il marcatore di selezione più comunemente utilizzato è un gene che conferisce una resistenza a un

antibiotico: solo le piante che hanno ereditato il T-DNA contenente la resistenza sopravvivono alla crescita

su un terreno di coltura artificiale in cui è stato aggiunto l’antibiotico

Differenze tra mutagenesi chimica e per inserzione

EMS: Trasformazione:

 

Funzione genica non sempre abolita Funzione genica KO

 

Maggior variabilità nelle mutazioni Minor variabilità nelle mutazioni

 

Maggiori mutazioni in ogni individuo Minori mutazioni in ogni individuo

 

Gene difficile da clonare se mutato Gene facile da clonare se mutato

Genetica diretta e inversa

- I mutanti sono utilizzati nella ricerca con due approcci diversi:

 forward genetics: dalla selezione di un fenotipo di interesse in una popolazione di piante

mutagenizzate risale al gene responsabile

o approach of determining the genetic basis responsible for a phenotype

o seeks to find the genetic basis of a phenotype or trait

 reverse genetics: a partire da un gene di interesse si analizzano i fenotipi degli individui mutati

per quel solo gene

o approach to discover the function of a gene by analyzing the phenotypic effects of

specific engineered gene sequenze

o seeks to find what phenotypes arise as a result of particular genetic sequences

- Con il sequenziamento e risequenziamento dei genomi si possono costruire delle collezioni di linee di

mutanti per ogni gene di interesse disponibili per gli studi di reverse genetics

Analisi e caratterizzazione dei mutanti

D: Quali strumenti molecolari si possono utilizzare per osservare la distribuzione di IAA? (reporter

pDR5::GFP e pPIN1::PIN1-GFP)

- I mutanti sono caratterizzati tramite analisi che si avvalgono di strumenti di diverso tipo:

 analisi morfologica

o consente una descrizione del mutante

 macroscopica per osservazione diretta

 microscopica attraverso l’uso di microscopi

 microscopia ottica

 microscopia elettronica

 analisi genetica

o consente l’isolamento del gene che mutato origina il fenotipo di interesse (localizzazione)

o consente l’analisi delle interazioni genetiche (epistasi)

o consente l’analisi dell’espressione genica (spazialmente, temporalmente, regolazioni)

 attraverso l’ibridazione in situ (FISH)

 attraverso l’uso di geni reporter transgenici (anche per visualizzare l’attività del

promotore)

 GUS

 GFP

 DR5

 analisi molecolare

o studio delle molecole/proteine che determinano il tratto di interesse

 two hybrid system

 modificazioni post-traduzionali

 cristallizazione dei complessi

FISH

- È una tecnica citogenetica che può essere utilizzata per rilevare e localizzare la presenza o l'assenza di

specifiche sequenze di DNA

- L’ibridazione in situ è estendibile a qualsiasi bersaglio molecolare grazie all’uso di sonde opportune

GUS

- La tecnica è basata su un saggio istochimico

- Il gene reporter GUS codifica per la β-glucoronidasi la quale degrada un substrato incolore (X-Gluc o 5-

bromo-4-cloro-3-indol glucoronide) che ossidato produce un precipitato insolubile blu

- Attraverso il costrutto promotore-del-gene-di-interesse::GUS è possibile visualizzare in quali tessuti è

attivato il promotore e quindi dedurre il profilo di espressione del gene

GFP

- La tecnica è basata sulla visualizzazione al microscopio della fluorescenza emessa dalla proteina GFP

- Il gene reporter GFP codifica per una proteina fluorescente isolata dal celenterato Aequorea victoria

- Attraverso il costrutto promotore-del-gene-di-interesse::GFP è possibile visualizzare in quali tessuti è

attivato il promotore e quindi dedurre il profilo di espressione del gene

- Attraverso il costrutto promotore-del-gene-di-interesse::proteina-codificata-GFP è possibile visualizzare la

destinazione cellulare del prodotto genico

DR5

- DR5 è un promotore indotto dalla presenza di auxina

- Piante trasformate con il costrutto pDR5::GFP sono fluorescenti nelle cellule permeate da un’alta

concentrazione di auxina

Y2H

- La tecnica consente di analizzare l’interazione tra due proteine qualsiasi utilizzando il sistema inducibile

Gal4

- Il sistema è costituito da un promotore inducibile dal fattore di trascrizione GAL4, composto da un binding

domain (che lega le upstream activation sequences del promotore) e un activation domain (sensibile al

galattosio, che induce l’attività della RNApol), e il gene LACZ associato codificante per la β-galattosidasi

- L’interazione tra due proteine X e Y è dimostrabile producendo proteine chimere ADY e BDX e fornendo il

un substrato per la β-GAL che da incolore diventa blu dopo l’azione enzimatica: se le due proteine

interagiscono, il fattore di trascrizione GAL4 ricomposto attiva la trascrizione di LACZ colorando la colonia di

lieviti

Sviluppo embrionale di dicotiledone (Arabidopsis)

- Le spermatofite basano la propagazione della specie sulla produzione di semi contenenti embrioni

disidratati, che dopo il rilascio dalla pianta madre rimangono dormienti fino all’instaurarsi delle condizioni

favorevoli alla germinazione

- Lo sviluppo embrionale è solo la costituzione di un abbozzo di pianta ma è fondamentale nello stabilire i

piani di sviluppo dell’organismo (posizionamento di tessuti che guidano lo sviluppo post-embrionale;

abbozzo della forma)

- La maggior parte degli eventi differenziativi e morfogenetici nelle piante superiori avvengono

continuamente nella fase post-embrionica adulta del ciclo vitale

- Sistemi di organi vegetativi differenziano continuamente dalle regioni meristematiche del fusto e della

radice

- Gli organi riproduttivi si differenziano dal meristema apicale del germoglio riprogrammato alla

maturazione della pianta

- L’embriogenesi nelle piante interessa principalmente lo stabilimento dei pattern corporei basilari shoot-

root e radiale, oltre che l’accumulo di riserve alimentari che saranno usate dal germinello/plantula in

germinazione dopo il periodo di dormienza embrionale nel seme

- L’embrione maturo di una pianta fanerogama è costituito da un asse e dai cotiledoni, organi che hanno

distinti destini di sviluppo ma che sono formati da tre strati di tessuti primordiali di base organizzati

radialmente: protoderma (precursore dell’epidermide), meristema fondamentale (precursore del

parenchima), procambio (precursore dei tessuti vascolari)

- L’asse (regione ipocotile-radichetta) contiene il RAM e il SAM

- I cotiledoni sono strutture differenziate che accumulano le sostanze di riserva utilizzate in fase di

germinazione

- L’accrescimento differenziale e l’acquisizione di una forma dipendono dalla frequenza e dall’orientamento

dei piani di divisione mitotica

- Dal punto di vista morfologico, la struttura dell’embrione è il risultato della sovrapposizione di due

programmi/pattern di sviluppo:

 lungo l’asse apico-basale/longitudinale: apice della radice / radichetta embrionale / ipocotile-asse

embrionale / cotiledoni separati dall’apice del germoglio su cui si formano le bozze fogliari

 lungo l’asse radiale: protoderma / meristema fondamentale / procambio

- La cellula uovo è contenuta nell’ovulo, struttura pluricellulare seppellita sotto diversi strati cellulari del

pistillo, sede della formazione dell’uovo, della fertilizzazione e dell’embriogenesi

