Biologia dello sviluppo vegetale

Biologia dello sviluppo vegetale

Lo sviluppo serve per produrre innanzitutto organizzazione perché l'organismo possa funzionare correttamente, poi serve anche a produrre una certa diversità. Infine assicura la continuità della vita.

I tre cardini dello sviluppo

• Differenziamento: come fa una cellula ad acquisire una determinata forma o una determinata funzione.
• Morfogenesi: l'elaborazione della forma del corpo che può avvenire attraverso diversi processi. Include anche la pattern formation: definizione degli assi, polarità e simmetria.
• Crescita: chiaramente dipende dal numero delle cellule e dalla loro dimensione finale che acquisiscono.

Confronto tra sviluppo animale e vegetale

Quali sono gli aspetti che differenziano lo sviluppo degli animali dallo sviluppo delle piante? Innanzitutto gli animali dopo un po' non crescono più, le piante hanno crescita indefinita. Inoltre, le piante non sono mai identiche tra loro, la plasticità è molto maggiore, gli individui si assomigliano molto poco anche se sono della stessa specie.

Il differenziamento nella maggior parte degli animali avviene durante lo sviluppo embrionale: con l'embriogenesi l'embrione è ormai un mini-organismo con tutte le caratteristiche dell'adulto. Nelle piante, invece, l'embriogenesi è una piccolissima parte dello sviluppo: viene appena abbozzato il corpo dell'individuo, solo dopo che è terminato lo sviluppo embrionale avviene il differenziamento e continua per tutta la vita dell'individuo.

La crescita negli animali è definita, nelle piante no: ciò è alla base della variabilità fenotipica. Tutti gli embrioni di una specie seguono lo stesso piano di sviluppo, ma una pianta rispetto a una pianta della sua stessa specie in base all'ambiente in cui si trova può crescere diversamente.

Totipotenza e meristemi

La crescita indefinita delle piante dipende da cellule staminali totipotenti, esistono nicchie in grado di auto-mantenersi e di produrre una progenie che si differenzia. La totipotenza persiste per tutta la vita della pianta ed è associata ai meristemi: meristema apicale del germoglio e della radice. Non sono gli unici, sono solo i principali. All'interno di queste zone ci sono nicchie staminali e una sottopopolazione delle cellule del meristema, le staminali. I fitomeri sono unità attraverso cui avviene la crescita delle piante; sono costituiti da gemma, foglia, nodo, internodo.

La variabilità fenotipica delle piante è molto ampia; la totipotenza inoltre ha delle implicazioni. Possiamo dire a un meristema di produrre un fiore piuttosto che un frutto, ma possiamo anche sfruttarla per rigenerare tessuti danneggiati o per propagare l'individuo o per creare nuove strutture di riproduzione. Le piante non destinano in anticipo alcune cellule alla linea germinale: il passaggio alla fase riproduttiva avviene solo nel passaggio alla vita post-embrionale dell'individuo.

Cicli vitali delle piante

I cicli vitali delle piante sono di vario tipo, la stragrande maggioranza delle piante terrestri ha ciclo aplo-diplonte, comprende una generazione aploide che di solito gli animali non hanno. L'organismo della fase aploide prende il nome di gametofito, quello della fase diploide sporofito.

Crescita e organogenesi

Le piante hanno una costrizione: hanno una parete rigida che ne costringe le dimensioni. Le pareti cellulari sono appiccicate tra di loro dallo strato più esterno della parete cellulare che si chiama lamella mediana, la migrazione tra le cellule delle piante quindi non è possibile, sono appiccicate tra loro dal momento in cui si formano per divisione mitotica. Per dare forma a un organismo l'unico modo che la pianta ha è di regolare i piani di divisione, modificare la forma attraverso un incremento di divisioni localizzate e un particolare orientamento delle divisioni stesse. Se una cellula si divide in modo periclinale, l'epidermide sovrastante dovrà dividersi in modo anticlinale.

Divisione periclinale significa che il piano di divisione è parallelo alla superficie dell'organo, anticlinale invece avviene secondo un piano perpendicolare alla superficie dell'organo. Parlando di crescita ci chiediamo quante divisioni avvengano, dove e con che ritmo. I due processi vanno avanti in parallelo: mentre produciamo l'abbozzo di un organo, gli diciamo anche cosa dovrà diventare, se foglia o fiore. Le strutture in fase di sviluppo esprimono geni specifici di identità, di solito sono geni di natura regolativa, un numero limitato di fattori di trascrizione.

