Biologia dello sviluppo vegetale

Studio dei Mutanti

Importante per capire i meccanismi genetici e molecolari che regolano lo sviluppo. Condizioni WT danno fenotipo piante WT. L'assenza o overpresenza di un gene dà fenotipi mutanti. Ottenimento mutanti, si opta per mutagenesi indotta in quanto il tasso di mutazione in natura è molto basso. Quindi i mutanti si possono ottenere per:

• Mutagenesi chimica, indotta es. EMS un composto chimico che ha un effetto del genoma, esso cambia la capacità di appaiamento delle basi cioè quando utilizza la guanina non si lega alla citosina ma ad una timina e questo con le successive replicazioni porta a mutazione puntiforme che porta a incorporare aa diversi. Questa sostanza è utilizzata con i semi. Nella T1 non si nota mutazione ma in T2 si possono osservare genotipi mutanti.
• Mutagenesi fisica, utilizzo di raggi x (ionizzante) o uv (causa la produzione di dimessi di T) e a seconda di intensità di questi raggi avvengono dei cambiamenti.

16 novembre 2020

Livello del DNA che poi vengono riparati dal sistema di riparazione del DNA e che causano delle piccole mutazioni puntiformi all'interno del genoma che possono portare a mutazione di geni e quindi mutare la sua funzionalità.

Mediante inserzione di Tdna o di elementi trasponibili, possibile grazie all'utilizzo di agrobacterium tumefacines, esso ha la capacità di infettare le piante attraverso la trasmissione di un segmento di DNA, definito T-DNA che penetra all'interno delle cellule vegetali integrandosi con il genoma. (Mutagenesi per inserzione). Questo batterio trasforma le cellule della pianta a livello di una ferita, causando crescita e divisione cellulare autonome e quindi insorgenza di un tumore (tumore del colletto).

All'interno del batterio c'è un plasmide-ti (tumor inducing) che contiene una porzione di T-dna con un confine destro e sinistro al cui interno troviamo geni per la sintesi di auxina, citochinina (che promuovono

La divisione cellulare) e opina(promuovono crescita batterio). all'esterno del t-dna abbiamo vir genes, geni per il metabolismo di opine, origine di replicazione. L'acetosiringone composto fenolico prodotto dopo la lesione attiva i geni di virulenza all'interno del plasmide, questi geni Vir permettono di tagliare ai lati dei due confini e poi il t-DNA viene trasportato all'interno della pianta e poi nel nucleo dove si integra. Questo plasmide ti si può ingegnerizzare e cioè modificare la regione contenuta tra i due confini e metterci dei geni importanti per la selezione delle piante trasformate quindi un marker di selezione o geni di interesse. Se il t-dna si integra all'interno di un gene ne interrompe l'attività. Il metodo più semplice per la trasformazione vegetale è stato messo a punto per arabidopsis tramite immersione (dipping) di infiorescenze in una sospensione di agrobacterium, contenente un particolare detergente.

(silwet cheabbassa la tensione superficiale e permette entrata del batterio) seguita dasuccessiva selezione diretta dei semi trasformati che vengono messi a germinare suopportuni terreni selettivi. L'inserzione del t-dna a livello genomico è causale, alivello del gene è random e a livello cromosomico privilegia le regioni trascritte.Inserzione a livello di un introne porta a non trascrizione del T-dna perché introneviene eliminato dallo splicing. Inserzione in esone porta a KO perché interrompe unaregione codificante del gene e il gene viene spento. Inserzione a livello delpromotore possiamo avere Tdna che si inserisce in una zona che viene legata dalfattore di trascrizione che quindi non si lega oppure si porta in una regione che nonlega TF quindi la funzione del promotore rimane uguale. Mutazioni molto piùfrequenti con metodi chimici e fisici.-CRISPR CAS 9, enzima batterico che ci permettere di sapere quale porzione delgenoma stiamo mutando

perché quest’enzima sfrutta un guide RNA che ècomplementare a una parte del genoma molto specifica e una volta riconosciuta lacas9 induce un taglio che poi viene riparato dal sistema di riparazione che creamutazione.Utilizzo mutanti:Genetica diretta, dalla mutazione al geneGenetica inversa, dal gene al fenotipo3 lunedì 14 dicembre 2020Lezione 8Ruolo auxina nella formazione della radiceMutante PIN (geni ridondanti) si vede perdita di simmetria e apparato radicale malformato.Mutanti di biosintesi (geni YUC) mostra difetti di sviluppo dell’apparato radicaleLa posizione dei PIN ci da indicazione sulla direzione del flusso dell’auxina e il luogodi accumulo. Pin si posiziona nella membrana più basale della cellula quindi flussodall’alto verso il basso. Osservato l’accumulo di auxina tramite marcatore DR5_GFP.Guardando la radice si vede segnale di accumulo nelle cellule del QC e poi verso ilbasso verso la columella. Quindi accumulo di

auxina nell'apice radicale.-Cosa accade se perturbo il flusso?

