Biologia cellulare, appunti

ATTIVITA' RNA POLIMERASI

Inizio della trascrizione: la RNA polimerasi deve riuscire a riconoscere l'inizio di un gene e legarsi al DNA in

quella posizione.

RNA PROCARIOTI

L'enzima scorre lungo il DNA e si legherà saldamente quando incontrerà la regione promotore, cioè una

sequenza specifica di nucleotidi che indica il punto di inizio per la sintesi di RNA.

Il compito di riconoscere il promotore spetta a un fattore sigma.

Legatasi al DNA, la RNA polimerasi apre la doppia elica ed espone i nucleotidi per un breve tratto: uno dei due

filamenti di DNA farà da stampo e la polimerasi congiunge due nucleotidi, tra quelli in arrivo, per dare inizio alla

catena di RNA.

L'allungamento procede finchè l'enzima non incontra un altro segnale sul DNA: il segnale di terminazione, dove

si ferma lasciando libero lo stampo e il polimero di RNA appena sintetizzato.

Una volta che la polimerasi è innestata e ha sintetizzato 10 nucleotidi, essa si stacca dal fattore sigma per

riattaccarsi ad un altro e, una volta incontrato il terminatore, per cercare un nuovo promotore.

La polimerasi è capace di riconoscere il promotore stabilendo contatti con le basi esposte all'esterno dell'elica.

Il promotore è asimmetrico e lega la polimerasi solo in una certa orientazione in modo che essa trascriva il

filamento in direzione 5'-3'.

La direzione di trascrizione può variare da gene a gene.

L’orientazione del promotore definisce la direzione della trascrizione: è usato il filamento inferiore nei geni

trascritti da sx a dx, e viceversa per il filamento superiore.

RNA EUCARIOTI

all’inizio della trascrizione,

Riguardo gli eucarioti differenziano dai procarioti:

1. Eucarioti possiedono tre tipi di RNA polimerasi: la I e III, che trascrivono geni codificanti tRNA, rRNA e

altri RNA con ruolo catalitico e strutturale; la polimerasi II trascrive i geni codificanti le proteine (mRNA).

2. Per iniziare la trascrizione le polimerasi richiedono delle proteine accessorie, tra cui i fattori generali di

trascrizione, che devono aggregarsi alla polimerasi, in corrispondenza del promotore (nei procarioti

presente solo uno, il fattore sigma).

3. I vari geni sono sparsi nel DNA, intervallati da lunghi tratti: numero illimitato di sequenze regolatrici di geni

(introni), quindi sistema molto complesso.

4. Nel cromosoma eucariotico il DNA è organizzato in nucleosomi. l’attività catalitica.

I fattori generali di trascrizione collaborano con la polimerasi II per iniziare

Essi si legano al promotore posizionando la RNA polimerasi, aprono la doppia elica esponendo il filamento

fanno partire l’enzima.

stampo e riconosciuto dall’enzima polimerasi.

Essi formano un aggregato sul promotore

 INIZIO:

o il fattore TFIID, tramite la subunità TBP (TATA binding protein), si lega ad una sequenza di DNA

detta TATA box (perchè formata da nucleotidi A e T);

o la subunità TBP induce una forte distorsione sulla regione TATA (cioè lo piega di 80°), in modo

che si possano unire i fattori TFIIA e TFIIB, che stabilizzano TFIID sulla sequenza TATA;

e l’enzima

o Si completa il complesso di inizio trascrizione con gli altri fattori (TFIIE, F, J e H)

polimerasi II;

o Il fattore TFIIH (con funzione di elicasi) fosforila la coda della polimerasi II, sganciando da essa il

complesso proteico;

o Avvio della trascrizione; distacco dei fattori di trascrizione dal DNA che si rendono disponibili per

un nuovo ciclo con una nuova molecola di RNA polimerasi II;

o Quando polimerasi II finisce di trascrivere abbandona il DNA, i fosfati della coda vengono

idrolizzati dalle fosfatasi e si può ripetere il ciclo.