Differenziamento cellulare

Nel differenziamento cellulare la divisione è asimmetrica, ciascuna divisione origina due cellule figlie diverse, che intraprendono cammino differenziativo diverso: una diventa magari cellula del mesofillo fogliare, l'altra elemento conduttore del floema, oppure una rimane staminale e l'altra no. Indipendentemente da ciò, la divisione che le ha generate è asimmetrica, non tanto riferita alla forma ma alla funzione.

Divisione asimmetrica

Cosa produce una divisione asimmetrica? Possono essercene di diversi tipi ma distinguiamo due grossi gruppi: meccanismi di divisione guidati da determinanti intrinseci o dettati da determinanti esterni.

Nel caso di un determinante intrinseco la cellula madre contiene una molecola qualsiasi determinante dell'identità cellulare. Una cellula figlia conterrà il determinante, l'altra no. I determinanti di solito sono fattori di trascrizione ma possono essercene altri. Acquisizione per discendenza diretta si chiama per lineage.

Meccanismi estrinseci dipendono dall'ambiente; la cellula madre può essere soggetta a segnali esterni, oppure le cellule figlie sono soggetti a questi determinanti. Quindi è la posizione della cellula a determinarne lo sviluppo. Il caso più comune di segnali estrinseci sono segnali che provengono da un'altra cellula in contatto con quella che riceve. Acquisizione di un certo destino per posizione si dice positional information, quella identità non è determinata intrinsecamente, la cellula ce l'ha perché si trova in quella posizione. Se mettessimo una cellula che si trovava in un posto diverso, se riceve quel determinante cambia piano di sviluppo. È il contesto che guida lo sviluppo in questo caso.

Ciò che accomuna questi due aspetti è il fatto che debba esistere una molecola organizzante che viene distribuito in modo non omogeneo. Questa molecola è chiamata morfogeno. Nella maggior parte dei casi la cellula acquisisce la sua identità per la posizione in cui si trova e non per lineage. La concentrazione più o meno elevata di un morfogeno è in grado di dire a una cellula cosa deve diventare.

Nelle piante l'auxina è il morfogeno principale. Deve formare un gradiente di concentrazione stabile, il morfogeno agisce direttamente sul piano dello sviluppo, influenza l'espressione genica. La risposta della cellula dipende dalla concentrazione dell'ormone, l'auxina è il principale durante l'embriogenesi ma probabilmente anche dopo. L'auxina è un acido debole, l'acido indolacetico è la forma più abbondante; agisce formando un gradiente stabile nel tempo, può formare gradienti anche molto complessi, in alcune posizioni può esserci un eccesso in altre no. Può essere trasportata efficientemente all'interno della pianta. Dove ci sono accumuli si formano i meristemi.

Modelli di studio: riso e Arabidopsis

Il riso è un modello utile per lo sviluppo delle piante siccome c'è un grande interesse agronomico. Capire come cresce può avere impatto immediato sulla coltivazione. Inoltre è rappresentativo delle monocotiledoni, invece Arabidopsis è una dicotiledone. Lo sviluppo delle monocotiledoni e delle dicotiledoni può essere molto diverso.

Arabidopsis è comoda perché è piccola, ha un ciclo vitale breve, le piante non vanno incrociate perché si autofeconda e produce centinaia di semi. Il fatto che produca tanti semi è utile per lo screening genetico o per studi statistici. Inoltre, sono importanti le sue caratteristiche molecolari: il suo genoma è di piccole dimensioni (125 Megabasi), è stato completamente sequenziato nel 2000 (primo genoma vegetale ad essere sequenziato, secondo in generale, il primo è stato quello umano, il secondo è stato quello di Arabidopsis). Può essere resa transgenica. È ermafrodita.

Il riso Oryza sativa ha caratteristiche analoghe: è abbastanza piccola come pianta, ha ciclo vitale breve e si autofeconda producendo decine di semi. Cresce abbastanza bene in laboratorio. È stato il secondo genoma vegetale sequenziato, nel 2002. È facilmente trasformabile, ci vuole solo un po' di tempo. È ermafrodita.

Studio dei geni nello sviluppo

Per studiare i geni che regolano lo sviluppo è importante avere delle informazioni basilari; normalmente un biologo dello sviluppo si appoggia allo studio di mutanti, organismi il cui corredo genetico è stato mutato. Paragoniamo un individuo wt a uno che ha sviluppo alterato a causa di una o più mutazioni.

