Biologia cellulare - Appunti

LA CELLULA

Elemento costitutivo universale di tutti gli esseri viventi suddivisi in:

• unicellulari
• pluricellulari

• Il nome deriva dal latino (piccola camera)
• Robert Hooke osservò per primo le cellule nel 1665 notando delle cemmeorsel nel sughero
• Ogni cellula:
• possiede un metabolismo proprio
• possiede un'alta organizzazione
• Assume energia e materia dall'ambiente esterno e le trasforma
• Cresce e si sviluppa
• si riproduce
• è in grado di rispondere a stimoli esterni
• è capace di adattarsi all'ambiente esterno
• In tutte le cellule la informazione genetiche contenute nel DNA (gene) sono trascritte in RNA e poi tradotte in proteina
• Le cellule si dividono in:
• PROCAROTICA (pro = prima, Kàiron = nucleo): tipica degli Eubatteri e Archaebatteri grande da 1-10_µm (1-10^-6 m)
• EUCARIOTICA (eu = vero Kairon = nucleo): tipica del regno animale e vegetale grande da 10-100_µm
• Le cellule eucariote si sono evolute da un progenitore ancestrale indiffer e presure cha esist un peogenitore comune ad eucarie e Archea.

Per osservare le cellule si utilizzano tipi diversi di microscopio:

• La minima risoluzione dell'occhio: 2 x 10^-4 m. (0.2 mm)
• La minima risoluzione del microscopio ottico: 2 x 10^-7 m (0.2_µm)
• La minima risoluzione del microscopio elettronico: 2 x 10^-10 m (0.2 nm)

MICROSCOPIO OTTICO

• necessita di 3 cose:
• luce
• lenti
• campione opportunamente preparato

è composto da:

• oculari → amplifica l'immagine 10 volte
• obiettivo → amplifica l'immagine 100 volte
• Ingrandimento finale 1000 x
• condensatore, concentra la luce sul campione
• tavoina portacoggetti
• spezchic

potere di risoluzione: capacità di distinguere due oggetti molto vicin:

• da D ≤ 0,61_λ

N ison = N.A. apertura numeria dove:

• D = la distanza minima percè gli oggetti ratino distinguibili
• λ = le lunghezze d'onda delle luce (incende di 400 > 750 nm = luce bancone e visibile)
• N/A = L'apertura angolare (seminganka dell'ongolo) che la luce è penetra nell'obiettivo
• N = L'inide di rinunzione del one il viscchio tra il campione e l'obiettivo

Il limite di risoluzione in aria (0,61(0,54)/1(1,4x1,000) = 0,2 _µm

Il limite di risoluzione in one (0,61(0,54/(10,(1,000) = 0,3 _µm

allestimento di una sezione de Tesuto per l'analis al microscopio ottico

• PRELIEVO tramite espianto d’organo
• tramite inizio. in vivo

LA FISSAZIONE il trattamento del campione con una sostanza the montiene l'intediare strutturale delle cellule prevenendo la following cellular di parte di enzymi e batteri

La fissazione con metodhi chimici:

• fissativi si uniscono legame le proteine
• Alcol cilico (Et-OH)
• Alcol acetici (CH₃COOH)
• fissativi che formano legoma crocia tra catene proteche adiacenti

Formaldeide

(gas incolore che in soluzione acquosa diventa formalina)

• LAVAGGIO (eliminazione del fissativo in eccesso)
• DISIDRATAZIONE mediante trasferimento in bagni graduali di etanolo
• INCLUSIONE: i tessuti biologici vengono inclusi in materiali resistenti che possano fungere da sostegno (esempio: paraffina = composti derivati da natura lipidica)
• SEZIONAMENTO: per ottenere un tessuto molto sottile e osservabile al MO; deve essere sufficientemente sottile da essere attraversato da luce. Quindi i tessuti vengono sezionati dal MICROTOMO (con attrizzamento per mole)
• SPAARAFFINATURA (eliminazione del materiale di inclusione)
• COLORAZIONE
• MONTAGGIO SU VETRINO

MICROSCOPIO OTTICO IN CAMPO CHIARO

• la luce passa attraverso la cellula
• pochi dettagli sono visibili in quanto la maggior parte dei componenti cellulari e trasparente
• e necessario introdurre contrasto
• il contrasto puo essere generato tramite colorazione dei campioni fissati (cellule morte)
• il contrasto puo essere generato tramite componenti del microscopio

MICROSCOPIO OTTICO A CONTRASTO DI FASE

• le onde luminose in entrata sui componenti cellulari cambiano di fase
• il cambiamento di fase dipenderla dallo spessore e dall'indice di rifrazione delle strutture attraversate
• il microscopio a contrasto di fase possiede dispositivi ottici, posti tra il campione e l'oculare, che amplificano la differenza di fase delle varie onde
• i cambiamenti di fase sono convertiti in cambiamenti di contrasto