 PROCESSO MATURATIVO DELL’RNA:

Il DNA batterico è esposto al citoplasma e contiene i ribosomi (sintesi proteica); negli eucarioti il DNA è

nel nucleo (trascrizione), mentre la sintesi proteica avviene nel citoplasma.

Maturazione dell’RNA:

o gli enzimi incaricati seguono la coda della RNA polimerasi mentre

trascrive, elaborando man mano il trascritto.

o I trascritti subiscono modifiche diverse a seconda che siano mRNA o altro tipo: i pre-mRNA

saranno dotati di un cappuccio e di una coda poliadenilica. all’estremità

1. Apposizione del cappuccio: (capping) modificazione del pre-mRNA

5’(sintetizzata per prima) con un cappuccio nucleotidico (guanina + gruppo metilico)

raggiunti i 25 nucleotidi di sintesi. mRNA all’estremità 3’ con l’aggiunta della

2. Poliadenilazione: modificazione coda poli-A

(composta da 150/200 nucleotidi adenilici).

Queste modificazioni incrementano stabilità e facilitano il passaggio dal nucleo al citoplasma.

La presenza di capuccio e coda permette ai ribosomi di riconoscere la molecola di mRNA

funzionale: può essere tradotta in proteina.

I geni sono interrotti da sequenze non codificanti, dette introni (hanno solo importanza regolatorio per

il DNA). I pezzi sparsi di sequenza codificante (esoni) sono più corti degli introni: geni codificanti < geni

non codificanti.

Dopo l’apposizione del cappuccio inizia il processo di splicing, cioè la rimozione degli introni e la cucitura

degli esoni.

SPLICING NORMALE

Un complesso dispositivo di splicing taglia via l’introne sotto forma di struttura a cappio.

Lo splicing è operato da molecole di RNA: esse sono dette piccoli RNA nucleari (snRNA) che si

aggregano a delle proteine (circa 150 unità) formando le piccole particelle ribonucleoproteiche nucleari

l’aggregato che provvede a tagliare introni

(snRNPs o snurps). Gli snurps costituiscono lo spliceosoma,

e ricucire esoni del trascritto di pre-mRNA.

sono importanti le tre parti dell’introne: il sito di splicing 5’

Nel processo di splicing (GU), il sito di

splicing 3’ (AG) e il sito branch nel mezzo (UACUAAC).

Lo spliceosoma si lega al sito 5’ ed effettua un taglio; poi ribalta l’estremità tagliata sul sito branch, la lega

all’estremità 3’ e su questa estremità effettua un altro taglio eliminando quindi l’introne.

Poi lo spliceosoma cuce i due esoni insieme.

SPLICING ALTERNATIVO

Consente di produrre proteine diverse dallo stesso gene, ampliando il potenziale codificante dei geni.

Consiste in: escludere un esone, includere parte o un intero introne, o introdurre esoni alternativi.

Almeno il 60-80% dei geni umani è in grado di compiere lo splicing alternativo da un unico pre-mRNA.

 ESPORTAZIONE

La cellula, al termine della sintesi di mRNA, deve distinguere il trascritto dalle molecole di RNA di scarto:

il trasporto di mRNA da nucleo a citoplasma, dove avverrà la traduzione, è un processo molto selettivo.

Questa funzione di controllo è operata dal coplesso del poro nucleare, che riconosce e trasporta solo

mRNA completi (cioè maturati perfettamente).

TRADUZIONE

Per convertire l’informazione dell’RNA in proteina bisogna tradurre l’informazione in un altro linguaggio: le regole

per tradurre la sequenza nucleotidica di un gene nella sequenza amminoacidica di una proteina sono note come

codice genetico.

Nella molecola di mRNA le sequenza di nucleotidi si legge a gruppi consecutivi di tre elementi: i codoni.

