Biologia dello sviluppo vegetale

Struttura delle proteine ARF

Le proteine ARF (DNA Binding Domain) sono composte da diverse regioni, tra cui:

• DBD (DNA Binding Domain): una regione altamente conservata che riconosce la sequenza del DNA chiamata AUX-RE, composta da 6 basi TGTCTC. Questa regione è presente in tutti i membri della famiglia ARF nelle piante studiate finora e permette loro di legarsi alla regione AUX-RE dei geni target, regolandone la trascrizione attraverso il reclutamento di regolatori trascrizionali.
• MR (Middle Region): una parte della proteina con sequenza variabile che contribuisce a conferire all'ARF le caratteristiche di attivatore o repressore della trascrizione, a seconda della sequenza specifica.
• Regione C-terminale: chiamata anche PB, è la regione necessaria per l'interazione dell'ARF con altri membri della famiglia o con proteine appartenenti ad un'altra famiglia chiamata AUX-IAA. In Arabidopsis sono presenti 29 geni che codificano per proteine AUX-IAA.

che codi cano per queste proteine sono posizionati sututti i 5 cromosomi. Come sono organizzate queste proteine AUX-IAA? Hanno 3 domini: - Dominio N-terminale - Dominio DII o degradoma - dominio C-terminale : regione necessaria per l'interazione con i fattori ARF. Le interazioni tra ARF e AUX-IAA sono moltissime e soprattutto con la Classe A degli ARF. Come può l'auxina regolare l'attività dei fattori ARF e perché è importante l'eventuale interazione tra ARF e AUX-IAA? co-repressori Gli AUX-IAA sono dei cioè interagendo con fattori trascrizionali li trasformano in repressori per cui nel caso degli ARF di classe A che sono attivatori della trascrizione dei geni interagiscono con gli AUX-IAA diventano repressori. Questa interazione è regolata dalla concentrazione di auxina. LEZIONE 5 Riassunto: - ARF e AUX-IAA: caratteristiche delle due classi di proteine e loro interazione - Meccanismo attraverso cuil’auxina influenza la trascrizione di determinati set di geni in funzione della sua concentrazione. I fattori ARF e AUX-IAA hanno un ruolo importante nel processo di sviluppo. I PIN svolgono un ruolo nel processo di sviluppo. ARF5 ha un ruolo nello sviluppo dell’embrione. L’auxina regola l’attività dei fattori ARF e l’eventuale interazione tra ARF e AUX-IAA è importante. I fattori AUX-IAA sono codificati da 29 geni in Arabidopsis e agiscono come co-repressori, regolando la trascrizione di geni a valle reclutando dei modulatori della cromatina e agendo come repressori. La parte coinvolta nell’interazione tra AUX-IAA e ARF è la regione C-terminale e il dominio centrale è importante per la regolazione della trascrizione dei target degli ARF.

(come gene reporter) gene che codi ca per un enzima che catalizza l'emissione di luce da un substrato. Ci sono questi geni che sono presenti in molti insetti come quello della lucciola. Nell'esperimento sono state usate piante di Arabidopsis che sono state modificate con il gene della luciferasi a35S. Valle del promotore Ottenute queste piante transgeniche si è andati a vedere se questo promotore era in grado di attivare la trascrizione della luciferasi in Arabidopsis-> Nel pannello in alto si vede che è possibile. Poi hanno usato questo gene reporter e l'hanno clonato a valle del gene che codi ca per un AUX-luciferasiIAA quindi la proteina ottenuta con la luciferasi è una proteina ricombinante in cui la risulta essere fusa in frame con un AUX-IAA. In questo caso è usato un promotore che trascrive questo DNA ricombinante in tutta la pianta. Poi hanno fatto l'esperimento (immagine sotto) cioè hanno trattato queste piante (quelle transgeniche)

con solo la luciferasi equelle transgeniche con il DNA ricombinante in cui la luciferasi era stata clonata downstream ad un gene codificante per un AUX-IAA) con l'auxina->se viene trattata la pianta in cui il promotore 35S esprime/controlla l'espressione dellaluciferasi non succede nulla, tuttavia se vengono trattate le piante in cui la luciferasi forma una proteina ricombinante con l'AUX-IAA c'è una riduzione dell'emissione di luce, quindi vuol dire che la proteina ricombinante è stata degradata. Della parte dx in basso c'è un grafico con la quantificazione di quanto è diminuita l'emissione di luce una volta che vengono trattate queste piante con l'Auxina-> Viene dimezzata. Nel passaggio successivo (immagine a dx) si è voluto riuscire a capire quali domini dell'AUX-IAA destabilizzala proteina ricombinante in presenza di auxina. Quindi quello che è stato fatto è clonare il gene reporter a valle di

pezzi del gene che codi ca per AUX-IAA. C'è sempre il controllo che è il promotore 35S con il gene per la luciferasi poi un costrutto dove è stata DII C-ter clonata la regione e un costrutto in cui è stato clonato solo N-ter e uno con solo DII (degradoma). fi fi fi fi fi fl fi fi fi fi assenza di auxina

