Appunti di Biologia dello sviluppo vegetale

Biologia dello sviluppo vegetale

La biologia dello sviluppo studia l’inizio e la formazione degli organismi. Lo sviluppo realizza due obiettivi fondamentali:

• Produce la diversità degli organismi e l’organizzazione delle cellule in ogni generazione;
• Assicura la continuità della vita da una generazione alla successiva.

Le tappe dello sviluppo vegetale

• Differenziamento, legato alla posizione, non al movimento cellulare. Le cellule così acquisiscono forma e funzione.
• Crescita, in cui aumentano sia il numero di cellule sia la loro dimensione.
• Morfogenesi, in cui cellule differenti si organizzano a costituire più organi attraverso divisioni, distensione e crescita cellulare.

Tutti gli organi della pianta adulta si formano in una fase post-embrionale e questa morfogenesi continua per tutta la vita della pianta. Le cellule vegetali non subiscono migrazioni, ma c’è una particolare regolazione trascrizionale e post-trascrizionale, indotta da particolari molecole rilasciate dalle cellule circostanti quella che si sviluppa, che regolano il differenziamento corretto. Le piante non sviluppano tumori, che sono normalmente legati a sballamenti del ciclo cellulare. L’unico caso in cui si può avere una proliferazione incontrollata tumorale nelle piante è in caso di infezione da parte di un batterio esterno.

Sistema modello: Arabidopsis thaliana

Come sistema modello prenderemo in considerazione Arabidopsis thaliana, che sviluppa una rosetta con foglie ed internodi ridotti. Il fusto, che si sviluppa quando la pianta è pronta per riprodursi, ha all’estremità dei fiori e delle possibili infiorescenze secondarie. I fiori presentano 4 petali, sepali, 6 stami e 2 carpelli fusi a formare un unico pistillo. Altri sistemi modello molto usati sono il mais (che ha studi genetici molto approfonditi) e il riso (seconda pianta, dopo Arabidopsis, col genoma totalmente sequenziato).

Perché Arabidopsis?

• Ha piccole dimensioni (circa 20cm)
• È una pianta infestante, quindi non ha interesse economico.
• Ha un ciclo vitale breve, circa 8 settimane da seme a seme.
• Si autofeconda ed ogni pianta può produrre centinaia di semi, ognuno con segregazione diversa e quindi tutti diversi.
• Il DNA è totalmente sequenziato (nel 2000)
• Esistono molti mutanti disponibili e in più posso ottenerne altri per mutagenesi indotta.

I mutanti sono importanti per capire le implicazioni dei diversi geni nello sviluppo e spesso risulta utile confrontare tra loro diversi sistemi modelli, anche non tutti nello stesso regno, perché i meccanismi molecolari sono molto conservati, anche quelli regolativi, nonostante geni ed organi target siano molto differenti.

Creazione dei mutanti

Si possono creare mutanti con diversi procedimenti:

• Col metodo chimico, usando l’EMS (etilmetansulforato), che crea mutazioni puntiformi. Poco efficace.
• Col metodo dei trasposoni. I trasposoni sono geni naturalmente in grado di spostarsi nel genoma. Possono inserirsi casualmente in un gene ed interromperne la sequenza, silenziandolo. In seguito il trasposone può spostarsi nuovamente e si può avere un recupero fenotipico. Questo è un problema, perché noi abbiamo bisogno di un mutante stabile.
• Inserzione di tDNA, cioè di una sequenza di DNA esogeno inserito in un gene, che non si muove nel DNA come i trasposoni, ma ha la loro capacità di inserirsi. Così si crea una mutazione stabile trasferibile anche alla progenie.

Il tDNA è localizzato su un plasmide pTi (plasmide induttore tumorale) di Agrobacterium, che è in grado di produrre tumori qualora infetti delle piante poiché è naturalmente in grado di inserire del DNA nel genoma della pianta. Infatti, in natura induce la proliferazione cellulare e l’aumento della produzione del glucosio, di cui il batterio si ciba, ma se io vi inserisco un gene innocuo posso trasferirlo nel genoma della pianta in modo totalmente casuale e causare così mutagenesi. Posso inserire anche un marker di mutagenesi, come la resistenza agli antibiotici o geni che inducano fluorescenza (GFP). È un plasmide di circa 6000bp.

Caratteristiche dell'inserzione di tDNA

• È random
• Avviene a livello cromosomico, privilegiando le regioni trascritte.
• Anche a livello del singolo gene è random: può avvenire a livello di introni, esoni, promotore... Tuttavia produrrà sempre un danno perché si tratta di sequenze molto lunghe, in grado di alterare lo splicing.

Posso trasformare Arabidopsis immergendo in una soluzione con Agrobacterium non il callo, ma i gameti femminili. Casualmente alcuni di questi verranno trasformati e, dopo essere stati selezionati, vengono posti a germinare.

Vantaggi e svantaggi del metodo

• L’area delle mutazioni è maggiore rispetto a quella dell’EMS. Il gene viene totalmente silenziato si avrà un knock-out.
• Non tutte le piante vengono trasformate con questo metodo.

Ci sono delle banche dati di industrie che producono mutanti con il tDNA, tu selezioni quello che ti serve e loro te lo mandano.