Esperimenti con marcatore DR5_GUS permette di individuare accumulo di auxina. Accumulo in piante wt si vede al livello del QC e nella parte apicale della radice, dopo supplemento del terreno con NPA (che inibisce il trasporto di auxina) non avviene trasporto di auxina e questa viene accumulato all'interno delle cellule e si inibisce in trasporto. Se si crescono radici in questo terreno trattato con NPA si osserva che l'auxina si accumula oltre che nel QC e nell'apice anche nel cortex, endodermide quindi distribuzione scorretta. Anche lo sviluppo dei piani mitotici è alterato passando da anticlinali a paralleli e la radice cresce in maniera diversa. L'accumulo di auxina nella situazione WT ha una corrispondenza con la posizione degli statoliti. E quindi dove c'è auxina c'è accumulo di amiloplasti. Accumulo di amiloplasti errato nelle piante in presenza di NPA che daranno

Una crescita errata della pianta. Se aumento la concentrazione di NPA c'è un fenotipo ancora più forte, curvatura accentuata della radice per presenza degli statoliti ai lati della radice ma non nell'apice quindi completa perdita di identità nell'apice, c'è un accumulo errato di auxina che porta a piani di divisione sbagliati che porta ad un differenziamento di cellule sbagliato. Da questo si può capire che l'auxina è un morbigeno che determina il patterning della radice.

Nelle prime fasi dello sviluppo l'accumulo di auxina accade in delle parti importanti per lo sviluppo, allo stadio di embrione globulare a livello dell'ipofisi si vede un accumulo di auxina. Questo è visibile anche durante lo stadio di transizione. Nello stadio di torpedo l'auxina si sposta verso il meristema apicale della radice.

Come fluisce l'auxina in un apice radicale?

Pin1 e pin2 sono importanti per il trasporto, pin2 si localizza negli strani.

Esternisostanzialmente nell’epidermide. Guardando il posizionamento delle proteine PIN favedere che negli stradi piu esterni dell’epidermide c’è un posizionamento basaledelle proteine, nello strato della corteccia invece è apicale. Quindi diversa direzionedel flusso di auxina. Flusso del cilindro corticale simile a quello di PIN1 nella stelequindi dall’alto verso il basso. Nell’epidermide invece l’auxina va dal basso versol’alto. Quindi c’è un movimento a fontana rovesciata, va dall’alto verso il bassocentralmente, si accumulo e poi torna verso l’alto lateralmente. Quindi esisteridistribuzione dell’auxina attraverso movimento a fontana rovesciata.

1 lunedì 14 dicembre 2020-dove viene prodotta l’auxina? Dato che la direzione dell’auxina data dalla posizionedelle proteine PIN la faceva muovere dall’alto verso il basso.Tagliando la radice si osserva 2 giorni dopo il taglio

crescecon presenza di auxina c'è un attiva mitotica verso l'apice ma si osserva anche formazione di radici laterali. Con mutanti ARF si osserva sia in assenza che presenza di NPA il mutante non formava radici laterali. Tramite studi di profili di espressione per ARF7-19 si vede che questi si esprimono maggiormente nella zona più in alto dell'apice, a livello del periciclo.

Mutante SLR (solitary roots) con assenza di radici laterali, questo gene codifica per un AUX/IAA. La mutazione cade nel dominio 2, dominio che serve per legare TIR1 (attività da auxina) e che porta alla degradazione di AUX/IAA e liberazione di ARF. La mutazione porta all'impossibilità di degradare la proteina e quindi ARF rimane inattivato. (mutante gain of function) Si avrà lo stesso fenotipo di mutanti ARF.

Auxina importante per degradare AUX/IAA e per quindi attivare ARF7-19, geni per fattori trascrizionali che attiveranno geni target importanti per la radicazione.

laterale.LA TRANSIZIONE FIORALEPer arrivare al meristema fiorale abbiamo diversi step, meristema vegetativo,meristema dell’infiorescenza all’interno del quale si differenzia il meristema fiorale oche si differenzia interamente in meristema fiorale. Quindi c’è una riprogrammazionegenica che fa si che il meristema vegetativo che produce fusto e foglie, possaprodurre anche infiorescenze e fiori. Questo diverso differenziamento è dato daidiversi segnali e diversi meccanismi molecolari che caratterizzano le cellule e leriprogrammano.

Come i fattori esterni influenzano questo processo?La transizione fiorale è la fase di passaggio tra crescita vegetativa e crescitariproduttiva. Permette agli individui appartenenti ad una stessa specie disincronizzare la fase riproduttiva. Anticipa i cambiamenti stagionali.

I segnali che possono essere percepiti dalla pianta e che fanno passare la pianta dauna fase all’altra e sono segnali che dipendono dalla luce