Biologia cellulare - Appunti

Cellula eucariotica

Le dimensioni sono maggiori rispetto a quelle delle cellule procariote, dovuto al fatto che sono strutturate in maniera diversa e più complessa. La membrana nucleare divide il nucleo dal citoplasma, al cui interno sono presenti un citoscheletro, filamenti proteici e proteine che conferiscono struttura e forza meccanica alla cellula, e altre membrane. La cellula può cambiare forma e inglobare altre cellule. Possiede un genoma molto più grande di quello delle cellule procariotiche.

Proteine

Lunghe catene polipeptidiche formate da 20 tipi diversi di amminoacidi che possono legarsi con tutti. La sequenza ripetuta di atomi lungo il nucleo della catena polipeptidica viene chiamata ossatura polipeptidica, a questa sono legate le catene laterali, porzioni di amminoacidi che non sono coinvolte nella formazione del legame peptidico ma conferiscono le proprietà a ciascun amminoacido.

Sono importanti i legami non covalenti per la struttura ripiegata della proteina, tra cui vi è anche la distribuzione di amminoacidi polari e non polari. Tutte le informazioni necessarie per specificare la struttura tridimensionale sono all'interno della catena di amminoacidi. Ogni proteina può ripiegarsi dando una struttura tridimensionale su cui sono presenti dei siti reattivi; la conformazione che acquista è quella che riduce al minimo l'energia (le informazioni che specificano la conformazione naturale risiedono nella sequenza amminoacidica); di solito possono raggiungerla da sole, ma a volte intervengono degli chaperoni molecolari e dei legami disolfuro che rinforzano la struttura favorita.

Ci sono due schemi regolari di ripiegamento: alfa elica, tipica della cheratina, e beta foglietto, tipica della seta; derivano entrambi dalla formazione di legami idrogeno tra N-H e C=O, ma non coinvolgono le catene laterali. Le strutture a foglietto sono presenti in grandi quantità nel nucleo delle proteine e possono essere formate da catene peptidiche parallele o antiparallele e creano una struttura rigida. Le eliche sono presenti nelle proteine di trasporto e nei recettori e si generano quando una singola catena polipeptidica si avvolge su se stessa per formare un cilindro rigido. Si forma un legame idrogeno fra un legame peptidico e il quarto successivo, collegando il C=O di un legame con il N-H dell'altro. Il coiled coil è una struttura molto stabile formata da due o tre alfa-eliche che si arrotolano l'una sull'altra, lasciando le catene laterali non polari all'interno.

Qualunque regione di una proteina che può interagire con un'altra molecola tramite legami non covalenti è chiamata sito di legame. Ci sono proteine globulari, fibrose o che formano un'elica, altre hanno grandi quantità di catena polipeptidica non strutturata, come l'elastina, che sfrutta questa caratteristica per donare elasticità. I ponti disolfuro sono legami crociati che possono unire due amminoacidi della stessa proteina o connettere catene polipeptidiche diverse in una proteina multisubunità. I legami disolfuro si creano quando la proteina deve essere esportata dalle cellule.

Molecole proteiche servono come subunità per la formazione di strutture più grandi; questo prevede molti vantaggi: è richiesta una piccola quantità di informazione genetica; assemblaggio e disassemblaggio sono processi controllati e reversibili; si possono evitare errori nella sintesi della struttura. Hanno diverse funzioni, tra cui quella di catalizzare delle reazioni chimiche e mettere in azione l'informazione genetica, specificate dai geni che codificano per quella particolare proteina.

Fungono da enzimi per catalizzare le reazioni in cui si produce energia, formando o distruggendo legami covalenti. Si legano a substrati e li convertono in più prodotti modificati chimicamente. Tendono ad abbassare la soglia dell'energia di attivazione (energia libera richiesta per raggiungere lo stato di transizione più instabile), cosicché si debba fornire meno energia perché una reazione avvenga e perché vi siano collisioni tra molecole. Ogni enzima catalizza una sola reazione; ha una forma unica su cui è presente un sito attivo a cui si attaccano i substrati. Enzimi e substrati si trovano velocemente grazie a movimenti traslazionali, vibrazionali e rotazionali delle molecole. L'enzima fa aumentare la concentrazione locale di substrato e mantiene gli atomi nella giusta direzione. Funzionano con una regolazione a feedback negativo (una molecola li spegne) o a feedback positivo (una molecola li attiva).