MICROSCOPIO OTTICO A CONTRASTO DI INTERFERENZA

• si basa sull'interferenza tra due onde che seguono due percorsi ottici distinti: uno attraverso il campione l'altro no.
• il contrasto e generato dalle differenze dell'indice di rifrazione dell'oggetto e del suo mezzo circostante
• si possono osservare oggetti tridimensionali

MICROSCOPIO A FLUORESCENZA

• i preparati vengono trattati con molecole fluorescenti (fluorofori o fluorocromi) che assorbono la luce per un tempo brevissimo (10^-5-10^-8 sec) e la rimettono ad una lunghezza d'onda maggiore
• esempio: DAPI assorbe la 350 nm ed emette a 460 nm
• GFP assorbe a 475 nm ed emette a 509 nm
• il mediante immuno-fluorescenza indiretta e possibile visualizzare una specifica proteina cellulare
• vengono marcati anticorpi secondari che attaccano ad anticorpi primari che a loro volta riconoscono e legano ad una determinata antigene
• la struttura e simile al MO, ma la luce passa per una serie di filtri
• primo filtro-barriera: lascia passare solo luce blu (450-490 nm)
• secondo filtro-barriera: elimina segnali fluorescenti non voluti, fa passare l'emissione specifica verde della fluorescenza (520-560 nm)

MICROSCOPIO CONFOCALE

• e un microscopio e fluorescenza con un laser come fonte di luce
• il raggio laser e focalizzato su un punto preciso del compione
• il punto colpito dal laser emette fluorescenza che raggiunge il rivelatore
• sono eliminate le radiazioni non a fuoco, vere eche solo dal rivelatore
• il fascio di luce emesso dal laser passa attraverso un forellino (pinhole) ed e fatto convergere sulla retina dell'occhio e sul piano orto epistemico dell'obiettivo. Il punto viene spostato attraverso un sistema di specchi oscillanti su tutto il campo visivo dell'obbiettivo, effettuando una scansione
• nel piano focale la luce emessa dal fluoroforo e collettata dalle lenti dell'obbiettivo e deviata da uno specchio diacrico su un rivelatore (fotomoltiplicatore) che trasforma l'intensita luminosa in un segnale elettrico di intensita proporzionale
• scansioni su piani diversi e ricomposte permettono di ricostruzione un modulo tridimensionale

Trasporto Attivo

Richiede una fonte di energia. Che può derivare da 3 meccanismi di trasporto:

1. Trasporto accoppiato: il trasporto di un soluto contro gradiente è accoppiato al trasporto di due soluti secondo gradiente.
   • simporto: i due soluti sono trasportati nella stessa direzione
     • Esempio: il Trasportatore Na⁺/Glucosio (il trasporto attivo del glucosio è spinto dal gradiente di Na⁺)
   • antiporto: il trasporto dei due soluti avviene in direzione opposta. Esempio: Ca²⁺ e H⁺ sono espulsi dalle cellule accoppiando la loro uscita con l'ingresso di Na⁺
     • Na⁺ entra nella cellula: 3 Na⁺ interno, 2 K⁺ esterno
2. Esempio: Nelle cellule vegetali: une proteina antiporto/scaccario presente nella membrana vacuolare, conferte proteniacciata al saccarosio. Il flusso vario è nei dai vacuolo all'interno tramite output di Na⁺ necessario Na⁺
3. Trasporto mediato da pompe ad ATP:
   • esistono 3 classi di proteine di trasporto ATP dipendenti
     • Pompe di classe P (composte di 2 subunità catalitiche e identiche contenenti un sito di legame per ATP e due subunità P_c(a=r) e ha ruolo catalitico verso fosforilale.
       • Esempi: Na⁺/K⁺ nelle cellule animali (Scambio 3 Na⁺ con 2 K⁺)
       • Pompa Ca²⁺ di membrana di tutte le cellule euvcaristiche
     • Pompe protoniche de classi V e F
       • Non formano intermedi fosforoproteici
       • classi V: pompa H⁺ generando un gradiente elettrochimico attraverso le membrana cellulari tramite idrolisi di ATP.
         • Funzione: mantenere acido il pH di alcuni organali (è richiede l'influsso di anioni come Cl^- attraverso la membrana vacuolare)
       • classe F (ATP sintasi): composte di una testa F_c e fin transporte H⁺. Fornisce l'energia del gradiente generato con flusso di H⁺
     • Superfamiglie: ABC (ATP-binding cassette), contengono:
       • due domini T (da 6 eliche) diversi
       • due domini A ( leganti ATP) conservati
       • Accoppiamento idrolasi di ATP e T Misimport: porte piu èo tipi diversi de proteine de trasporto che è desta specificato: è substrato
     • Esempio: FLIPPASI la proteina riesciala fosfolipidi, ne distance cambiamenti conformazionali