Biologia dello sviluppo vegetale

lunedì 23 novembre 2020

Lezione 3 - embriogenesi

Doppia fecondazione, le due cellule spermatiche portate dal tubetto pollinico

attraverso il micropilo vanno a fondersi una con la cellula uovo a dare l’embrione

(2n) e una con la cellula centrale (2n) a dare l’endosperma (3n). L’endosperma è

molto importante perchè è il tessuto nutritivo per l’embrione e permetterà il suo

sviluppo all’interno dei tessuti materni (tegumenti materni che permettono di far

rimanere il seme in uno stadio quiescente finche non si trova in una condizione

favorevole per la germinazione).

Embrione animale racchiude già delle caratteristiche basilari del piano del corpo

(ben definiti gli assi di polarità) e ci sono già abbozzi della maggio parte degli organi

e sistemi vs embrione vegetale decisamente più semplice, diversa strategia

biologica data dal fatto che le piante sono organismi a crescita continua o indefinita

e quindi capaci di dare origine a nuovi organi durante tutta la vita adulta grazie alla

presenza di gruppi di cellule staminali residenti nei meristemi, pertanto non hanno

bisogno di abbozzare organi necessari alla vita adulta durante lo sviluppo

embrionale.

-Sviluppo embrionale

Embrione globulare

Embrione a cuore

Embrione a torpedine

Embrione cotiledonare (maturo)

Lo sviluppo dell’embrione è lungo un asse epico-basale (calazzale-micropilare), il

numero di cellule aumenta quindi abbiamo divisione cellulare continua, complessità

crescente del numero di cellule formate dalla’embrione partendo dallo zigote

all’embrione maturo. Alla fine dello sviluppo osserviamo anche una simmetria

bilaterale.

Quando una cellula spermatica si fonde con la cellula uovo si forma lo zigote e la

prima divisione dello zigote è una divisione asimmetrica trasversale che ci da un

pattern longitudinale. Si forma una piccola cellula apicale e una lunga cellula basale.

La divisione asimmetrica produce due cellule che adottano destini cellulari diversi.

La parte apicale è con citoplasma denso e sede di un intensa sintesi proteica invece

la parte basale contiene il vacuolo centrale che ne permette la distensione. La

cellula apicale darà origine all’embrione e la cellula basale darà origine al

sospensore (6-9 cellule) e all’ipofisi tramite divisione perpendicolare all’asse

dell’embrione. Il sospensore connette l’embrione al sistema vascolare della pianta

madre. Dopo lo sviluppo il sospensore entra in morte programmata e l’unica cellula

che rimane in vita è l’ipofisi che è la cellula più apicale del sospensore.

-la cellula uovo è polarizzata, quindi divisione simmetrica per polarità intrinseca

quindi dovuta a quello che è contenuto nella cellula. All’interno della cellula uovo c’è

la segregazione dei determinanti da un lato apicale e basale che permettono che il

fuso mitotico venga allineato in un determinato modo e porta alla divisione

asimmetrica.

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Nella cellula apicale 1 cellula c’è la prima divisione longitudinale che porta a 2

cellule, a 4 cellule la seconda divisione longitudinale, passando da 4 a 8 abbiamo

una divisione trasversale che forma la parte apicale (che origina cotiledoni,

meristema apicale del germoglio) dell’embrione e la parte basale (origina meristema

apicale della radice e i tessuti della radice). Queste 8 subiscono una divisione

periclinare e abbiamo embrione a 16 cellule, una delle fasi più importanti dello

sviluppo. Avremo uno strato esterno di 8 cellule e 8 cellule interne. La parte più

esterna è il primo tessuto che si forma nell’embrione detto protoderma che è ancora

un tessuto meristematico però con un grado di differenziamento un pò più avanti

rispetto alle altre cellule. Le 8 cellule interne vengono dette tessuto interno. Inoltre le

cellula più apicale del sospensore diviene l’ipofisi importante perché darà origine

alla radichetta quando l’embrione germina. Dopo l’embrione a 16 cellule si passa

all’embrione globulare in cui le divisioni continuano e l’embrione aumenta in numero

cellulare sia nella parte interna che esterna. Quindi nello stadio globulare abbiamo il

differenziamento dei primordi dei principali tipi di tessuto, stabilimento dell’asse

radiale e acquisizioni di simmetria bilaterale.

-abbiamo una fase di transizione tra globulare e cuore e poi formazione del cuore.

Fase di transizione caratterizzata dal fatto che l’ipofisi si differenzia (meristema

radicale) e inoltre avviene l’inizio dell’allungamento dell’embrione e si inizia a vedere

abbozzo di cotiledoni.

