Biologia dello sviluppo vegetale

LEZIONE 1 (28-09)

Riassunto:

-la proliferazione cellulare è necessaria per l’aumento di dimensioni

-piante e animali si sviluppano da una singola cellula

-le cellule che formano un individuo hanno tutte lo stesso genotipo ma fenotipo diverso

(di erenziamento)

-organogenesi

-crescita determinata vs crescita

Sviluppo inizia con la formazione dello zigote.

Gameti sono aploidi quindi hanno un unico corredo cromosomico e lo zigote sarà diploide.

Negli animali il di erenziamento dei tessuti e degli organi avviene durante lo sviluppo embrionale

mentre nelle piante lo sviluppo dei tessuti avviene nella fase post embrionale.

Le fasi della biologia dello sviluppo:

-aumento del n.di cellule-> tramite successive divisioni mitotiche

-di erenziamento delle cellule->pur avendo lo stesso genotipo perchè si formano per mitosi, le

diverse cellule devono acquisire caratteristiche speci che. In questo processo di formano i

tessuti.

-organogenesi->cellule fenotipicamente diverse si devono di erenziare a formare gli organi

Quali sono le problematiche studiate dalla biologia dello sviluppo?

1-il di erenziamento-> poichè ogni cellula dell’organismo presenta lo stesso genotipo come può

questa serie di istruzioni genetiche a produrre di erenti tipi di cellule?

2-la morfogenesi e l’organogenesi->come possono le cellule formare strutture ordinate?

3-l’accrescimento-> come fanno le cellule a sapere quando devono smettere di dividersi?

4-l’interazione con l’ambiente-> come viene regolata l’interazione con fattori ambientali?

Aumento del n. di cellule si ha anche nei microrganismi ma a di erenza dei pluricellulari quando si

ha un aumento del n. di cellule negli unicellulari si formano colonie di cellule tutte uguali.

Cellule parenchimatiche hanno una funzione molto diversa da quelle epidermiche.

Cellule devono formare tessuti che a loro volta devono formare organi.

Di erenza legata a caratteristiche genetiche delle piante rispetto agli animali:

-body plan degli animali viene organizzato nella fase embrionale e nella fase successiva c’è solo

un aumento delle dimensioni->crescita determinata

-piante hanno un aumento continuo della crescita->crescita indeterminata

Come si studia lo sviluppo?

Scegliendo un sistema modello-> specie di piccole dimensioni con ciclo vitale breve, economico,

progenie numerosa, disponibilità di mutanti e facile da manipolare. Ma molto importante che

abbia un genoma di piccole dimensioni e un genoma già sequenziato.

Arabidopsis per le monocotiledoni e riso per le dicotiledoni.

Piante hanno n.di geni superiore anche ridondanti rispetto anche i vertebrati ma non correla con la

complessità degli organismi.

ff ff ff ff ff ff fi ff ff

LEZIONE 2

Riassunto:

-cosa sono i mutanti e come si possono ottenere

-di erenza tra forward and reverse genetics

-come può essere utilizzata la trasformazione delle cellule vegetali mediante Agrobacterium

-come si studia l’espressione di un gene: ibridazione i situ e geni reporter.

I mutanti sono necessari per comprendere i meccanismi genetico-molecolare che regolano lo

sviluppo.

Supponiamo che vogliamo studiare meccanismi genetico-molecolare che

studiano lo sviluppo del ore in Arabidopsis.

Confrontiamo il wild type con i mutanti modi cati.

In natura il tasso di mutagenesi è basso.

I mutanti sono ottenuti con mutagenesi chimica- sica.

Mutagenesi chimica usata nelle piante->agente chimico per mutagenesi

indotta è etilmetansulfonato EMS che sostituisce una base.

La mutazione sarà a livello eterozigote. inserzione di TDNA

Altro sistema usato molto è ottenere mutanti attraverso

o di elementi trasponibili.

Quello che viene usato per fare questa mutagenesi indotta è un

agrobatterio (batterio del suolo) che è Agrobacterium tumefaciens in natura

entra nelle piante da una ferita e inserisce il DNA del batterio dentro il

genoma della pianta creando un’induzione alla divisione cellulare che sono

incontrollate-> si generano tumori. <——Immagine schema cellula di un batterio con

cromosoma circolare ma ha anche un plasmide(molecola

plasmide

DNA circolare di dimensioni ridotte) chiamato

pTi(Ti proprio per tumor inducing) infatti sono i geni collocati

in questo plasmide che inseriti nel genoma della cellula

tumore.

ospitante induce la formazione del

I geni trasferiti dal plasmide si trovano tra le zone rosse

LB(left border) e RB(right border)

indicate come

normalmente questi geni vengono trasferiti all’interno delle

cellule infettate da questo batterio.