Esistono una serie di problematiche legate a questo approccio:

• Ottenimento di mutanti che ci forniscano informazioni.
• Caratterizzare le mutazioni e capire cosa causano all'interno della pianta.

Metodi per ottenere mutanti

Il tasso di mutazione spontanea è estremamente basso, bisogna indurre la mutagenesi attraverso sistemi fisico-chimici.

• Raggi X e UV: Raggi X e UV sono radiazioni ad elevata energia, se la cellula ne viene investita il suo DNA viene danneggiato attraverso la produzione di dimeri di timina. Bombardiamo il DNA con i raggi ma non possiamo individuare un gene preciso e mutagenizzarlo, le mutazioni sono casuali quindi la maggior parte delle mutazioni non avranno effetto fenotipico.
• Mutageni chimici: Stesso discorso per i mutageni chimici come etil-metan-sulfonato o altri; lui fa sì che la guanina venga riconosciuta come adenina, quindi verrà appaiata ad una timina: mutazione puntiforme. Di nuovo la mira è scarsa, non siamo in grado di mirare un singolo gene e un trattamento come questo può introdurre diverse centinaia di mutazioni nello stesso momento. Di solito questi mutageni si usano contro intere popolazioni, il trattamento iniziale mutagenizza il genoma ma non si sa dove, infine si cercherà di risalire a un determinato gene.
• Inserzione: La mutagenesi per inserzione inizia ad essere più interessante: è mediata da un vettore biologico, Agrobacterium tumefaciens, un batterio del suolo ubiquitario capace di infettare le cellule vegetali. Causa il tumore del colletto delle piante, di solito anche se camminiamo per strada, anche a Milano, possiamo notare platani, olmi infettati da questo batterio. Il tumore viene causato dal trasferimento di DNA da batterio a pianta. Succede che in risposta ad una ferita, le piante producono molecole fenoliche, in particolare acetosiringone, un composto che viene percepito dal batterio e attiva l'espressione di una serie di geni necessari per l'attacco del batterio stesso: il batterio percepisce la pianta danneggiata e attiva i geni necessari per attaccarla. Questi geni producono proteine che generano una sorta di canale tra batterio e cellula vegetale, creano un passaggio tra parete del batterio e parete della cellula, così che una porzione di DNA batterico, il T-DNA riesce ad arrivare alla cellula ospite. Questa porzione di DNA è responsabile del tumore, codifica per i geni del tumore del colletto. T-DNA significa DNA transfer, DNA di trasferimento. La cosa interessante è che il T-DNA viene integrato stabilmente nella pianta ospite, che diventa una sorta di pianta transgenica. È interessante perché possiamo usare Agrobacterium per veicolare DNA all'interno della pianta ospite; LB e RB sono due regioni del plasmide T, tutto ciò che sta tra quelle regioni di DNA viene passato alla pianta ospite. Tra queste regioni ci sono tutti i geni necessari alla formazione di quel tumore, il batterio altera i processi di sviluppo della pianta, genera una sovra-proliferazione, un meristema che continua a proliferare in cui il batterio si può annidare. Ci sono geni che servono alla biosintesi di ormoni vegetali, biossine e citochinine, sono geni batterici ma che hanno effetto sul metabolismo della pianta e inducono la produzione di sostanze tipo auxina. Quando il batterio passa il T-DNA quindi induce prima proliferazione anomala, poi pensa a mangiare: troviamo geni necessari alla biosintesi di opine, sono derivati di amminoacidi che al batterio piacciono. Il sistema di proliferazione cellulare e biosintesi di opine ormai è parte integrante della pianta, le informazioni genetiche necessarie rimangono nella pianta anche se il batterio dovesse morire. Il punto è che in laboratorio la zona del plasmide T può essere ingegnerizzata e disarmata: si toglie al batterio la capacità di indurre il tumore, si toglie il gene per la biosintesi di opine, gli togliamo tutte le porzioni di DNA che servono ad alterare lo sviluppo della pianta. Il plasmide rimane virulento, ma non trasferisce più quei geni che alteravano lo sviluppo della pianta. Il vantaggio è che ci possiamo mettere noi quello che vogliamo; tra il bordo sinistro e il bordo destro ci mettiamo quello che vogliamo per introdurre geni di interesse nella pianta ospite. Possiamo ad esempio inserire un marcatore di selezione, come la resistenza ad un antibiotico: così possiamo