- La generazione aploide/gametofitica inizia subito dopo la meiosi di cellule specializzate del fiore con le

spore che vanno incontro a mitosi e differenziano in grani pollinici (gametofito maschile), contenenti due

cellule spermatiche, o nel sacco embrionale (gametofito femminile), contenente una singola cellula uovo

- La generazione diploide/sporofitica inizia dopo la fecondazione con lo zigote e prevede la formazione della

pianta matura con organi vegetativi (foglie, meristemi, radici, …) e riproduttivi (antere e pistilli dei fiori)

- L’embriogenesi delle piante superiori prevede in definitiva:

a) la specificazione dei meristemi

b) la costituzione del pattern corporeo shoot-root

c) il differenziamento dei tessuti primari

d) la formazione dei cotiledoni come organi di riserva essenziali per la germinazione

e) l’ingresso dell’embrione maturo in una fase di dormienza fino all’instaurarsi delle condizioni idonee

per il supporto dello sviluppo post-embrionico

- Da un punto di vista descrittivo l’embriogenesi vegetale può essere suddivisa in tre fasi in cui avvengono

specifici eventi morfo-fisiologici:

1) fase post-fecondazione / pro-embrionale

o differenziamento cellulare terminale e basale

o formazione del sospensore e dell’embrione

 stadio zigotico

 stadio a ottante

2) fase di transizione da stadio globulare a stadio a cuore

o differenziamento dei primordi dei principali tipi di tessuto

o stabilimento dell’asse radiale

o acquisizione della simmetria bilaterale

o manifestazione dell’asse apico-basale

o formazione dei cotiledoni

o sviluppo dell’asse ipocotile-radichetta

o differenziamento del meristema radicale

 stadio dermatogenico

 stadio globulare precoce

 stadio globulare tardivo

 stadio di transizione

 stadio a cuore

3) fase di espansione degli organi e maturazione

o allungamento dei cotiledoni e dell’asse per divisone e allungamento cellulare

o differenziamento del meristema apicale

o accumulo di corpi lipidici e proteici

o disidratazione

o inibizione della germinazione precoce

o dormienza

 stadio a torpedine

 stadio cotiledonare

EMBRIOGENESI

- Embriogenesi: eventi morfogenetici finalizzati alla definizione del piano di organizzazione complessivo

(assi longitudinale e radiale) del corpo della pianta

1. fecondazione della cellula uovo contenuta nel sacco embrionale dell’ovulo (che comporta due

eventi nelle piante a fiore)

a. i granuli pollinici, rilasciati per deiscenza dell’antera, quando raggiungono e contattano le

papille stimmatiche, si idratato e germinano formando il tubetto pollinico (lunga

estroflessione)

b. la cellula vegetativa migra nel tubetto pollinico seguita dalla cellula generativa che si divide

formando due cellule spermatiche, poi la cellula vegetativa degenera a dare il

microgametofito maturo (granulo pollinico germinato con il nucleo del tubetto più i due

nuclei spermatici)

c. nel tubetto le cellule spermatiche si muovono fino a raggiungere l’ovocellula dove avviene

la doppia fecondazione: un nucleo spermatico si unisce al gamete femminile (cellula uovo

polarizzata contenuta nel sacco embrionale dell’ovulo) formando lo zigote (prima cellula

diploide dell’organismo), l’altro si fonde con i nuclei polari (cellula centrale) formando il

nucleo dell’endosperma primario (tessuto triploide a funzione trofica per l’embrione

d. la fecondazione induce l’ovulo (contenente l’embrione e l’endosperma) a svilupparsi in un

seme mentre l’ovaio differenzia in un frutto

2. morfogenesi: durante questa fase viene stabilito il piano di organizzazione complessiva del corpo,

attraverso l’assunzione di una precisa polarità e la formazione dei due organi principali ai due poli

opposti: SAM e RAM; viene stabilito l’asse longitudinale che darà origine al corpo primario della

pianta, e si formano i cotiledoni, foglie modificate che hanno la funzione di supportare le prime fasi

di vita eterotrofa della plantula; si differenziano i primi tessuti secondo uno schema di sviluppo

(pattern) radiale

a. stadio zigotico: lo zigote è una cellula diploide allungata polarizzata (con contenuto

distribuito asimmetricamente: vacuolo basale/micropilare e nucleo apicale)

i. crescita polarizzata dello zigote che si allunga lungo il futuro asse

micropilo/calaza (fino a 3 volte la sua originale dimensione) per cui la

parte apicale contiene nucleo e citoplasma denso, sede di un’intensa

sintesi proteica, e la parte basale contiene il vacuolo

ii. divisione trasversale (perpendicolare all’asse maggiore dello zigote)

asimmetrica dello zigote in due cellule figlie con destino differenziativo

diverso che determina l’asse longitudinale polarizzato dell’embrione

1. una cellula embrionale apicale piccola (polo

superiore/calazale) che formerà l’intero embrione (eccetto la

sua estremità più basale)

2. una cellula basale allungata (polo inferiore/micropilare) che

per divisioni orizzontali/trasversali (perpendicolari all’asse

principale) formerà una fila di 7-9 cellule di cui tutte, ad

eccezione della prima (cfr. ipofisi), costituiranno il sospensore

extra-embrionale (peduncolo/filamento che ancora l’embrione

al micropilo attraverso cui è passato il tubetto pollinico e lo

connette al sistema vascolare della pianta madre)

i. WOX2 e 8 sono espressi dallo zigote

ii. la cellula apicale esprime WOX2

iii. la cellula basale esprime WOX8 e WOX9

iv. PIN7 è localizzata esclusivamente sul lato apicale della

cellula basale, consentendo la canalizzazione di auxina alla

cellula apicale

v. l’auxina è accumulata nella cellula apicale

b. stadio a ottante

i. due rapide divisioni longitudinali rispetto all’asse micropilo-calaza,

perpendicolari tra loro, partizionano l’originario volume della cellula

apicale originando 4 cellule figlie della stessa dimensione

ii. divisione trasversale (asimmetrica) rispetto all’asse micropilo-calaza

delle 4 cellule figlie a dare 4 cellule superiori e 4 inferiori (leggermente

ma significativamente maggiori in volume): un embrione globulare a 8

cellule a simmetria radiale

1. i trascritti dei geni WOX2, WOX8, WOX9 sono distribuiti in 4

zone operando una segmentazione molecolare che precede la

segmentazione fisica in zone con differente destino di sviluppo

2. PIN1 è localizzata in maniera polarizzata

3. PIN7 è localizzata nella porzione apicale delle cellule del

sospensore e dell’ipofisi

4. l’auxina è principalmente accumulata nelle cellule

dell’embrione propriamente detto (esclusa da ipofisi e

sospensore)

c. stadio a 16 cellule/dermatogenico

i. divisione periclinale (parallela alla superficie dell’embrione) /

tangenziale (asimmetrica) delle 8 cellule a dare una massa globulare da

16 cellule con 8 esterne (dal volume quasi doppio, determinanti la

formazione del protoderma, precursore dell’epidermide) e 8

interne/centrali (originanti i tessuti fondamentali)