• Alcune molecole si legano alle proteine per incrementarne le funzioni; possono essere molecole organiche, atomi di metallo, vitamine o porzioni non proteiche.
• Servono per dare una struttura.
• Servono come motori molecolari per produrre forza e movimento.

Ci sono quattro livelli di organizzazione nella struttura di una proteina:

• Struttura primaria, la sequenza degli amminoacidi.
• Struttura secondaria, tratti di catena polipeptidica che formano eliche e foglietti.
• Struttura terziaria, l'organizzazione tridimensionale completa.
• Struttura quaternaria, un complesso di più catene.

È presente un'altra unità di organizzazione, il dominio proteico, e riguarda tutte le catene che possono ripiegarsi in una struttura completa; comprende dai 40 ai 350 amminoacidi. Sulle proteine sono presenti dei siti di legame tramite cui questa può interagire con altre molecole. Vengono dette paraloghi quelle proteine che hanno diverse funzioni, e ortologhi quelle corrispondenti ma in organismi diversi. Una sottoserie di domini proteici è molto mobile e versatile e viene chiamata modulo proteico.

Le proteine possono avere una forma elicoidale, come l'actina, una forma rotonda, una forma allungata (proteine fibrose che possono assemblarsi per formare filamenti intermedi) come la cheratina; alcune proteine possono avere sequenze amminoacidiche più lunghe non strutturate che interagiscono con altre molecole. Una proteina può legare (tramite la formazione di più legami deboli e interazioni idrofobiche favorevoli) poche o una sola molecola, e questa viene chiamata ligando; la regione in cui questo si lega si chiama sito di legame e consiste in una cavità formata da una particolare disposizione di amminoacidi.

Le proteine si possono legare ad altre proteine in tre modi: interazione superficie-stringa; interazione stringa-stringa, e quindi si forma un coiled coil; interazione superficie-superficie, che è la più forte in quanto si possono formare molti legami deboli. Le proteine subiscono cambiamenti conformazionali per legarsi tra loro, inattivando il sito attivo; se si inibisce uno dei cambiamenti di forma si può rendere unidirezionale la serie di cambiamenti e quindi far sì che la proteina si sposti in una sola direzione (si accoppia al cambiamento conformazionale l'idrolisi di ATP). Il ligando si lega alla proteina tramite il linkage, ma se i ligandi sono due questi devono favorirsi reciprocamente.

Membrana cellulare

Le varie membrane hanno funzioni differenti (definire i confini, mantenere le differenze tra gli organelli e il citosol, contenere processi di trasporto e di comunicazione tra cellule, localizzare certe attività), ma su tutte sono presenti delle proteine che agiscono da sensori per dei segnali: i recettori.

La struttura base è fatta da un doppio strato lipidico che fornisce la struttura fluida di base e serve da barriera al passaggio di molecole solubili in acqua; le molecole lipidiche sono anfipatiche, cioè hanno un'estremità idrofila o polare e una idrofoba o non polare (trovandosi all'interno impedisce il passaggio di molecole polari). Le molecole più abbondanti sono i fosfolipidi, composti da una testa idrofila e due code idrofobe, di solito fatte da acidi grassi, di cui una insatura (cioè contiene doppi legami cis che creano delle pieghe) e una satura. I fosfolipidi principali sono i fosfogliceridi, con un'ossatura di glicerolo a tre atomi di carbonio e acidi grassi, di cui due uniti da legami estere ad atomi di carbonio adiacenti al glicerolo, e uno attaccato ad un gruppo fostato unito ad un gruppo di testa.

Oltre ai fosfolipidi le membrane contengono anche colesterolo e glicolipidi. Il colesterolo è uno sterolo con una struttura rigida ad anello, a cui sono attaccati un gruppo ossidrile polare e una breve catena idrocarburica non polare. I gruppi ossidrilici sono vicino ai gruppi di testa, perché polari come loro. Le strutture principali sono micelle sferiche o doppi strati a foglio perché così le code idrocarburiche possono interagire tra loro e disporsi in modo da non essere a contatto con l'acqua.