-stadio di cuore l’embrione si allunga a causa della distensione cellulare, l’asse

longitudinale e radiale è ben definite e bilateralità ben visibile.

-stadio torpedine intermedio

-stadio maturo con formazione in mezzo ai cotiledoni dell’apice vegetativo

(meristema apicale del germoglio), ulteriore allungamento dell’asse embrionale e dei

cotiledoni dovuto sia a divisione e distensione cellulare. Abbiamo anche formazione

del centro quiescente e delle cellule della columella (meristema della radice).

L’embrione occupa tutto lo spazio disponibile del seme. Abbiamo presenza di

piccole bozze fogliari.

L’embriogenesi deve essere studiata sia attraverso lo sviluppo lungo l’asse

longitudinale ma anche lungo l’asse radiale. Lungo asse longitudinale abbiamo

cotiledoni e asse embrionale, abbiamo meristema del germoglio al centro dei

cotiledoni e in posizione più basale il meristema radicale. Lungo l’asse radiale

abbiamo più esternamente il protoderma, il meristema fondamentale e il procambio.

-meccanismi coinvolti nello sviluppo

Uso di mutanti per trovare problemi di sviluppo, confrontare il mutante con una

pianta wt e comprendere i meccanismi che stanno alla base dello sviluppo

compromessi dalla mutazione.

Mutante yoda, lo sviluppo embrionale è compromesso con mancanza di bilateralità,

non si distingue bene ne il sospensore ne l’embrione stesso ma solo un accumulo di

cellule. Yoda è un gene che codifica per una proteina simile alla proteina Ste11p

questa è una MAPKK chinasi necessaria per la divisione asimmetrica. Es. a partire

da una collezione di 13000 piante mutagenizzate tramite metodo chimico, vennero

isolate 13 linee indipendenti che segregavano embrioni senza un sospensorio ben

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formato. (Genetica diretta). Yoda è implicato nello sviluppo embrionale. Si sono

andate a guardare le varie fasi di sviluppo, si nota che in una pianta mutante yoda

non abbiamo la prima divisione asimmetrica trasversale ma la divisione è

simmetrica. Quindi si è capito che yoda era coinvolto nelle prime fasi dello sviluppo

embrionale e più specificatamente nella prima divisione dello zigote. A sviluppo più

avanzato vediamo che yoda abbiamo accrescimento cellulare della parte

embrionale ma il sospensore non si divide. Divisione wt 13 micron cellula apicale 61

micron quella del sospensore invece in yoda l’apicale era 14 micron e quella del

sospensore 16 micron. Quindi divisione simmetrica nel mutante. In assenza di yoda

non avviene la divisione asimmetrica.

-si possono utilizzare dei marcatori specifici per caratterizzare l’identità cellulare,

quindi identificare un tipo di cellula. Inserendo nelle piante un marcatore specifico

per il sospensore ptrak276s (promotore specifico con gene reporter GUS) si vede

che nella pianta wt questo è espresso invece nella pianta yoda non esprimeva il

promotore e quindi non presentava cellule identificate come sospensore. Nel

mutande yoda non avviene divisione asimmetrica e questo porta alla perdita del

destino cellulare della cellula basale che avrebbe dato il sospensorio. 89% mancata

espressione.

Un’altra mutazione del gene ssp portava a divisione simmetrica ma era leggermente

diversa la divisione della cellula basale che è leggermente più lunga dell’apicale.

Abbiamo però mutanti diversi, in alcuni c’è mancanza di differenziamento del

sospensore in altri ci sono piani errati di divisione ma che non portano a perdita di

differenziamento. Si hanno diversi fenotipi perche le mutazioni chimiche su ssp

portano a produrre proteine con mutazioni puntiformi e che quindi possono essere

più o meno funzionali (es. se avvenivano in domini funzionali si osservava totale

assenza di simmetria). Utilizzando un marcatore per il sospensore SUC3 in piante

wt si osserva un segnale dal sospensore invece in pianta mutante ssp non

visualizziamo il marcatore per mancata espressione del marcatore nel sospensore.

Isolando ssp e facendo analisi di espressione a livello di mRNA si è visto che era

espresso nel polline a livello delle cellule spermatiche quindi espresso solo nella

parte riproduttiva maschile. Mrna di ssp è localizzato a livello delle cellule

spermatiche, studi di proteina hanno identificato ssp a livello dell’embrione. Durante

la fecondazione e quindi la fusione di una cellula spermatica e la cellula uovo

l’mRNA di ssp presente nel gamete maschile viene rilasciato all’interno della cellula

uovo e cosi abbiamo traduzione della proteina nell’embrione. Quindi si può parlare

un controllo paterno sulla prima divisione dello zigote. Se ssp non c’è non abbiamo

mRNA e quindi non abbiamo proteina necessari alla prima divisione nell’embrione.