1. sono coinvolti i geni WOX (2, 1, 3, 8) e MONOPTEROS

2. la formazione del protoderma è accompagnata dallo

stabilimento di domini di espressione complementari dei geni

WOX (prima co-espressi, ora confinati al solo protoderma o alle

cellule interne)

3. PIN7 è localizzata nella porzione apicale delle cellule del

sospensore e dell’ipofisi

d. stadio globulare precoce

i. sia l’orientamento dei piani di divisione che l’asimmetria volumetrica

sono molto regolari nella metà inferiore dell’embrione mentre sono

meno rigorose nella metà superiore

ii. divisione anticlinale (perpendicolare alla superficie dell’embrione)

delle 8 cellule esterne per estendere lo strato cellulare esterno

iii. divisione longitudinale (parallele all’asse maggiore) delle cellule

interne

1. le 4 cellule basali dividendosi formano cellule più esterne di

volume maggiore (precursori dei tessuti fondamentali esterni)

e cellule interne più sottili (del procambio, precursori degli

elementi della vascolatura interna)

iv. contemporanea specificazione della cellula più apicale del sospensore

in ipofisi seguita dalla sua divisione trasversale asimmetrica a formare

una piccola cellula superiore a forma di lente (lens shaped cell

precursore del centro quiescente del RAM) e una cellula basale di

maggiori dimensioni (precursore delle cellule staminali distali del RAM

e della columella)

1. PIN1 è fortemente polarizzata, localizzata esclusivamente sul

lato basale delle cellule interne della porzione inferiore

dell’embrione

2. PIN7 è localizzato nella parte apicale delle cellule del

sospensore e intorno alla lens shaped cell

3. PIN7 subisce un’inversione di distribuzione alla porzione basale

delle cellule del sospensore

4. l’auxina è accumulata nell’ipofisi e in poche cellule superiori del

sospensore subendo un’inversione dalla parte apicale

dell’embrione alla parte basale

5. in un anello periferico della porzione superiore dell’embrione,

vengono espressi i geni CUC1, CUC2 e STM

e. stadio globulare tardivo

i. divisione anticlinale delle cellule del protoderma

ii. divisioni longitudinali e trasversali della massa interna

1. l’auxina è sintetizzata nella zona centrale superiore

dell’embrione

2. l’auxina si trova a maggiori concentrazioni nell’ipofisi e in

poche cellule superiori del sospensore

3. CUC1 e CUC2 sono espressi in una striscia mediana di cellule

dell’embrione localizzata tra i due futuri cotiledoni conferendo

una simmetria molecolare bilaterale all’embrione

morfologicamente a simmetria radiale

f. stadio di transizione

i. Specificazione dei cotiledoni da due domini laterali dell’apice

embrionale e proliferazione più veloce delle cellule

ii. Distensione della regione assiale dell’ipocotile

1. l’auxina è canalizzata dalle PIN1 e si concentra all’apice degli

abbozzi dei cotiledoni permettendo il passaggio dalla

simmetria radiale per acquisire la simmetria bilaterale

2. l’auxina si trova a maggiori concentrazioni nell’ipofisi e in

poche cellule superiori del sospensore

g. stadio a cuore

i. divisioni asimmetriche, tassi di divisione, di espansione e piani di

divisione differenziati guidano i processi morfogenetici di formazione

dei primi abbozzi dei cotiledoni

1. l’auxina si trova a maggiori concentrazioni nell’ipofisi e in

poche cellule superiori del sospensore

2. compaiono altre zone ad alta concentrazione di auxina all’apice

dei cotiledoni e nel tessuto provascolare

3. il dominio di espressione di CUC1 e CUC2 è complementare a

quello di STM che è limitato a una zona centrale della porzione

apicale dell’embrione

h. stadio a torpedine

i. divisioni e espansioni cellulari determinano la crescita dei cotiledoni e

dell’ipocotile (che iniziano ad accumulare sostanze di riserva)

ii. senescenza del sospensore

iii. definizione completa dei cotiledoni, di SAM e RAM, protoderma,

meristema e procambio

1. dopo l’organizzazione del centro quiescente, il picco di auxina

si sposta alle sottostanti cellule della columella (dove permarrà

per il resto della vita della pianta)

2. compaiono altre zone ad alta concentrazione di auxina all’apice

dei cotiledoni e nel tessuto provascolare

i. stadio cotiledonare

i. accrescimento dell’embrione fino alle dimensioni massime

MATURAZIONE

2. maturazione: l’embrione accumula sostanze di riserva che serviranno per supportare la

germinazione e la crescita della giovane plantula nella sua fase eterotrofa; durante questa fase la

germinazione precoce deve essere inibita

a. stadio maturo: l’embrione maturo contiene gli elementi necessari per sostenere le

successive fasi di crescita post-embrionale:

i. apici meristematici

ii. procambio (lungo l’asse maggiore implicato nella produzione dei

tessuti del sistema vascolare

iii. cotiledoni (con funzione di riserva o fotosintetica)

3. disidratazione: è caratterizzata da processi biochimici e fisiologici che permettono all’embrione di

entrare in un periodo di dormienza/quiescenza

4. (germinazione): riprendono i processi di crescita e morfogenesi della plantula (è finita la fase di

embriogenesi)

Auxina

- L’auxina è un ormone vegetale che agisce sulle cellule inducendo la curvatura fototropica

- Il modello chemiosmotico per il trasporto polare dell’auxina propone che l’ingresso nella cellula di auxina

sia guidato da una forza proton-motrice mentre l’efflusso di auxina sia guidato da un potenziale di

membrana

- La differenza di pH tra citosol (circa 7) e parete cellulare (circa 5) è mantenuta da ATPasi sulla membrana

cellulare che pompano protoni verso la parete

- L’auxina (pK = 4,75) quando si trova nell’apoplasto è in forma protonata/neutra, è in grado di

a

attraversare la membrana cellulare passivamente per entrare nella cellula

- L’auxina quando si trova nel citoplasma è in forma deprotonata/carica, non è in grado di attraversare

passivamente la membrana

- L’efflusso polarizzato di auxina è mediato dalla localizzazione specifica di carriers: PIN

- Accumuli di auxina promuovono la crescita del tessuto

- L’auxina è il principale morfogeno durante l’embriogenesi vegetale in quanto conferisce informazione

posizionale alle cellule, agendo direttamente sul loro piano di sviluppo, mediante un gradiente di

concentrazione stabile (e la risposta delle cellule al gradiente dipende dalla concentrazione)

- Il gradiente si forma grazie alla distribuzione dei carriers PIN per l’auxina

- Disturbi nel movimento dell’auxina causano difetti nello sviluppo embrionale

- Per studiare il flusso di auxina nella pianta, l’effetto delle proteine PIN sul movimento di auxina e l’effetto

finale sullo sviluppo si utilizzano varie tecniche e costrutti tra cui il gene reporter DR5, che consente di

individuare le cellule in cui si ha accumulo di auxina, e il gene reporter PIN1-GFP

- Attraverso la trasformazione con il costrutto DR5::GFP (DR5 è un promotore sintetico auxina-indicibile e la

GFP agisce da reporter) è possibile seguire in vivo il processo di distribuzione dell’auxina nell’embrione in

via di sviluppo la cui distribuzione risulta asimmetrica fin dalle prime fasi di sviluppo