L’uso dei mutanti nell’approccio genetico alla biologia dello sviluppo

L’utilizzo di mutanti può essere di due tipologie a seconda del tipo di analisi genetica che si effettua:

• Forward genetic: Partendo dalla mutazione si arriva al gene. Questo approccio prevede l’uso di uno screening fenotipico.
• Reverse genetic: Dal gene si arriva al fenotipo.

Su che basi si sceglie il gene da analizzare?

• Per intuizione.
• Perché risulta importante in processi correlati a quelli che stiamo studiando. Questo non solo all’interno di uno stesso regno.

Spesso in realtà si usa la reverse genetic perché tutti i fenotipi più evidenti sono già stati studiati. Tuttavia, esistono regioni poco accessibili al tDNA (per esempio, quelle vicine al centromero, oppure nel caso di geni molto piccoli), conseguentemente non esistono mutanti a riguardo. Quindi come si fa? Si usano i piccoli RNA per silenziare dei geni specifici: un RNA antisenso studiato ad arte viene inserito nella cellula e questo si appaia con l’mRNA del gene d’interesse. Come meccanismo di difesa, la cellula li separa e li degrada. Tuttavia, nella cellula rimangono liberi gli oligo che li formavano, che possono appaiarsi ad altro mRNA complementare e così si ricomincia. In questo modo il gene viene di fatto silenziato.

Per ottenere questi RNAi si prende la sequenza del gene di modo che sia: CaMV35S-antisenso-introne-senso-terminatore. CaMV35S è una regione regolativa usata in modo tale da venire riconosciuta in ogni parte della pianta. Insomma, è un promotore costitutivo. L’uso della sequenza antisenso-introne-senso facilita l’appaiamento del dsRNA.

Analisi dei mutanti

L’analisi dei mutanti può essere di tipo:

1. Morfologico: serve per capire dove sta il problema del mutante. Ovviamente per applicare un approccio di tipo morfologico bisogna saper bene l’anatomia. Può essere fatto con due tipi di analisi:
   • Analisi macroscopica
   • Analisi microscopica:
     • Ottica
     • Elettronica
     • Elettronica a scansione (SEM)
2. Genetico: serve per la caratterizzazione di un gene. Ci si pone diverse domande: qual è la sua funzione? (v. analisi morfologica) Dove viene espresso? Si procede in questo modo:
   • Isolamento di un gene dal fenotipo di interesse
   • Analisi dell’espressione del gene tramite:
     • Ibridazioni in situ
     • Geni reporter per visualizzare l’attività del promotore
3. Molecolare

Ora, se ho una mutazione devo verificare se è dipendente dal gene che io ho mutato. Per esempio, se ho una mutazione con fenotipo del fiore mutato devo verificare che il gene della mutazione sia espresso nel fiore.

• Dopo aver fissato il fiore in paraffina faccio delle sezioni col microtomo e preparo una sonda antisenso, marcata con nucleotidi con digossigenina, poi incubo con un anticorpo anti-dig coniugato con fosfatasi alcalina e soluzione di colorazione. Oppure abbino al gene che muto un gene reporter, come GUS o GFP.

Sviluppo della pianta

Lo zigote sta nel gametofito femminile (o sacco embrionale) insieme all’endosperma e ai tegumenti dell’uovo, che poi diventano i tegumenti del seme. Lo zigote è l’embrione più altri organi della pianta, che si formano a partire da una sola cellula diploide attraverso diversi processi. Con una serie di mitosi cresce il numero di cellule e contemporaneamente avviene il differenziamento, che dipende essenzialmente dalla posizione della cellula. Potremmo definire il differenziamento come l’espressione specifica di alcuni geni, cui segue l’organogenesi, cioè l’organizzazione delle cellule in organi. Le cellule vegetali, durante il differenziamento, attuano un certo numero di divisioni e “sanno” perfettamente quando fermarsi, e una volta fermatesi non riprendono più a dividersi. La forma delle cellule dipende dai piani di divisione e dalla velocità di divisione, che creano diverse forme, oltre che dalla regolazione dei processi divisori a livello genetico. Le divisioni possono essere simmetriche o asimmetriche, caso in cui le cellule figlie sono diverse dalla cellula madre e anche tra loro, per forma e spesso anche per contenuto citoplasmatico.

La prima divisione dello zigote è asimmetrica e questo si divide in una cellula apicale, contenente le proteine e gli mRNA necessari per lo sviluppo embrionale, ed una basale, con un grosso vacuolo. Le cellule possono comunicare tra loro tramite messaggi molecolari e per questo motivo riescono a capire la propria posizione reciproca. Alcuni esempi possono essere gli ormoni, che creano dei gradienti man mano che si allontanano dalla cellula che li ha secreti e quindi possono agire da morfogeni.

Signalling posizionale

Come abbiamo già detto il differenziamento dipende dalla posizione che assume una determinata cellula nell’embrione, quindi dal signalling posizionale, che viene dato creando un gradiente ormonale. Esiste infatti un morfogeno, comune ad angiosperme e gimnosperme, il cui gradiente regola la trascrizione e il differenziamento.