In questi costrutti producono delle proteine ricombinanti contenenti la luciferasi che vengono trascritti e tradotti nelle piante, quindi queste piantine transgeniche producono luce in modo molto simile. Tuttavia quando queste piante sono trattate con l'auxina abbiamo il caso in cui il DNA ricombinante contiene il dominio DII abbiamo una diminuzione dell'emissione di luce quindi vuol dire che la presenza di questo dominio rende instabile la proteina (riduzione del 50% della luce).

Poi si è andati a vedere quale aa del DII risultava essere fondamentale per questo tipo di degradazione—>Hanno fatto mutagenesi in cui hanno mutagenizzato i

Quindi reagire con l'ubiquitina ligasi (immagine) presenta una regine chiamata F-box che dà specificità all'interazione con il target. Una volta che il target interagisce con F-box viene ubiquitinato. Nel caso degli AUX-IAA questa interazione con l'ubiquitina ligasi può avvenire solo in presenza di auxina->Questo rende dipendente la degradazione degli AUX-IAA alla concentrazione di auxina nelle cellule.

In Arabidopsis ci sono più di 700 diversi (struttura che dà specificità all'interazione tra substrato e proteina ligasi) per gli AUX-IAA ci sono 4 geni che codificano per 4 diversi F-box e sono:

1. TIR1
2. AFB1
3. AFB2
4. AFB3

Tutti in grado di interagire con gli AUX-IAA e in presenza di auxina procedere con l'ubiquitinazione.

TIR1 è il più studiato->in grado di legare gli AUX-IAA solo se c'è auxina e quando viene riconosciuto l'AUX-IAA come target dall'ubiquitina ligasi.

viene ubiquitinato e viene indirizzato al proteosoma dove viene degradato.

SCHEMI———->ARF interagiscono al livello dei target legando delle sequenze AUX-RE quando la concentrazione di auxina è bassa interagiscono con gli AUX-IAA che sono co-repressori e quindi gli ARF anche quelli che normalmente attivano la trascrizione diventano loro stessi dei repressori della trascrizione.

Quando la concentrazione di auxina si alza succede che l’AUX-IAA può essere riconosciuta a livello dell’ubiquitina ligasi dal dominio TIR1 che è in grado di legare il fattore AUX-IAA. Avvenuto questo legame, viene ubiquitinato e degradato l’AUX-IAA.

Quindi, una volta che questa AUX-IAA diviene instabile e degradato, gli ARF come monomero o come dimero attivano la trascrizione di geni target. Questi fattori trascrizionali ARF in cellule in cui la concentrazione di auxina è elevata possono attivare tranquillamente la trascrizione dei target (target sono un

numero elevato di geni). Come questi complessi di fattori trascrizionali e co-repressori possono agire nelle singole cellule in funzione della concentrazione di auxina? Importante quanti care la concentrazione di auxina nella cellula che media l'attività di questi fattori trascrizionali e quindi il differenziamento. L'auxina è un morfogeno quindi in funzione della concentrazione attiva o reprime l'attività degli ARF. I ricercatori per quanti care l'auxina nelle diverse cellule e come nel tempo rimaneva la concentrazione di questo morfogeno -> per fare questo gli ARF legano delle regioni regolative dei Aux-RE target chiamate quindi sono stati costruiti dei promotori sintetici in cui queste regioni Aux-RE sono state clonate in tandem a monte di fattori trascrizionali come GUS o GFP. Quindi questi DNA ricombinanti in cui la regione regolativa è una sequenza Aux-RE ripetuta più volte sono stati usati per trasformare delle piante diArabidopsis. Quindi l'outcame è che nelle cellule dove c'è alta concentrazione di auxina l'eventuale presenza di fattori trascrizionali ARF sono in grado di attivare la trascrizione dei target perché si legano agli Aux-RE e una volta legati regolano la trascrizione dei geni che stanno a valle, che sono geni reporter. Quindi, con questo promotore sintetico, è stato possibile andare a vedere a livello di tutta la pianta, non solo durante lo sviluppo embrionale, dove questo promotore sintetico è stato attivato, per vedere in quali cellule c'è un accumulo di auxina. Sarebbe stato più semplice usare degli anticorpi contro l