Essi specificano ciascuno un amminoacido.

Si nota che il codice genetico è ridondante, cioè che più codoni diversi specificano un solo tipo di AA.

I codoni di mRNA non riconoscono gli AA cui corrispondono: la traduzione in proteina dipende molecole di RNA

in relazione l’informazione contenuta nei codoni dell’mRNA con

transfer, lunghe 80 nucleotidi, che mettono

specifici amminoacidi delle proteine.

Nel tRNA ripiegato ci sono quattro doppie eliche (forma trifoglio); poi si ripiega ulteriormente in una struttura a L,

stabilizzata da legami a H.

Due regioni interessate alla proteinosintesi occupate da nucleotidi non appaiati e situate ai poli opposti della

molecola:

Una forma l’anticodone,

o serie di 3 nuclotidi capaci di appaiarsi al codone complementare del mRNA

(tramite legami a H);

è un breve tratto a singolo filamento all’estremità 3’: tRNA si lega all’amminoacido

o L’altra sito dove il che

corrisponde al codone, mediante legame covalente.

Alcuni AA hanno più di un tRNA e alcuni tRNA hanno una struttura tale da richiedere un appaiamento accurato

solo nelle prime due posizioni del codone e da tollerare un appaiamento scorretto in terza posizione.

Per garantire che la proteina fabbricata sia quella specificata dall’mRNA, il tRNA deve leggere correttamente i

codoni dell’mRNA e fornire gli amminoacidi corrispondenti ai codoni letti.

La molecola di tRNA svolge tre funzioni:

1. «si carica» di un amminoacido;

2. si associa alle molecole di mRNA;

3. interagisce con i ribosomi.

Per ognuno dei 20 amminoacidi c’è almeno un tipo specifico di molecola di tRNA.

(legato all’AA codificato da una certa tripletta); il riconoscimento e l’attacco di

Ogni tipo di tRNA viene caricato

esso dipendono da enzimi detti amminoacil-tRNA sintetasi, che uniscono covalentemente ogni AA al tRNA

corrispondente.

 Esiste una sistetasi diversa per ogni AA.

 Ogni sintetasi individua il tRNA giusto in base a nucleotidi posti sulle estremitità (3’->accettore per AA;

5’->anticodone per mRNA).

 Sintetasi catalizza unione di AA a 3’ idrolizzando ATP (liberaz. energia); legame ad alta energia tra

tRNA e AA corrispondente (diventerà poi legame covalente tra AA e catena polipeptidica in crescita).

DECODIFICA

...dell’mRNA avviene sui ribosomi.

Tradurre mRNA in proteina richiede il ribosoma:

o Percorre catena mRNA;

o Capta i tRNA complementari;

posiziona in modo che gli AA all’estremità 3’ si uniscano in una catena proteica.

o Li

Il ribosoma è costituito da 50 proteine ribosomiche e da RNA ribosomici (rRNA).

La cellula contiene nel citosol milioni di ribosomi.

I ribosomi sono formati da due subunità:

o Subunità minore: accoppia i tRNA a codoni di mRNA;

o Subunità maggiore: catalizza legami peptidici per formazione catena amminoacidica.

Le due subunità si associano al 5’ di un mRNA per iniziare sintesi proteica. Il ribosoma scorre su esso e ne

traduce la seq. nucleotidica in seq. amminoacidica un codone alla volta, usando i tRNA come adattatori.

Ogni ribosoma contiene un sito di legame per una molecola di mRNA e tre siti per le molecole di tRNA (sito A,

P ed E). CICLO tRNA che reca l’AA da inserire

1. Il nella catena si posiziona nel sito A, dove il suo

anticodone si appaia con il codone dell’mRNA esposto;

L’estremità –COOH

2. della catena polipeptidica si stacca dal tRNA del sito P e

–NH

stabilisce un legame peptidico con il gruppo del tRNA posto sul sito A;