individuare la pianta transgenica della popolazione. Il batterio trasferisce il t-DNA ma coi nostri geni di interesse. Arabidopsis è un modello trasformabile: la sua trasformazione mediata da Agrobacterium è estremamente semplice, la trasformazione avviene per immersione delle infiorescenze contenente una coltura di Agrobacterium ingegnerizzato. I fiori ne vengono immersi, il batterio aderisce ai fiori, penetra all'interno dei carpelli e infetta le piante, con una certa frequenza infetta il gametofito femminile: quel DNA entra nella linea germinale e può essere passato a tutte le piante della linea. Se abbiamo un marcatore di selezione e il T-DNA si è inserito nel gametofito femminile, allora quella linea transgenica stabile può essere selezionata. Se mettiamo un antibiotico in piastra, germinano solo le piantine che hanno ricevuto il T-DNA. Questo è il metodo con cui vengono ottenute le piante transgeniche di Arabidopsis, con altre piante si usano metodi diversi. Il t-DNA può essere veicolato all'interno del genoma, ma se si infila all'interno dell'esone interrompe la sequenza codificante di un gene, creiamo un knock-out, aboliamo la funzione genica. Si chiama mutagenesi per inserzione perché veicoliamo l'inserzione di una sequenza nota di DNA. La differenza con la mutagenesi chimica è che generavamo piccole mutazioni puntiformi difficili da trovare, qui il t-DNA è anche di grosse dimensioni e riusciamo a trovarlo e quindi risalire al gene mutato dall'inserzione. Non possiamo comunque guidare il t-DNA, possiamo facilmente rintracciare il gene di interesse ma non possiamo guidarlo a priori verso una determinata zona, l'inserzione è casuale. Tuttavia, a differenza della mutagenesi chimica che introduce 700-2000 lesioni per genoma, Agrobacterium veicola nella pianta ospite un numero limitato di copie di t-DNA, ¾ copie. L'inserzione del t-DNA a livello cromosomico privilegia le regioni trascritte perché tendono ad essere più aperte ed accessibili, quindi è vantaggioso anche perché colpiamo geni tendenzialmente attivi. Nel t-DNA possiamo metterci promotori forti costitutivi, elementi di regolazione che possono influenzare la trascrizione genica, silenziatori, enhancer etc. Se mettiamo soltanto un marcatore di selezione possiamo individuare il mutante, ma se veicoliamo gene di interesse e marcatore di selezione possiamo produrre una pianta transgenica che abbia caratteristiche diverse dal wild type; possiamo indurre la produzione di pigmenti a livello del frutto (pomodoro nero, golden rice, possiamo rendere le piante resistenti ai patogeni..).
• Nucleasi sito specifiche: CRISPR-Cas: I sistemi programmabili uniscono tutte le caratteristiche favorevoli alla mutagenesi per inserzione a quelle favorevoli della mutagenesi chimica. Possiamo generare mutazioni puntiformi e guidarle dove vogliamo: prendiamo la mira, prima di fare l'esperimento sappiamo già dove finirà la mutazione. La caratteristica che accomuna le tecnologie di editing è che possono usare nucleasi, enzimi che tagliano in DNA in modo sito-specifico. Rispetto a un enzima di restrizione è diverso perché l'enzima di restrizione fa a pezzi il DNA, lo digerisce tutto. Invece queste nucleasi sono in grado di tagliare il DNA in un unico punto specifico, noto. È importante l'aspetto di taglio di DNA, dal momento in cui viene tagliato di solito subito dopo vengono innescati dei meccanismi che portano alla riparazione. Si innesca un sistema di taglio-riparazione-taglio-riparazione- finché o il sistema di riparazione o quello di taglio fa un errore, di solito l'errore lo fa il sistema di riparazione. Se inseriamo o togliamo un nucleotide da una sequenza codificante ci sarà un frameshift la proteina non si può formare. Ma se la correzione avviene attraverso la NHEJ possiamo ottenere mutanti attraverso il sistema taglio mirato-riparazione sbagliata. Stabiliamo a priori dove sarà la mutazione. Riparazione attraverso ricombinazione omologa: il sito aperto può essere corretto perché l'altro cromosoma funge da stampo. Oppure è l'operatore che fornisce un template di correzione che può essere inserito a livello della lesione generando editing genomico. Casi di questo tipo nelle piante non sono molto frequenti perché non correggono le lesioni per ricombinazione omologa, nelle piante la ricombinazione omologa è estremamente inefficiente.