3 mercoledì 18 novembre 2020

Lezione 2

Gametogenesi e fecondazione (in piante a fiore)

Modello di studio= arabidopsis thaliana, angiosperma, dicotiledone, pianta a fiore.

La fecondazione avviene tramite un’interazione tra una parte maschile con quella

femminile.

-ciclo vitale delle angiosperme

Abbiamo un ciclo vitale aplodiplonte cioè il ciclo è costituito da due fasi o

generazioni differenti. La generazione sporofitica e quella gametofitica, queste due

sono differenti perché lo sporofito è diploide e produce le spore aploidi per meiosi

invece il gametofito è apolide e deriva dalle spore per mitosi, esso produce i gameti

per mitosi. Due gameti si fondono (fecondazione) e poi daranno lo zigote e poi lo

sporofito per mitosi.

-strutture riproduttive

-Parte maschile (androceo):

Stame :

Filamento

Antera

Granuli pollinici

-Parte femminile (gineceo):

Carpello

Stigma

Stilo

Ovario

Ovuli

Sviluppo dell’ovulo che porterà allo sviluppo dei gameti femminili viene suddiviso in

2 fasi:

1. Megasporogenesi

2. Megagametogenesi con formazione di gametofito e di conseguenza gameti

1. Gli ovuli si trovano all’interno del carpello, in arabidopsis abbiamo due carpelli

fusi che danno origine al pistillo. All’interno del carpello abbiamo la placenta nel

centro e gli ovuli protudono da essa come strutture finger-like (strutture 2n).

Questi ovuli sono distinti in 3 regioni: nucella, callazza e funicolo. All’interno

della nucella una cellula diploide si differenzia e da origine alla cellula madre

della megaspora (questa diventa più lunga tramite distensione, il nucleo e

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nucleo sono più voluminosi) questa andrà incontro a meiosi e si formeranno 4

spore. Solo una di queste 4 spore, quella più callazzare (più interna)

sopravviverà e le altre 3 degenerano.

2. Quella che sopravvive entra nella megagametogenesi. Questo processo è

caratterizzato da diversi step, la spora sopravvissuta è detta megaspora

funzionale e questa va incontro a 3 cicli di mitosi e formerà il gametofito

femminile (8 nuclei ma 7 cellule), nella parte micropilare ci sono 2 cellule

sinergidi, 1 cellula uovo, poi abbiamo una cellula centrale diploide costituita da

due nuclei polari che si fondono, nel lato callazzare abbiamo 3 cellule antipodali.

Il vero e proprio gamete è la cellula uovo e le altre cellule sono cellule accessorie

che hanno un ruolo nei processi di fecondazione. Il gamete è contenuto dal

sacco embrionale e quest’ultimo è avvolto dai tegumenti. Il funiculo connette

l’ovulo alla pianta madre, serve al passaggio di nutrienti dalla pianta madre al

gametofito. Fin da quando inizia la differenziazione e determinazione della

cellula madre della megaspora c’è anche lo sviluppo dei tegumenti che

nell’ovulo maturo saranno 2 esterni e 2 interni e un endotelium che delinea il

sacco embrionale.

Sviluppo dei granuli pollinici (formati da una cellula vegetativa e una generativa)

Avremo due processi:

1. Microsporogenesi

2. Microgametogenesi

1. All’interno delle antere ci sono 4 sacchi formati da una parte più esterna detta

epidermide, poi l’endotessio, il middle layer e il tappetum che serva per dare

nutrimento al sacchetto pollinico in cui si sviluppano i granuli pollinici. Nella

prima fase all’interno dell’antera abbiamo la formazione della cellula madre delle

microspore (2n) questa tramite meiosi forma 4 spore e a questo punto nel

tappetum viene prodotto un enzima che è capace di degradare il callosio e

quindi degrada il callosio intorno alle microspore e le libera. (Vs gameti

femminili, qui non degenera nessuna spora)

2. Una volta liberate le microspore vanno incontro a 2 mitosi è formerà il

gametofito formato da una cellula vegetativa che darà origine al tubetto pollinico

e una generativa che darà origine alle cellule spermatiche (2). Alcune specie

come arabidospis saranno in questo stato già nelle antere altre piante invece lo

diventeranno con la formazione del tubetto pollinico.