- Allo stadio di proembrione l’auxina è principalmente accumulata nella cellula apicale

- Allo stadio a ottante l’auxina è principalmente accumulata nelle cellule dell’embrione propriamente detto

(esclusa da ipofisi e sospensore)

- Allo stadio globulare medio (32 cellule) l’auxina è accumulata nell’ipofisi e in poche cellule superiori del

sospensore subendo un’inversione dalla parte apicale dell’embrione alla parte basale

- A partire dallo stadio globulare tardivo l’auxina è sintetizzata nella zona centrale superiore dell’embrione

- Durante il successivo sviluppo embrionale l’auxina si trova a maggiori concentrazioni nell’ipofisi e in poche

cellule superiori del sospensore

- Le cellule derivate dalla divisione dell’ipofisi continuano a mantenere alte concentrazioni di auxina

- Allo stadio di torpedine, dopo l’organizzazione del centro quiescente, il picco di auxina si sposta alle

sottostanti cellule della columella (dove permarrà per il resto della vita della pianta) e compaiono altre

zone ad alta concentrazione di auxina all’apice dei cotiledoni e nel tessuto provascolare

- La distribuzione dell’auxina durante l’embriogenesi dipende principalmente dai trasportatori di auxina

PIN1 e PIN7 come dimostrato dallo studio di mutanti gnom e pin

- Nella transizione dallo stadio globulare allo stadio triangolare e a cuore, l’auxina è canalizzata dalle PIN1 e

si concentra all’apice degli abbozzi dei cotiledoni permettendo il passaggio dalla simmetria radiale a quella

bilaterale

- Mutanti in geni che hanno un ruolo nel trasporto dell’auxina o in altri aspetti connessi con le sue funzioni

ormonali (monopteros, pin, gnom, …) mostrano difetti nell’instaurarsi della simmetria bilaterale suggerendo

che l’auxina abbia effettivamente un ruolo importante in questo processo

- Interferendo con il gradiente di auxina tramite esposizione a auxina sintetica o brefeldina A (inibitore del

flusso auxinico) si dimostra inoltre l’incapacità dell’embrione di stabilire la simmetria apico-basale

- AUXIN SIGNALING COMPONENTS: componenti molecolari della trasduzione del segnale auxina

TIR1/AFB

1. SCF ubiquitin ligase complex (recettore)

 TIR1/AFB è un componente del complesso che agisce come recettore per l’auxina e collega

direttamente la presenza di auxina alla degradazione dei repressori trascrizionali per i geni

promossi dall’ormone

 SCF è un complesso E3 ubiquitina ligasi multiproteico che catalizza l’ubiquitinizzazione di

proteine destinate alla degradazione proteasomiale

 TIR1, AXR6

2. Aux/IAA inhibitor proteins

 Aux/IAA sono repressori trascrizionali che legano ARF impedendo la trascrizione dei geni

sotto il controllo di AuxRE (sequenze genomiche)

 BODENLOS

3. DNA-binding AUXIN RESPONSE FACTORs (ARF)

 Le ARF sono proteine che riconoscono e si legano alle AuxRE sul DNA

 MONOPTEROS

4. Auxin

- L’auxina permette il legame di SCF-TIR1 al repressore AUX/IAA con conseguente degradazione del

repressore risultante nell’attivazione (ARFs) dell’espressione di geni sensibili a auxina

- Riassunto:

 Un gradiente apico-basale di auxina guida lo sviluppo embrionale e determina la forma

dell’embrione

 Il gradiente auxinico è formato (e mantenuto) dal trasporto dell’ormone mediato da carriers di

efflusso (PINs)

 Disturbando la formazione del gradiente (ad es. attraverso mutazione nei geni PIN, inibizione

chimica del trasporto di auxina o sovradosaggio di auxina) lo sviluppo dell’embrione è alterato

 Accumuli localizzati di auxina determinano i pattern di divisione e distensione cellulare

 L’auxina funziona influenzando l’espressione genica, in particolare di geni che definiamo

collettivamente della crescita

 L’auxina non agisce direttamente sul promotore dei geni

 Alte concentrazioni di auxina sono necessarie per degradare un repressore che blocca la

trascrizione

 Nello sviluppo la distribuzione di IAA varia:

o nelle prime divisioni IAA è soprattutto apicale

o dallo stadio globulare la IAA è accumulata nell’ipofisi e nella prima cellula del sospensore

(corrisponde all’inizio dello sviluppo di RAM)

o allo stadio di transizione la IAA è chiaramente localizzata al putativo RAM

o dallo stadio torpedine anche i due apici di cotiledoni sintetizzano IAA assieme all’apice

radicale stabilendo anche un accenno di vascolatura

- Auxina e sviluppo:

 un gradiente apico-basale di IAA guida lo sviluppo embrionale e ne determina la forma

 il gradiente di IAA è formato e mantenuto da PIN

 alterazione del gradiente altera lo sviluppo embrionale

 IAA causa, in base alla concentrazione, l’allungamento o la proliferazione cellulare

 accumuli localizzati di IAA determinano i pattern di divisione e distensione cellulare

 IAA influenza l’espressione genica in particolare i geni della crescita

 IAA non agisce direttamente sul promotore

 alte concentrazioni di IAA sono necessarie per degradare un repressore della trascrizione

Modello AXR6-MP-BDL

In assenza di auxina

- MONOPTEROS è un fattore di trascrizione ARF in grado di riconoscere e legare sequenze AuxRE (auxin

response elements) nei promotori dei geni di cui controlla l’espressione

- BODENLOS è una proteina repressore che interagisce con MONOPTEROS, bloccandone l’attività di

induttore trascrizionale

- TIR1 in assenza di auxina non è in grado di interagire con BODENLOS

- Di conseguenza i geni regolatori della crescita attivati dall’auxina non sono espressi

In presenza di auxina

- TIR1 lega l’auxina

- TIR1-IAA interagisce con BODENLOS mediandone il rilascio da MONOPTEROS

- MONOPTEROS, legato alla AuxRE, può attivare la trascrizione del gene regolatore della crescita in

presenza di auxina

Meristemi

D: Cosa sono i meristemi?

D: Quando si formano i meristemi?

