Biologia cellulare - Splicing

Splicing

Esoni e introni. L'mRNA maturo è formato dai soli ESONI.

splicing

In biologia molecolare e in genetica, (dall'inglese: montaggio) è una modifica del nascentepre­mRNA che avviene insieme o dopo

la trascrizione, nella quale gli introni sono rimossi e gliesoni vengono uniti. La cosa è necessaria per il tipico RNA messaggero prima che

possa essere usato per produrre una corretta proteina tramite la traduzione o sintesi proteica.

La maggior parte dei geni eucariotici sono costituiti da regioni codificanti (esoni) alternate a regioni non codificanti (introni). Quest'ultime

devono necessariamente essere rimosse dal trascritto primario per consentire la corretta traduzione e sintetizzare la proteina

corrispondente. Alcuni introni sono presenti anche nei geni degli archeobatteri, mentre sono assenti in quelli deglieubatteri. Dopo la

trascrizione da parte della RNA polimerasi il trascritto primario va incontro a numerose modificazioni. Prima fra tutte l’eliminazione degli

introni, denominata splicing.

splicing

Il termine (in italiano letteralmente "giunzione") indica uno dei processi, insieme al capping e alla poliadenilazione, di maturazione

del trascritto primario dei geni discontinui. Il macchinario della sintesi proteica cellulare è in grado di tradurre solo gli RNA messaggeri che

contengono segmenti continui di codoni (triplette di nucleotidi che codificano per un amminoacido), non ha modo di identificare ed evitare

un blocco di sequenze non codificanti. Quindi, i trascritti primari dei geni devono avere i loro introni rimossi prima che avvenga la

traduzione in proteine. È proprio attraverso lo splicing dell'RNA che gli introni vengono rimossi dal pre­mRNA. Questo processo converte il

pre­mRNA in un messaggero maturo e deve essere molto preciso per evitare la perdita o l'aggiunta anche di un singolo nucleotide nei

punti in cui gli esoni vengono uniti.

Il macchinario dello splicing: lo spliceosoma

Chimicamente lo splicing avviene per due successive reazioni di transesterificazione, grazie alle quali legami fosfodiesterici sul pre­mRNA

vengono rotti e altri nuovi formati. Queste reazioni sono mediate da un meccanismo molecolare che coinvolge più componenti, chiamato

spliceosoma. Le sue dimensioni sono simili a quelle di un ribosoma ed è composto da circa 150 proteine e 5 RNA. Sono proprio

quest'ultimi a riconoscere, con molta probabilità, le sequenze ai confini introne­esone ed a partecipare alla catalisi della reazione. Per le

piccoli RNA

sue reazioni lo spliceosoma idrolizza diverse molecole di ATP. I cinque RNA (U1,U2,U4,U5 e U6) sono chiamati

nucleari (snRNA, small nuclear RNA). Ognuno di questi si complessa con diverse proteine del macchinario, formando complessi,

ribonucleoproteine nucleari

chiamati (snRNP, small nuclear ribonuclear protein). La composizione dello spliceosoma varia a seconda

dei passaggi della reazione: snRNP diverse entrano ed escono dalla reazione in momenti diversi, ed ognuna ha una sua funzione

particolare. Le snRNP rivestono tre ruoli nello splicing: riconoscono il sito di splicing 5' e il punto di ramificazione; portano questi siti vicini

quando occorre e catalizzano il taglio e la giunzione dell'RNA. Per tali funzioni sono essenziali le interazioni RNA­RNA, proteina­RNA e

proteina­proteina. La prima interazione avviene tramite l'accoppiamento di basi complementari, tra l'snRNA U1 e il sito di splicing 5' del

pre­mRNA. Nel corso della reazione, questo sito di splicing viene riconosciuto dall'snRNA U6. Un altro esempio di appaiamento tra le basi

è il riconoscimento del punto di ramificazione da parte dell'snRNA U2, oppure l'interazione tra gli snRNA U2 e U6. Questa interazione

avvicina il sito di splicing 5' e il punto di ramificazione. Sono proprio queste interazioni e i successivi riarrangiamenti che ne conseguono

che guidano la reazione di splicing e contribuiscono alla sua precisione. Anche alcune proteine non complessate con l'RNA sono coinvolte

nello splicing: il fattore ausiliario U2 (U2AF) riconosce il segmento polipirimidinico e il sito di splicing 3', così che, nella fase iniziale della

reazione di splicing, aiuta il legame di un'altra proteina (BBP,branch­point binding protein) al punto di ramificazione. La BBP sarà poi

spiazzata dalla snRNP U2. Le altre proteine facilitano il legame tra RNA e snRNP.

Le fasi dello splicing Sito polipirimidinico

Inizialmente, il sito di splicing 5' viene riconosciuto dalla snRNP U1. Una delle subunità di U2AF si lega al segmento polipirimidinico,

mentre l'altra si lega al sito di splicing 3'. la prima subunità interagisce con BBP e aiuta questa proteina a legarsi al punto di ramificazione.

complesso precoce E.

Questo arrangiamento di proteine e RNA è chiamato

A questo punto, la snRNP U2 si lega al punto di ramificazione, con l'aiuto di U2AF, e spiazza BBP. Questo arrangiamento è chiamato

complesso A. L'appaiamento di basi tra l'snRNA U2 e il punto di ramificazione è tale che il residuo A del punto di ramificazione venga

spinto fuori dal segmento risultante a doppia elica di RNA e formi una protuberanza a singolo nucleotide. Questa A diventa così non

accoppiata e disponibile per la reazione con il sito di splicing 5'. La fase successiva è il riarrangiamento del complesso A per

l'avvicinamento di tutti e tre i siti di splicing.