Dall’immagine sotto si vede che plasmide Ti tramite una

serie di proteine accessorie trasferisce questo DNA dentro

cellula infettata e lo integra direttamente nel DNA genomico.

Questi geni del batterio vengono trascritti e tradotti come

fosse genoma della pianta provocando una proliferazione

delle cellule vegetali.

ingegnerizzato

Anni fa hanno questo batterio cioè hanno

sostituito la regione che sta tra LB a RB con un DNA

sintetico. Questo plasmide dell’agrobacterio viene disarmato

cioè non induce più la formazione di un tumore ma contiene i

geni che l’operatore vuole traferire all’interno del genoma

delle cellule vegetali infettate.

formazione di mutanti

Quindi per la quello che viene fatto è

di inserire in questa regione del DNA, che non ha impatto

sullo sviluppo della pianta, in più viene messo anche un gene

che facilita il riconoscimento delle piante che contengono

questo DNA-transgenico.

Si prepara una coltura batterica con questo agrobacterio

ingegnerizzato e si mette in contatto questo batterio con la pianta che si vuole trasformare.

Questo plasmide non è in grado di formare un tumore ma di dare il DNA alla pianta ospite.

ff fi fi fi

Nel caso di Arabidopsis->Si mettono in contatto i ori che contengono i gameti con questa

cultura di agrobacterio con plasmide disarmato e infetterà tutte le cellule di Arabidopsis che

riuscirà a penetrare.

Ciclo vitale si conclude formazione semi->Saranno semi trangenici perchè avremo il DNA del

plasmide Ti inserito all’interno del proprio genoma.

Come si riconoscono i semi transgenici?

Nel pezzetto di DNA tra LB e RG viene inserito anche un gene che aiuta il riconoscimento delle

piante trangeniche o un gene che dà resistenza ad un antibiotico. Si fanno germinare semi in

antibiotico

presenza di un e solo quelli che contengono DNA transgenico avendo resistenza

uorescenza

germinano e danno origine ad una pianta trangenica. Oppure geni che conferiscono

visibile al binoculare con UV.

Questo T-DNA come riesce a fare mutazioni?

Il T-DNA si inserisce casualmente nel genoma quindi si può inserire anche in una regione

codi cante determinando una mutazione che può essere davvero seria(inseriamo proprio un

pezzo di DNA all’interno di un gene). Quindi queste mutazioni sono stabili che vengono poi

ereditate e per riuscire a identi care individui che hanno del T-DNA inserito in una regione

codi cante che crea un fenotipo mutato è necessario andare nella generazione successiva.

Riassunto-> inserzione T-DNA a livello genomico è random-> quindi quando l’inserzione del

T-DNA a livello cromosomico privilegia le regioni trascritte ->inserzione del T-DNA a livello del

gene è random.

La trasformazione fa si che ci sia inserzione del T-DNA in uno dei due alleli quindi per avere

fenotipo mutato è necessario andare alla generazione successiva cioè ottenere degli omozigoti

per l’inserzione.

L’inserzione del T-DNA in generale è una mutazione knock out (KO) poichè inattiva la proteina

codi cata da questo gene perchè interrompe la sequenza dei nucleotidi quindi inattiva la proteina.

Quando si fa la trasformazione(usando l’agrobacterio) nel genoma entrano 1-2 copie al massimo

di T-DNA->Questo facilita poi l’isolamento del gene che viene modi cato con mutagenesi indotta.

Mentre le mutagenesi chimiche determinano la mutazione di una singola base e queste mutazioni

sono frequenti nel genoma per cui se consideriamo i 5 cromosomi di Arabidopsis mediante

mutagenesi indotta con T-DNA abbiamo 2-3 copie al massimo quindi poi è facile capire il gene

responsabile di questo tipo perchè targettato con TDNA inserito dentro.

Mentre per mutagenesi chimica si hanno più eventi anche alcune decine a livello di ciascun

singolo genoma quindi è di cile capire quale mutazione ha dato origine a un determinato fenotipo

e molto spesso non sono mutanti KO (perchè sono sostituzione di base) quindi a volte sono

conservative quindi bisogna analizzare molti individui per trovare l’individuo con il gene

d’interesse completamente silenziato.

Una volta ottenuti questi mutanti bisogna utilizzarli per capire i meccanismi alla base dello

sviluppo->Si selezionano i mutanti d’interesse.