D: Organizzazione dei meristemi e loro mantenimento

D: Cellule staminali e loro mantenimento

D: Sviluppo degli organi a partire dai meristemi

- Nel corso dello sviluppo embrionale si stabilisce precocemente la polarità longitudinale, seguita dalla

comparsa delle regioni meristematiche apicali caulinare e radicale

- Questi meristemi non contribuiscono significativamente allo sviluppo embrionale stesso ma sono

determinanti per gli stadi post-embrionali che per questo sono oggetto di analisi nella biologia dello

sviluppo

- La crescita indefinita delle piante è possibile per la presenza di gruppi di cellule iniziali, attive per tutta la

vita dell’organismo, localizzate e organizzate nei meristemi

- Le regioni meristematiche sono zone ad attiva crescita con cellule in divisione

- I meristemi sono le popolazioni cellulari organizzate nelle quali la divisione avviene in modo ordinato

originando uno specifico modello di distribuzione di cellule e tessuti

- Le cellule meristematiche sono quelle che mostrano attività proliferativa e sono morfologicamente

caratterizzate da nuclei voluminosi, citoplasma denso, scarsa vacuolizzazione, parete primaria sottile,

plastidi poco differenziati, abbondanti plasmodesmi

- Tra le cellule meristematiche si distinguono in base alla frequenza di divisione e alla posizione occupata

all’interno del meristema:

 cellule fondatrici/staminali

 cellule iniziali/staminali

 cellule derivate

- Le cellule derivate sono le cellule generate dalle staminali destinate al differenziamento, caratterizzate da

attività proliferativa intensa ma limitata nel tempo, costituendo una popolazione di cellule intermedie fra

quelle staminali e quelle completamente differenziate

Tipi di meristemi

- In base all’origine, si distinguono:

 meristemi primari: formati durante l’embriogenesi

 meristemi secondari: originati durante la vita post-embrionale

- In base alla posizione si distinguono:

 meristemi apicali: localizzati agli apici degli organi

o meristema caulinare/apicale del germoglio (allungamento del fusto e formazione delle sue

appendici laterali)

o meristema radicale (allungamento della radice)

 meristemi laterali: localizzati agli apici degli organi

o formazione dei tessuti vascolari primari e secondari

 meristemi basali: localizzati alla base delle foglie in alcune piante (monocotiledoni)

 meristemi intercalari: localizzati alla base degli internodi in alcune piante (monocotiledoni)

- In base ai tessuti cui danno origine si distinguono:

 protoderma: differenzia le cellule epidermiche

 procambio: differenzia i tessuti vascolari primari

 meristema fondamentale: produce i rimanenti tessuti del germoglio e della radice

- I meristemi possono essere:

 indeterminati: persistenti nel corso della vita della pianta

o meristemi della infiorescenza

 determinati: ad esaurimento in seguito alla produzione dei tessuti/organi cui danno origine

o meristemi fiorali

Meristemi a formazione embrionale

- Durante lo sviluppo embrionale si passa da una cellula pienamente totipotente (zigote) a una struttura

multicellulare (embrione maturo) in cui gruppi di cellule capaci di mantenere l’attività proliferativa vengono

segregati in posizione appropriata per sostenere il processo di crescita continua post-embrionale

- Il protoderma è il primo gruppo di cellule meristematiche chiaramente distinguibili per comportamento e

destino, osservabili in Arabidopsis a partire dallo stadio a 16 cellule che si dividono solo anticlinalmente

aumentando la superficie e non lo spessore della futura epidermide

- Il meristema della radice è il primo meristema apicale che si forma nell’embriogenesi ed è funzionale allo

stadio di cuore

- Il procambio si forma come massa di cellule centrali allungate nello stadio di cuore maturo; durante il

processo di sviluppo la massa compatta di cellule procambiali va incontro a un processo di frammentazione

originando cordoni che costituiranno i fasci vascolari primari

- Il meristema fondamentale è costituito dalle cellule che circondano il procambio, sottostanti il

protoderma (dallo stadio di cuore maturo)

- Il meristema caulinare/vegetativo/apicale del germoglio diventa morfologicamente distinguibile come un

gruppo di cellule posto fra i cotiledoni durante il tardo sviluppo embrionale

Meristemi a formazione post-embrionale

- I meristemi dell’infiorescenza e i meristemi fiorali sono meristemi vegetativi apicali riprogrammati che

producono infiorescenze e fiori alla transizione tra fase vegetativa e fase riproduttiva

- Il periciclo della radice (strato più esterno del cilindro centrale) ha attività meristematica durante la vita

post-embrionale

- Il cambio cribro-vascolare (originante floema e xilema secondari) e il cambio subero-fellodermico

(responsabile della formazione di sughero e felloderma) si sviluppano nel fusto e nella radice durante la vita

post-embrionale delle specie con crescita secondaria

- I meristemi avventizi si formano per sdifferenziamento di tessuti differenziati in seguito a lesioni o altri

eventi accidentali

- I meristemoidi sono piccoli gruppi di cellule in grado di originare strutture specifiche (es. apparati

stomatici e tricomi epidermici)

Meristema apicale della radice RAM e sviluppo della radice

D: Cosa istruisce le cellule della radice a prendere specifici destini differenziativi?

- Il meristema apicale della radice si organizza e mantiene per divisione asimmetrica delle proprie cellule

staminali e presuppone anche la trasmissione di informazioni posizionali tra le cellule

- Il RAM, formato durante l’embriogenesi, origina alla germinazione la radichetta, poi la radice primaria a

crescita indeterminata

- La forma dell’apice radicale corrisponde a un doma ricoperto dalla cuffia radicale (cappuccio di cellule

parenchimatose)

- La colonna centrale della cuffia radicale è la columella, le cui cellule parenchimatose costituenti sono

coinvolte nella risposta gravitropica in quanto contengono statoliti (amiloplasti)

- Un mucigel di mucillagini secreto dalle cellule della cuffia ricopre la stessa e l’apice, con funzione di

lubrificare il passaggio della radice nel suolo, di proteggerla dal disseccamento e di proteggere il meristema

- Ogni divisione mitotica delle cellule della nicchia è asimmetrica:

 1 cellula rimane a contatto del CQ e viene mantenuta come staminale

 1 cellula esce dalla nicchia e si differenzia

- La regione meristematica apicale della radice di Arabidopsis è organizzata in:

 4 cellule fondatrici/centrali del centro quiescente (CQ), a scarsa attività mitotica, che mantengono

la nicchia delle cellule staminali (centro organizzatore della nicchia)

o WOX5 è un marcatore molecolare per le cellule del CQ del RAM così come WUS è

marcatore molecolare per le cellule inferiori della CZ (OC) del SAM

 strato di cellule iniziali staminali che circondano il centro quiescente disposte in modo preciso e in

grado di organizzare attraverso divisioni cellulari asimmetriche il pattern radiale e longitudinale

(distribuzione dei tessuti) della radice primaria

o le iniziali della stele/del tessuto vascolare sono localizzate superiormente al CQ

 divisioni periclinali seguita da divisioni anticlinali originanti il singolo asse centrale

xilematico composto di 4-5 file di cellule del cordone procambiale e due gruppi

floematici a 90° dall’asse radiale xilematico

o le iniziali del periciclo formano un anello superiormente al CQ circondante le iniziali del

tessuto vascolare

 divisione anticlinale

o le iniziali della corteccia e dell’endoderma formano un anello superiormente al CQ

circondante le iniziali del periciclo

 divisione anticlinale seguita da divisione periclinale asimmetrica della cellula più

lontana dal CQ originante una cellula dell’endoderma (più interna) e una cellula del

parenchima corticale

o le iniziali dell’epidermide e della cuffia laterale formano l’anello più esterno lateralmente

al CQ circondante le iniziali della corteccia e dell’endoderma

 divisione periclinale originante una cellula della cuffia laterale e una

dell’epidermide

o le iniziali della columella sono localizzate inferiormente al CQ

 cellule derivate dalle iniziali, in attiva proliferazione, che generano nuove cellule di un tipo di

tessuto

- Per originare le derivate, le cellule iniziali devono dividersi secondo piani particolari esprimendo il

programma di sviluppo del pattern distale/longitudinale e del pattern radiale/trasversale

- I precursori dei tessuti primari della radice che si formano durante l’embriogenesi sono:

1. procambio → tessuto vascolare (xilema e floema)

2. meristema fondamentale → periciclo, corteccia, endoderma

3. protoderma → epidermide

4. caliptrogeno → cuffia radicale (laterale e columella)

- Le cellule del CQ hanno origine clonale dall’ipofisi (lens shaped cell)

Studio della radice di Arabidopsis

- La radice di Arabidopsis thaliana offre dei vantaggi nello studio dei processi di differenziamento e

sviluppo:

 è semplice (pochi tipi cellulari)

 è facilmente manipolabile fuori dal suolo (in un terreno di coltura)

 è facilmente osservabile al microscopio (al contrario del meristema del germoglio che è circondato

e protetto da primordi fogliari)

 è organizzata a file di cellule (è possibile seguire una fila fino all’iniziale che l’ha originata)

 nella parte apicale non ha ramificazioni (al contrario del meristema apicale)

 esistono marcatori molecolari che identificano ogni tipo cellulare

 i diversi tipi cellulari possono essere separati

L’ablazione laser dimostra che il mantenimento della nicchia dipende dalle cellule del QC

- Distruggendo con ablazione laser (con microscopio confocale) cellule del centro quiescente:

 le sottostanti iniziali della columella interrompono i loro cicli mitotici e vanno incontro a

differenziamento accumulando granuli di amido

 le adiacenti iniziale della corteccia e dell’endoderma si dividono direttamente periclinalmente

(saltando la divisione anticlinale) differenziando i due tessuti

 dopo il quinto giorno dall’ablazione il CQ è ripristinato da cellule (iniziali o derivate, quindi

parzialmente differenziate) che trovandosi a occupare la posizione relativa precedentemente

occupata dalle cellule del CQ ne acquisiscono l’identità

- Conseguenze:

1. Le cellule del CQ inviano alle iniziali di columella e di corteccia-endoderma segnali a breve raggio

che ne inibiscono il precoce differenziamento

a. La presenza del CQ è quindi condizione necessaria per mantenere indifferenziate le cellule

della nicchia staminale della radice RAM

2. Le cellule del meristema radicale si differenziano in funzione della loro posizione e non in funzione

della loro discendenza

a. L’acquisizione di una nuova identità da parte di cellule che si sostituiscono a quelle ablate è

dipendente dal contesto cellulare adiacente

3. Il confine clonale che separa il destino apicale da quello basale non limita la possibilità di una cellula

di differenziarsi in un’altra

4. L’informazione che guida il destino differenziativo lungo l’asse apico-basale della radice è ancora

presente anche se manca il QC

- L’informazione che guida il destino differenziativo lungo l’asse apico-basale della radice è ancora presenta

anche se manca il QC

- L’auxina è il morfogeno che istruisce le cellule della radice a prendere specifici destini differenziativi

- Essendo l’auxina il morfogeno che determina il patterning della radice, se il suo flusso viene perturbato la

radice ha uno sviluppo anomalo

- I corretto flusso polare di auxina nella radice è garantito dalla presenza e posizione dei trasportatori PIN1

e PIN2

- La localizzazione delle proteine PIN nei vari tipi cellulari è stata determinata sperimentalmente e prevede

che:

 le cellule della vascolatura/del procambio esprimano le PIN in posizione esclusivamente basale

 le cellule dell’endoderma esprimano le PIN in posizione basale e laterale (dal lato rivolto verso la

vascolatura)

 le cellule di corteccia, epidermide e cuffia laterale esprimano le PIN in posizione apicale e laterale

(dal lato rivolto verso la vascolatura)

 le cellule della columella su tutti i versanti cellulari

- Questa distribuzione delle PIN garantisce un accumulo di auxina in corrispondenza della posizione delle

cellule che costituiscono il CQ

- Il modello matematico della crescita della radice in funzione delle concentrazioni di auxina indica che il

massimo accumulo di auxina nel QC dipende solo dalla distribuzione delle proteine PIN

- Il picco di concentrazione è stabile e dipende dal flusso di auxina attraverso i tessuti con un movimento a

fontana rovesciata

- Il flusso centrale verso il basso si connette al flusso laterale diretto verso l’alto attraverso la cuffia radicale

che ridistribuisce l’auxina

Meristema apicale del germoglio SAM e sviluppo del germoglio

- Il SAM è responsabile della crescita del germoglio (insieme di fusto, foglie, gemme, rami, fiori), porzione

aerea delle Cormofite (piante terrestri)

- La specificazione del SAM avviene contemporaneamente alla formazione degli abbozzi dei cotiledoni

durante l’embriogenesi di Arabidopsis, durante lo stadio globulare

- Per la formazione del SAM sono indispensabili i geni WUS e STM, oltre che PHV, PHB, REV

- Il meristema apicale del germoglio si organizza e mantiene per informazione posizionale

- In Arabidopsis l’organizzazione longitudinale del doma caulinare è a 3 strati:

 L1: strato più esterno, costituito da un monostrato di cellule iniziali che si dividono anticlinalmente,

le cui derivate originano epidermide della porzione aerea della pianta

 L2: strato intermedio di cellule che originano mesofillo esterno, parenchima corticale e i tessuti

sporigeni del fiore

 L3: strato più interno di cellule che generano midollo, fasci conduttori, mesofillo interno e i tessuti

interni del fiore

- Il meristema apicale del germoglio di Arabidopsis è organizzato radialmente in:

 zona centrale CZ (Central Zone) che costituisce la nicchia delle cellule staminali, a ridotta attività

proliferativa

o Il centro organizzatore è costituito dalle cellule inferiori della CZ che esprimono WUS

(mRNA)

o Le cellule staminali superiori della CZ esprimono CLV3 (mRNA)

o La funzione di una cellula iniziale dipende dalla sua posizione nel doma che non è

permanente

 zona periferica ZP (Periferal Zone) in attiva proliferazione, competente per la formazione di organi

laterali

o Le cellule sono determinate per la formazione di primordi fogliari, gemme ascellari, tessuti

esterni del fusto

o La proliferazione delle iniziali spinge continuamente le derivate verso i lati del doma,

incanalate verso il differenziamento

o Il destino delle cellule derivate non dipende dallo strato in cui si formano ma dalla

posizione che occupano nel momento in cui intraprendono il destino differenziativo

 meristema subapicale RZ (Rib Zone) in attiva proliferazione

- La rapidità del ciclo cellulare nel meristema dipende dalla zona in cui sono posizionate le cellule

- Cellule esterne alla CZ iniziano l’espressione di geni legati al differenziamento

- Le cellule che escono dalla nicchia entrano in una zona periferica morfogenetica dalla quale sono reclutate

per la formazione delle bozze fogliari

- La capacità rigenerativa del SAM è conferita dalle iniziali apicali della CZ

- La dimensione della nicchia e i suoi confini sono mantenuti costanti da un sistema di segnalazione

molecolare a feedback negativo fra in centro organizzatore della nicchia, caratterizzato dall’espressione di

WUSCHEL, e le cellule circostanti, caratterizzate dalla presenza di CLAVATA1, 2 e 3

- CLAVATA3 è coinvolto nel mantenimento stabile della dimensione del dominio di espressione di centro

organizzatore e nicchia staminale perché CLAVATA3 reprime l’espressione di WUSCHEL

- La regolazione reciproca WUS-CLAVATA3 mantiene la nicchia di cellule staminali

- Il SAM durante lo sviluppo post-embrionale svolge 3 attività:

 formazione del fusto per proliferazione cellulare

 organogenesi di foglie e gemme

 automantenimento di dimensioni e struttura originarie

- Il SAM si trasforma in apice infiorescenziale che origina i fiori

D:Come si distribuisce l’auxina nel meristema apicale?