Questo avviene in una serie di fasi: le snRNP U4 e U6, assieme alla snRNP U5, si uniscono al complesso. Queste tre snRNP assieme

sono dette tripla snRNP U4\U6*U5, in cui le snRNP U4 e U6 sono tenute assieme dall'accoppiamento complementare delle basi dei loro

corrispettivi snRNA, mentre la snRNP U5 è legata in maniera più lassa attraverso interazioni proteina­proteina. Con l'ingresso della tripla

complesso B.

snRNP U4\U6*U5 il complesso A diventa

Nel passaggio successivo, U1 lascia il complesso e U6 lo rimpiazza al sito di splicing 5'. Questo richiede che l'appaiamento tra l'snRNP

U1 e il pre­mRNA venga rotto per permettere all'RNA U6 di riappaiarsi nella stessa regione. Questi passaggi completano l'assemblaggio.

Il riarrangiamento successivo innesca la catalisi ed avviene nel modo che segue: U4 viene rilasciato dal complesso permettendo ad U6 di

complesso C,

interagire con U2. Questo arrangiamento, chiamato produce il sito attivo. Cioè il riarrangiamento avvicina all'interno dello

spliceosoma quei componenti che assieme formano il sito attivo. Questo stesso riarrangiamento assicura che l'RNA substrato sia

posizionato correttamente. Il fatto che la formazione del sito attivo sia successiva al completamento dell'assemblaggio dello spliceosoma

rende il sito attivo disponibile solo nei siti di splicing corretto.

La formazione del sito attivo mette in prossimità il sito di splicing 5' del pre­mRNA e il punto di ramificazione, facilitando la prima reazione

di transesterificazione. La seconda reazione, tra i siti di splicing 5' e 3', è supportata dalla snRNP U5, che aiuta ad avvicinare i due esoni. Il

passaggio finale implica il rilascio dell'mRNA e delle snRNP. Queste sono prima legate al cappio formatosi, ma vengono rilasciate in

seguito alla rapida degradazione di questo frammento di RNA.

Sequenze dell'mRNA che determinano lo splicing

Il confine tra esone e introne o meglio il limite all'estremità 5' dell'introne è detto sito di splicing al 5'. Il confine introne­esone all'estremità 3'

è detto sito di splicing al 3. Questi ultimi vengono chiamati rispettivamente sito donatore e sito accettore. Per il meccanismo di splicing è

necessaria un'altra sequenza che è chiamata punto di ramificazione (branch point site); quest'ultima si trova all'interno dell'introne,di solito

vicino alla sua estremità 3' ed è seguita da un segmento di polipirimidine (Py tract). Le sequenze più conservate sono GU al sito di splicing

5' e AG al sito di splicing 3'; infine vi è la A, che rappresenta il punto di ramificazione. Queste sequenze conservate si trovano tutte

all'interno degli introni; ciò è abbastanza normale dato che le sequenze della maggior parte degli esoni, al contrario di quelle introniche,

rispondono alla necessità di codificare per gli aminoacidi specifici per i loro prodotti proteici.

Autosplicing

Alcuni rari introni sono capaci di "autocatalisi", ovvero la parte intronica dell'RNA trascritto è un "ribozima" che catalizza la propria

gruppo I

escissione, con meccanismo diverso a seconda che l’introne sia di I o di II gruppo. Lo splicing degli introni del necessita di

un nucleoside guaninico, usato comenucleofilo: il suo –OH in 3’ si lega all’estremità 5’ dell’introne con un legame fosfodiesterico 3’­5’ al

primo nucleoside dell’introne. L’ossidrile in 3’ dell’esone precedente agisce da nucleofilo completando la reazione e congiungendo i due

gruppo II,

esoni. Per gli introni del la reazione è simile, ma il primo nucleofilo ad agire non è un nucleoside esterno, bensì un –OH in 2’ di

un residuo adenilato all’interno dell’introne. Questo meccanismo, definito "autocatalitico" perché può avvenire anche in completa assenza

di proteine, riguarda rari introni di alcuni geni degli organelli degli eucarioti (gruppo II), dei geni nucleari codificanti l'rRNA di qualche

eucariote (gruppo I) e di qualche gene procariotico (entrambi i gruppi).

Splicing catalizzato

Il terzo gruppo di introni, che è quello più comune e che riguarda la maggior parte degli introni dei geni nucleari degli eucarioti, mostra lo

stesso meccanismo di formazione del cappio utilizzando una "A" interna all'introne, di solito prossima al 3', tuttavia necessita di complessi

snRNP)

di RNA e proteine chiamati Piccole Ribonucleoproteine Nucleari (small nuclear ribonucleoproteins o contenenti sequenze di 100­

200 nucleotidi chiamati snRNA o RNA U. Quando il complesso si lega al trascritto primario si forma lo spliceosoma. Nonostante che,

anche in questo caso, la catalisi sia portata avanti proprio da questi piccoli RNA, che agiscono quindi come ribozimi, il meccanismo è

chiaramente assistito e quindi non autocatalitico.

Una quarta classe di introni, esemplificati da alcuni piccoli introni ritrovati nei geni che codificano tRNA in eucarioti inferiori, mostrano

meccanismo molto diverso, che prevede un taglio dell'introne da parte di un enzima specifico endonucleasi, seguita da ricongiungimento

degli esoni da parte di una RNA Ligasi ATP­dipendente ATP.

trans­splicing

Esiste un ulteriore tipo catalizzato, chiamato che salda due esoni di trascritti primari differenti.

Queste ultime classi sono riscontrabili solo negli eucarioti.

Riconoscimento dell’introne GU

Nel caso degli introni del terzo gruppo, nella stragr