I doppi strati lipidici possono autorigenerarsi se si formasse uno strappo; inoltre è molto fluida. La fluidità è mantenuta anche a temperature basse dai legami cis e dalla lunghezza delle code idrocarburiche perché le interazioni e il compattamento sono più complicati. Inoltre il colesterolo fa diminuire la permeabilità del doppio strato lipidico e lo rende meno deformabile perché rende più statici i primi gruppi CH₂ delle code idrocarburiche. La fluidità comunque non diminuisce perché impedisce che le code idrocarburiche si cristallizzino.

La fluidità del doppio strato lipidico è influenzata dalla temperatura, dalla presenza di acidi grassi insaturi (le catene insature rendono meno rigida la struttura, non avendo tutti i carboni occupati), dalla lunghezza degli acidi grassi, dalle caratteristiche delle teste polari (se sono molto grosse, cioè più idrofili, lasciano meno spazio alle code idrocarburiche e quindi più spazio di movimento perché ci sono meno legami), dalla presenza del colesterolo. Ci sono movimenti di flip-flop (passare da un foglietto all'altro), ma avvengono molto raramente; movimenti di diffusione laterale, rotazioni su se stessi e flessione, e avvengono tutti grazie al liquido bidimensionale tra i due foglietti.

Le molecole lipidiche si organizzano in zattere lipidiche che permettono di organizzare alcune proteine di membrana, dal momento che sono più spesse. Alcune molecole lipidiche che non contengono una testa idrofilica, si organizzano in goccioline lipidiche che conservano lipidi neutri e che sono organelli a sé perché ricoperti di fosfolipidi e proteine associate. Vi è una differenza nella distribuzione delle cariche, nella parte citosolica ve ne sono di più negative a causa della presenza della fosfatidilserina. I glicolipidi si trovano solo nella parte esterna della membrana; i gangliosidi contengono acido sialico caricato negativamente.

Ciò che conferisce funzionalità alle membrane sono le proteine di membrana la cui quantità e il tipo sono molto variabili; queste si estendono con parte della loro massa su entrambi i lati e sono anfipatiche rispetto ai lipidi (la parte idrofobica è a contatto con le code, la parte idrofiliche è quella che sporge); ci sono anche proteine solo legate alla parte citosolica o alla parte cellulare esterna tramite un legame covalente lipidico, che può una catena di acidi grassi o un gruppo prenile. Alcune sono attaccate tramite un lipide di collegamento legato covalentemente al fosfatidilinositolo del monostrato non citosolico (ancora di GPI), anche se prima erano proteine transmembrana il cui segmento è stato tagliato via nell'ER.

Alcune sono dette proteine periferiche di membrana perché sono legate solo ad una faccia della membrana tramite interazioni non covalenti con altre proteine e possono essere rilasciate con procedimenti blandi; altre sono dette proteine integrali di membrana perché sono legate al nucleo idrofobico e non possono essere rilasciate facilmente. Alcune proteine di membrana funzionano come parti di complessi multicomponenti. Attraversano il doppio strato sotto forma di alfa-eliche e così massimizzano la formazione di legami idrogeno tra i legami peptidici; inoltre le alfa-eliche interagiscono tra loro e possono far subire cambiamente conformazionali alla proteina, in modo che sia favorito il passaggio di ioni in canali ionici. I legami idrogeno possono essere massimizzati anche formando beta-foglietti, in questo modo la proteina passa più volte attraverso il doppio strato.

Una struttura che facilita il multi passaggio è a barile beta; le proteine possono formare dei pori acquosi (porina) o funzionare da enzimi e recettori. Le proteine transmembrana sono glicosilate perché così si possono ripiegare correttamente e la solubilità aumenta, in modo che possa essere stabilizzata in tutti gli aspetti. Il citosol diminuisce la probabilità che si formino legami disolfuro intracatena o intercatena fra residui di cisteina sul lato citosolico delle membrane, che però si formano sul lato non citosolico e servono per stabilizzare la struttura ripiegata o l'associazione con altre catene polipeptidiche.

I carboidrati rivestono la superficie delle cellule eucariotiche e si trovano come catene di oligosaccaridi legate a proteine o a lipidi. I detergenti (piccole molecole anfipatiche con struttura variabile che rompono le associazioni idrofobiche e distruggono il doppio strato lipidico) possono solubilizzare le proteine transmembrana e intrinseche. Le estremità polari possono essere cariche o prive di cariche. A basse concentrazioni sono monomerici, ma quando si supera la concentrazione micellare critica, si raccolgono a formare micelle.