- PIN1 è localizzato nello strato L1 (in misura minore L2) del meristema vegetativo

- Quindi l’auxina si accumula in direzione del primordio emergente

- Dal punto di accumulo l’auxina è trasportata verso la base del meristema

- La distribuzione di PIN1 consente di dedurre la direzione del flusso di auxina nel meristema

- Il gene reporter DR5 consente di individuare le cellule in cui si ha accumulo di auxina

Modello WUS CLV

- L’espressione di WUS nel SAM è positivamente regolata da citochinine

- L’mRNA di WUS è espresso alla base della CZ

- La proteina WUSCHEL migra dal centro organizzatore alle cellule staminali superiori della CZ (degli strati L1

e L2), specificandone la staminalità, dove può attivare l’espressione di CLAVATA3 (dimostrabile tramite

piante transgeniche che esprimono il costrutto pWUS::eGFP:WUS)

- WUSCHEL attiva l’espressione di CLAVATA3 in modo diretto come fattore di trascrizione (dimostrabile

tramite ibridazione in situ con sonda per l’mRNA di CLV3)

- CLV3 migra dalle cellule superiori della CZ a quelle inferiori del centro organizzatore dove reprime

l’espressione di WUSCHEL attraverso un sistema di trasduzione del segnale mediato dal complesso

recettoriale transmembrana CLV1CLV2

- In definitiva: l’OC secerne un segnale che mantiene staminali un gruppo di cellule, le quali in risposta

secernono un repressore del segnale stesso

- La regolazione reciproca WUS-CLAVATA3 mantiene costante la presenza e la dimensione della nicchia di

cellule staminali del SAM

Analogie tra le stem cells del meristema apicale del germoglio e quelle della radice

- I processi che portano alla formazione dei meristemi primari di germoglio e radice condividono delle

caratteristiche comuni

- I due meristemi si formano alle estremità opposte della provascolatura

- L’organizzazione funzionale dei due meristemi dipende da membri funzionalmente intercambiabili della

famiglia WOX (codificanti per fattori di trascrizione a omeodominio): WOX5 nella radice e WUS nel

germoglio

- Il centro quiescente di Arabidopsis esprime WOX5

- L’espressione di WOX5 nel centro quiescente serve per mantenere indifferenziate le stem cells

- Il mutante wox5 non riesce a mantenere le stem cells indifferenziate

- Over-espressione di WOX5 mantiene indifferenziate anche le cellule della columella

- WUS e WOX5 possono essere considerati equivalenti perché:

 L’espressione di WUS sotto il controllo del promotore di WOX5 complementa il mutante wox5

 L’espressione di WOX5 sotto il controllo del promotore di WUS complementa il mutante wus

- I centri organizzatori di RAM e SAM sono analoghi dal punto di vista funzionale

Organogenesi e sviluppo fogliare

D: Cosa sono le foglie?

D: Dove si formano le foglie?

D: Come e dove viene specificata la posizione del primordio?

D: Quali fattori impongono una forma alla foglia?

D: Quale segnale determina il posizionamento degli organi nella zona periferica?

D: Quali meccanismi controllano la posizione dei primordi e la loro trasformazione in organi?

- L’accrescimento delle piante avviene in maniera modulare attraverso la ripetizione di fitomeri costituiti da

internodo, foglia e gemma ascellare

- La gemma apicale all’estremità del fusto è costituita dall’apice caulinare/SAM in posizione centrale e da

primordi/abbozzi/bozze fogliari

- La PZ è competente per produrre organi laterali

- Il primordio della foglia si specifica in punti della zona periferica grazie ad alcuni segnali molecolari

- Il punto in cui si forma il primordio non è causale ma segue una fillotassi

- Foglie, gemme ascellari, fiori si originano come semplici protuberanze della PZ del SAM, per poi acquisire

caratteri specifici dell’organo in questione

- La genesi dei primordi fogliari è esogena in quanto avviene attraverso ripetute divisioni periclinali di

alcune cellule appartenenti agli strati periferici interni del doma seguiti da divisioni anticlinali dello strato

cellulare più esterno (che ricopre esternamente i primordi)

- Dopo che si è formata una bozza, l’apice caulinare si allunga seguito dalla formazione di una nuova bozza,

con un ritmo (plastocrone) costante per ogni specie

- I primordi si formano in serie acropeta (i più giovani sono i più apicali e centrali)

Tipi di fillotassi

- Le foglie sono inserite lungo il fusto ai nodi secondo un ordine regolare

- La fillotassi rappresenta la disposizione regolare delle foglie sul fusto e può essere dei tipi fondamentali:

 alternata: una foglia per nodo

o i primordi si formano in successione, uno per volta

 opposta: due foglie per nodo

o due primordi si formano contemporaneamente

 verticillata: più di due foglie per nodo

o più primordi si formano contemporaneamente

o REGOLA DELL’EQUIDISTANZA: le foglie verticillate formano tra loro angoli uguali (2:180°;

3:120°)

o REGOLA DELL’ALTERNANZA: le foglie si sovrappongono esattamente ogni due nodi

- La fillotassi può essere distinta anche in base alla disposizione delle foglie di un nodo rispetto a quella

degli altri nodi:

 distica: fillotassi alternata per cui le foglie sono disposte lungo il fusto in due file ortostiche

 decussata: fillotassi opposta in cui le coppie di foglie sono disposte in 4 file, orientate

perpendicolarmente rispetto al nodo precedente

 spiralata/dispersa: fillotassi alternata in cui la posizione delle foglie nei nodi successivi forma

un’elica

Descrizione matematica della fillotassi spiralata

- La fillotassi di Arabidopsis è spiralata, i primordi sono collocati formando angoli definiti dalla serie di

Fibonacci (angolo aureo 137,5°) in modo che siano sempre il più lontano possibili dagli altri (disposti

SEMPRE in senso orario)

- Nella fillotassi alternata spiralata, l’angolo di divergenza è una frazione di angolo giro calcolato come

prodotto tra una frazione, che ha al numeratore il numero di giri di spirale compresi tra due foglie

perfettamente sovrapposte e al denominatore il numero di foglie incontrate tra le due foglie sovrapposte, e

l’angolo giro (360°)

- Per una determinata specie, il numero di giri di spirale e il numero di foglie incontrate sono sempre gli

stessi, indipendentemente dalla foglia di partenza

- La frazione che esprime l’angolo di divergenza, pur variando tra specie diverse, ha numeratore e

denominatore legati dalla serie di Fibonacci (1/2, 1/3, 2/5, 3/8, 5/13, …): ciascuno dei numeri è la somma

dei due precedenti

- La successione di Fibonacci F è una successione di numeri interi positivi in cui ciascun numero è la somma

n

dei due precedenti e i primi due termini della successione sono per definizione F =1 e F =1:

1 2

F = F + F per ogni n>2 F : [1, 1, 2, 3, 5, 8, 13, 21, 34, 55, 89, 144, …]

n n-1 n-2 n

- Il valore della frazione tende a un valore limite pari a 0,381966, che moltiplicato per 360° fornisce un

angolo di divergenza che tende a 137° 30’ 28”

- Gli angoli di divergenza che si riscontrano in natura sono delle approssimazioni di questo angolo ideale in

cui nessuna foglia sarebbe sovrapposta a un’altra (per non ombreggiarsi vicendevolmente)

- Il valore 0,381966 rappresenta la radice dell’equazione della sezione aurea che permette di dividere un

segmento un due porzioni disuguali tali che il rapporto tra l’intero segmento e la porzione più grande è

uguale al rapporto tra le due porzioni

- La regola di Hofmeister deriva dall’osservazione empirica che i nuovi primordi fogliari si formano nelle

zone di maggior spazio vuoto tra i vecchi primordi

- La regola di Hofmeister:

 Least crowded spot: i primordi si formano uno alla volta a intervalli regolari

o Il primordio più recente si forma alla periferia del meristema dove lo spazio libero è più

ampio

 Radial displacement of primordia: i vecchi primordi, mentre si accrescono, sono spostati

centrifugamente dal centro del meristema circolare

o Più vecchio è il primordio, più lontano sarà dal centro dell’apice meristematico

- Il pattern a spirale si auto-organizza (the spiral pattern is self-organized)

Teoria del campo

- Il modello del “campo di inibizione” spiega il posizionamento dei primordi e la regola di Hofmeister

- La teoria del campo, sostenuta da modelli matematici, si basa sul concetto che una sostanza chimica

diffonda attraverso il doma e che la sua ineguale distribuzione crei dei campi entro cui la sostanza sia

responsabile per la sua concentrazione della formazione del primordio

- I nuovi primordi si formano dove vi è maggior spazio possibile, alla maggiore distanza possibile dai

preesistenti primordi

Auxina e fillotassi

- Zone periferiche dell’apice esposte ad IAA, dopo ore iniziano a organizzare primordi fogliari

- Questo significa che IAA è un segnale sufficiente per posizionare un primordio

- Applicazione locale di auxina induce l’organogenesi

- L’auxina è un segnale di natura quantitativa: maggiore la concentrazione di auxina, maggiore è la

tendenza dell’apice a organizzare cellule in primordio (foglia più grande)

- Applicazione locale di auxina a meristemi normali induce la formazione di organi laterali più grandi o fusi

- Il trattamento con auxina aumenta le dimensioni del primordio, reclutando più cellule per la formazione

dell’organo

- Tuttavia l’applicazione di IAA sulla zona centrale del meristema non induce l’organizzazione di un

primordio, che è inibito nell’organogenesi per via di segnali molecolari

- La zona centrale non sviluppa organi in seguito ad applicazione di auxina

- Quindi solo la zona periferica è organogenica

- Il primordio si forma in corrispondenza delle maggiori concentrazioni di auxina

- Trattando l’apice con inibitore del trasporto dell’auxina (BfA o NPA) si ottiene un apice allungato: il

meristema prolifera senza differenziare tessuti con un fenotipo simile a quello del mutante pin1

- I mutanti pin1 non sono in grado di produrre organi laterali sull’asse infiorescenziale

- Inibitori del trasporto dell’auxina bloccano l’organogenesi

- La corretta distribuzione dei gradienti auxina nel doma è necessaria per la fillotassi

Modello del campo di inibizione da auxina

- Per la distribuzione polarizzata di PIN1, l’auxina è convogliata verso il primordio in formazione causando

un depauperamento dalle zone circostanti che diventano incapaci di organogenesi

- PIN1 è localizzato nello strato L1 (in misura minore L2) del meristema vegetativo, come visualizzabile

tramite il costrutto pPIN1::PIN1-GFP, creando un accumulo di auxina in direzione del primordio emergente,

osservabile con l’uso del costrutto pDR5::GFP

- Quando il primordio acquista la capacità di sintetizzare e trasportare auxina in direzione basipetala si può

formare un nuovo primordio nelle sue vicinanze

- Quindi, il giovane primordio agisce come sink/pozzo per l’auxina mentre il primordio maturo diventa un

source/fonte

- L’influenza dei primordi pre-esistenti varia in funzione con l’età

- Pertanto i primordi pre-esistenti forniscono l’informazione posizionale auxina-dipendente che controlla il

sito d’inizio dei nuovi primordi

- Modello per il posizionamento dei primordi fogliari:

 L’auxina si accumula in un primordio rimuovendo auxina dalle cellule circostanti

 Solo quando l’apice del primordio cresce a sufficienza, allontanandosi dal meristema, nuova auxina

può accumularsi ad un sito a distanza massima dai precedenti primordi e fungendo da nuovo “sink”

- Parametri del modello:

1. La formazione del pattern fillotattico è un processo dinamico guidato dalla crescita del meristema

del germoglio

2. Lo strato L1 agisce come un condotto isolato per il trasporto di auxina nel patterning del SAM

3. L’Auxina è immediatamente disponibile nello strato L1 perchè fluisce dalle zone sottostanti del

germoglio

4. L’auxina è distribuita nello strato L1 dal trasporto attivo mediato dai carriers PIN1 con

localizzazione specifica

5. La concentrazione di PIN1 in una cellula è regolata positivamente da auxina

6. La localizzazione di PIN1 nelle cellule è determinata dalla concentrazione di auxina nelle cellule

adiacenti

7. Only the peripheral zone, the band of cells below the apex, is competent to induce lateral organs in

response to auxin

8. A new primordium emerges at the location of high concentration of auxin

- Inoltre dal punto di accumulo di auxina corrispondente al primordio, questa è trasportata verso la base del

meristema, guidando la formazione della vascolatura della foglia nascente

Forma fogliare

- Le piante possono essere identificate dalla forma della foglia

- Le chiavi di classificazione si basano su:

 forma

o lineare

o ellittica

o a spatola

o lanceolata

o ovale

 margini

o liscio

o serrato

o lobato

 complessità

o semplice

o composta

- Alla sua emergenza, il primordio fogliare presenta simmetria radiale

- La proliferazione delle cellule in posizione apicale guidano l’iniziale allungamento del primordio definendo

l’asse prossimo-distale/basale-apicale della foglia

- Un approccio reverse genetics ha consentito di isolare alcuni determinanti della formazione delle foglie in

Cardamine hirsuta (a foglie composte)

- I siti di maggiore crescita lungo il margine fogliare accumulano auxina anche in Arabidopsis

Modello di interazione tra auxina, PIN1 e CUC2 nello sviluppo del margine fogliare

- PIN1 guida accumuli localizzati di auxina nella foglia come visualizzabile in piante wt trasformate con il

costrutto PIN1:GFP e pDR5::YFP

- La crescita di alcune parte del margine è repressa dall’espressione di geni CUC2

- Attraverso la trasformazione di wt con il costrutto pCUC2::GUS è possibile visualizzare dove viene espresso

CUC2


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in scienze biologiche
SSD:
Università: Milano - Unimi
A.A.: 2016-2017

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher SebastianSuebis di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biologia dello sviluppo vegetale e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Milano - Unimi o del prof Fornara Fabio.

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