Se dobbiamo studiare lo sviluppo del ore bisogna identi care tra popolazioni di Arabidopsis i

mutanti che hanno la morfologia orale alterata.

morfologica

Poi si fa 1) un’analisi e quindi si va a vedere confrontando tra il ore wt e il mutante.

Ci sono molte tecniche di microscopia con il SEM vedere le variazioni di sviluppo e si fa una

descrizione dettagliata.

Capire i meccanismi cioè cos’è successo a livello genetico per capire come avere questo fenotipo

mutato.

Mutante agamous—>questo mutante è mutante in un singolo gene. Ci sono dei mutanti in cui si

formano gli organi correttamente ma sono al posto sbagliato. Questo ore forma i petali anche

molto belli ma si formano non all’interno del ore in un verticillo solo ma ovunque anche al posto

omeotico

dei sepali e carpelli. Questo mutante è detto in cui gli organi si formano correttamente

singolo gene,

ma al posto sbagliato. Un mutante dovuto alla mutazione di un in grado di

determinare un difetto molto grave, ovviamente in natura sarebbe letale non fa gameti e non avrà

progenie.

fi

fi

fi ffi fi fi fi fi fi fi fi fi fi fl

genetica

2)analisi

cioè vedere se mutazione è recessiva o dominante quindi se bisogna avere entrambi gli alleli

mutati o uno solo. Capire per cosa codi ca e cosa fa la proteina codi cata dal gene in questione.

Caratterizzare un gene vuol dire vedere dove il gene viene espresso, quindi il gene viene isolato e

si va a vedere dove il gene viene trascritto->Quando si isola un gene che mutato da origine al

fenotipo d’interesse si parla di forward genetics(quando si passa da un mutante al gene).

Isolato questo gene si fa una predizione per capire quale tipo di proteina viene codi cata da

questo gene e si vede dove viene espresso.

Mutante nella morfologia orale è dovuto alla mutazione del gene Agamus(senza gameti)

ipotizziamo che venga trascritto a livello del ore quindi una degli esperimenti più importanti per la

caratterizzazione del gene è vedere dove viene trascritto e le tecniche sono:

in situ->

-ibridazione

Si basa sull’utilizzo di sonde a RNA anti senso.

Si vuole studiare se un determinato gene (Agamous)espresso nel ore ma in quali tessuti. Si ssa

la strutture dove si vuole studiare di un determinato gene si include in para na poi fatte delle fette

sottili di 7 micron e poi si fa ibridazione con una sonda a RNA marcata questo RNA antisenso

andrà a ibridare con l’RNA senso che è quello trascritto dall’RNA polimerasi che dà un’indicazione

di dove il gene è trascritto.

La sonda viene fatta con nucleotidi modi cati che hanno

attaccati la diossiossigenina. Si può visualizzare dov’è

avvenuta l’ibridazione tra il RNA senso e antisenso

propio perchè nell’antisenso ci sono residui di ossigenica

che sono facilmente visibili tramite l’utilizzo di un

anticorpo coniugato con l’enzima fosfatasi alcalina(FA) a

sua volta catalizza la trasformazione di un substrato

incolore in uno colorato quindi laddove avviene

l’ibridazione in seguito al trattamento con anticorpi e

substrato si possono vedere delle pigmentazioni dove

l’RNA antisenso si è appaiato con un RNA senso era

presente l’RNA complementare a quello usato come

sonda. Questo sistema un essere usato per capire in

quale cellule il gene che vogliamo studiare è espresso.

di geni reporter per visualizzare l’attività del promotore->

-uso

Si clona il promotore a monte di un gene reporter (utilizzati

geni reporter GUS e GFP). In laboratorio si producono

questi DNA ricombinanti che poi dovranno essere inseriti in

pianta.

Quando il gene reporter è il GUS(gene che codi ca per

l’enzima beta-gluconidasi) questo enzima viene utilizzato

perchè nelle piante non esiste (non c’è background)

interessante perchè è in grado di trasformare un composto

invisibile in un composto blu e maggiormente visibile anche

con un binoculare.

Il saggio GUS è stato ideato e sviluppato da Richard Anthony Je erson e la tecnica è basata

sull’enzima beta-gluconidasi che è un enzima di E.coli .

Si clona il gene codi cante questo enzima a valle del gene che si vuole studiare l’attività.

L’altro reporter è la GFP che è di origine animale una

proteina codi cata da un gene presente nel genoma

delle meduse. La GFP è la prima proteina utilizzata ora

ce ne sono decine con uorescenza con lunghezze

d’onda di erenti.