Le molecole di detergente diffondono dentro e fuori la micella, mantenendo costante la quantità di detergente in soluzione. La CMC e il numero medio di molecole sono proprietà intrinseche, ma possono essere influenzate dalla temperatura, dal pH e dalla concentrazione salina. Le regioni idrofobiche del detergente e della proteina si legano e vengono spostate le molecole lipidiche con un collare di molecole di detergente. L'altra estremità del detergente è polare e quindi il complesso detergente-proteina va in soluzione.

Con detergenti ionici forti, come l'SDS, anche le proteine più idrofobiche possono essere solubilizzate. Questi denaturano le proteine legandosi ai nuclei idrofobici interni, rendendole inattive. In questa forma denaturata, possono comunque essere separate e purificate. Con l'uso di detergenti blandi si possono solubilizzare e purificare in forma attiva le proteine idrofobiche. Questi detergenti coprono le parti idrofobiche dei segmenti esposti che attraversano la membrana della proteina dopo che sono stati rimossi i lipidi.

Se la concentrazione di detergente viene ridotta, le proteine di membrana non restano solubili. Se inoltre ci sono molti fosfolipidi, le proteine vengono incorporate in piccoli liposomi, così sistemi proteici di membrana funzionalmente attivi possono essere ricostituiti da componenti purificati. Le proteine di membrana sono mobili e ruotano attorno ad un asse perpendicolare al piano del doppio strato e sono capaci di diffondere lateralmente.

Una prova è la formazione di eterocarionti dall'unione di cellule umane con cellule di topo su cui sono state marcate delle proteine di membrana. Queste all'inizio si trovavano sulla loro metà, ma dopo mezz'ora diffondevano e si alternavano con le altre. La velocità di diffusione laterale si può misurare con il recupero della fluorescenza dopo fotosbiancamento.

Si prende un marcatore fluorescente e lo si pone su una proteina, poi si sbianca e si aspetta di osservare quanto tempo impiegano proteine adiacenti non marcate a diffondere nella regione sbiancata. Si può utilizzare il metodo analogo di perdita della fluorescenza nel fotosbiancamento, in cui un raggio laser irradia una piccola area per sbiancare tutte le molecole fluorescenti che vi diffondono, svuotando gradualmente la membrana circostante di molecole marcate fluorescenti. Il problema è che questi due metodi, FRAP e FLIP, si basano su grandi aree.

Le proteine e i lipidi sono confinati nei loro domini grazie alla presenza di giunzioni intercellulari, come quelle strette, che impediscono anche che quella stessa cellula non possa diffondere lateralmente. I domini possono anche essere formati senza l'utilizzo di giunzioni strette; ad esempio lo spermatozoo presenta parti strutturalmente e funzionalmente diverse, ricoperte da una membrana plasmatica continua che però ha tre domini distinti. Esiste quindi uno steccato che impedisce che le proteine fuoriescano dal loro dominio.

La mobilità laterale può essere limitata dalla formazione di grossi aggregati autoassemblati dalle proteine, dal legame con complessi di macromolecole all'interno o all'esterno della cellula o dall'interazione con altre cellule. Un esempio è la forma biconcava del globulo rosso, che è data dall'interazione tra la membrana plasmatica e un citoscheletro sottostante formato dalla spettrina tramite proteine transmembrana.

La spettrina è un eterodimero formato da due eliche alfa e beta tenute assieme da legami non covalenti. I dimeri di spettrina sono tenuti assieme in un reticolo da complessi giunzionali, costituiti da filamenti di actina, da adducina e da una molecola di tropomiosina. Il citoscheletro è unito alla membrana da due proteine: una proteina a passaggi multipli chiamata proteina della banda 3 e una proteina a singolo passaggio chiamata glicoforina. Nelle altre cellule del nostro corpo vi è una corteccia citoplasmatica, ricca di filamenti di actina.

Trasportatori attivati

Conservano energia sotto forme che siano facilmente accessibili, come gruppi chimici o elettroni ad alta energia. Sono usate come moneta energetica. Si formano grazie a reazioni accoppiate: una reazione energicamente favorevole è usata per promuoverne una energeticamente sfavorevole (da questa si forma il T.A.). Le più conosciute sono ATP, NADH, NADPH. ATP: sintetizzato in una reazione di fosforilazione in cui un gruppo fosfato viene aggiunto alla molecola di ADP; cede energia tramite...