Grazie a DAPI (4,6-diamidin-2-fenilindolo), colorante organico fluorescente che lega

fortemente regioni del DNA ricche in sequenze A-T, è possibile seguire le diverse

fasi di sviluppo del polline. Oppure possiamo utilizzare geni marcatori.

Nel caso dell’ovulo si possono utilizzare marcatori specifici per i diversi tipi di cellule

che ci fanno differenziare i diversi tipi cellulari del gametofito.

-GENI REPORTER, permettono di analizzare l’espressione di un gene di interesse. Il

gene reporter ci permettono anche di seguire una fase di sviluppo specifica. Il gene

reporter più utilizzato per le piante è il gene reporter GUS che viene utilizzato quei

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sempre per l’analisi del promotore, per vedere se il promotore è attivo o meno. Il

gene viene evidenziato da una colorazione blu perché questo gene codifica per un

enzima (beta-glucuronidasi) che a contatto con un substrato specifico riesce a

metabolizzarlo e a darci questa colorazione. Viene trasferito nel genoma della pianta

tramite un plasmide Ti nel cui Tdna abbiamo un promoter X che vogliamo studiare

con a valle un gene GUS che ci permette di verificare quando il promoter sarà attivo

perché trascriverà GUS. (es. promotore attivo nell’ovulo + GUS, studio sviluppo

ovulo).

Altro gene reporter è GFP proteina identificata nella medusa, che se eccitata da una

radiazione nel campo dell’ultravioletto ma anche nel visibile ed ammette una

radiazione di colore verde. Attraverso di inserimento di piccole mutazioni nella

proteina si sono ottenuto proteine fluorescenti di colori diversi. Permette di fare

imaging in vivo. La proteina GFP può essere usata per studiare espressione

promotore (promotore del gene X - gene reporter GFP) oppure per sapere la

localizzazione specifica delle proteine (promotore del gene X- sequenza codificante

del gene X + gene reporter GFP)

-fecondazione

I granuli pollinici dell’antera vengono rilasciati e cadano sopra lo stigma e formano

un tubetto pollinico (generato dalla cellula vegetativa) che si approfonda nello stilo e

poi nell’ovario. Il tubetto raggiunto l’ovulo entra e rilascia le 2 cellule spermatiche di

cui, 1 si fonde con la cellula uovo formando lo zigote e l’altra si fonde con la cellula

centrale formando l’endosperma (3n). Quindi si forma il seme in cui abbiamo parte

esterna di tegumenti di origine materna, endosperma (formato sia da madre che

padre) e zigote.

1° esperimento su Torenia mostrano che spostando l’ovulo il tubetto lo segue.

Quindi qualcosa prodotto dalla’ovulo serve da segnale per il tubetto pollinico per

guidarlo verso l’ovulo.

2° esperimento tramite ablazione tramite laser che permette di eliminare in modo

specifico un tipo di cellula, quindi eliminarono una per una le cellule nel sacco

embrionale e videro come questo influiva sul tubetto pollinico. Senza cellula uovo e

cellula centrale il tubetto pollinico arrivo all’ovulo. Se si eliminano le sinergidi il

tubetto pollinico non viene più attratto. Se si elimina solo una sinergide il tubetto

viene attratto. Quindi sono le sinergidi che attraggono e guidano il tubetto. Quando

avviene il rilascio delle cellule spermatiche sia ha morte di una delle due cellule

sinergidi per scoppio del tubetto e la sinergide rimasta non attrae più altri tubetti per

evitare la polispermia.

Il segnale che emettono le sinergidi è dato da un gruppo di geni altamente espressi

nelle cellule sinergidi. Ex. Si è isolato le cellule sinergidi e si è sequenziato il genoma

per vedere quali geni erano espressi in queste cellule e hanno visto che c’era una

famiglia genica rappresentativa ossia molto espressa. CRP- cysteine rich

polypeptides, in particolare LURE1 e LURE2. Per dimostrare che questi fossero i

responsabili del direzionamento del tubetto si sono sintetizzati questi peptidi

segnale e si sono rilasciati in una piastra di Petri in cui c’erano granuli pollinici e si

notava che essi producevano tubetto anche in assenza di ovuli.

3 mercoledì 18 novembre 2020

ex. Si sono isolati diversi mutanti per dif1 che quindi non producono gametofito

femminile. Ci sono 5 mutanti diversi in cui abbiamo lo stesso fenotipo. Questo ha

reso possibile la comprensione e individuazione dei geni che permettono la

formazione del gametofito femmi