Per inserirli in pianta si usa sempre l’Abrobacterio, si

inserisce tra LB e RB il promotore di cui si vuole

studiare l’attività seguito dal gene reporter.

Il plasmide una volta che è stato ricostruito verrà

utilizzato per trasformare prima agrobacterio poi le

piante trasferendo il DNA presente nel pTi. Quindi saranno piante transgeniche in cui il promotore

che vogliamo studiare sarà a monte del gene reporter. Si ottengono piante in cui il promotore

ff fi fi fl fi fi fi fi fi ff fi fi ffi fi fi

trascrive il gene GUS che a sua volta verrà tradotto si immette un saggio istochimico e si vedrà

dove il gene è attivo perchè le colorazioni saranno blu.

In modo simile succede con la GFP in cui il promotore è a monte del gene reporter e si usa il

DNA-ricombinate per trasformare Arabidopsis.

Il gene reporter YFP uorescente nel giallo si vede la localizzazione anche all’interno della cellula

ad esempio nel nucleo. Avere informazioni non solo tessuto-speci cità del gene ma anche dov’è

localizzata la proteina codi cata da quel gene.

In ne si può confrontare l’attività del promotore

cioè dove il promotore regola la trascrizione del

gene e dove poi si trova la proteina. Molto

spesso il trascritto di un gene e la proteina sono

presenti nella stessa cellula. In alcuni casi la

proteina può migrare in cellule adiacenti come si

vede nell’immagine la prima dà idea del

promotore mentre nella seconda dà l’idea della

localizzazione della proteina riconbinante, c’è

uno strato di cellule che presenta questa

proteina ricombinante ben visibile che non

corrisponde a dove il gene viene trascritto,

quindi la proteina si muove nello strato

adiacente.

In campo scienti co molti ricercatori condividono i mutanti che hanno ottenuto.

Si possono usare quindi facilmente approcci:

genetics

-forward ->dal mutante al gene

genetics->partendo

-reverse da un gene si studia la mutazione del gene e il fenotipo dello

sviluppo

Modello principale che utilizzeremo: Arabidopsis thaliana

Essa ha una fase vegetativa di qualche settimana. Passa da una fase vegetativa a una produttiva

formando un in orescenza ( ori ermafroditi perfetti, ha i 4 organi fondamentali: sepali, petali, stami,

pistillo); continua a crescere durante tutto il suo ciclo vitale che è un ciclo annuale, ha una crescita

indeterminata. Dopo che avviene fecondazione la piantina muore.

Tutto comincia con la formazione dello zigote. Tutte le piante terrestri sono brio te (fecondazione

interna) e prima della fase adulta c’è sempre una fase embrionale. Organo riproduttore maschile:

stame con l’antera; organo riproduttore femminile: pistillo per il contatto con i granuli pollinici

all’apice, che contengono i gameti maschili, ovario in cui c’è un certo numero di ovuli. I gameti

negli animali si formano per meiosi. Nelle piante i gameti vengono reiterati nel tempo e si formano

solo in alcune condizioni ambientali: gametogenesi. Processo che si basa su mitosi (gameti

aploidi), ma ci deve comunque essere un fase di meiosi. Nelle piante superiori c’è alternanza di

fi fi fi fl fi fi fi fi

generazione. La gametogenesi avviene per formare strutture pluricellulari aploidi: polline. La

meiosi è necessaria per il dimezzamento del corredo cromosomico da diploidi ad aploidi. Il

gameto to maschile contiene due cellule spermatiche nella parte apicale dell’organo riproduttore

maschile (antera); c’è un’altra struttura che dà il tubetto pollinico che servirà a portare i gameti

nell’organo riproduttore femminile. Per quanto riguarda la parte femminile nell’ovulo c’è una

struttura pluricellulare aploide costituita da un certo numero di cellule aploidi e 2 cellule (cellula

uovo aploide e cellula centrale diploide): gameto to femminile o sacco embrionale. La

fecondazione conta sull’unione di 2 cellule femminili e 2 maschili.

-Primo evento di fecondazione: unione gamete maschile e gamete femminile aploide a zigote.

-Secondo evento di fecondazione: unione di gamete maschile e cellula centrale si forma la prima

cellula triploide del tessuto di riserva chiamato endosperma.

Il tutto è avvolto dai tegumenti dell’ovulo. Lo sviluppo dell’embrione deve avvenire in

contemporanea allo sviluppo dell’endosperma e dei tegumenti. Se manca qualche evento tra

questi non avviene la formazione del seme, che contiene l’embrione e rappresenta la progenie