Biologia cellulare

La superficie cellulare

Innanzi tutto bisogna precisare che parlando di superficie cellulare non intendiamo riferirci alla membrana plasmatica; più precisamente, la membrana plasmatica nello svolgere le sue funzioni non è sola, ma opera in stretta associazione con i due compartimenti ad essa associati:

• Glicocalice
• Citoscheletro

Senza queste interazioni con il glicocalice e con il citoscheletro, molte delle funzioni classicamente attribuite alla membrana plasmatica non potrebbero essere svolte (ad esempio, non potrebbe verificarsi, perché la membrana plasmatica da sola non è in grado di estroflettersi, ma ha bisogno del sostegno del citoscheletro!). Per questo è preferibile parlare di un sistema integrato di strutture, quali glicocalice (out), membrana plasmatica e citoscheletro (in), che nel loro complesso costituiscono la superficie cellulare; ovviamente, la membrana plasmatica è la struttura più importante, ma le attività di maggior rilievo vengono realizzate in collaborazione con il glicocalice e con il citoscheletro.

Il termine glicocalice

Il termine glicocalice deriva da calix saccaridica che si organizzano a formare un rivestimento plasmatica, un intreccio filamentoso, più o meno spesso a seconda del tipo di cellula, strettamente correlato a livello molecolare con i componenti della membrana stessa. In realtà, dal punto di vista molecolare, non è possibile segnare un confine netto fra membrana plasmatica e glicocalice; è più corretto parlare di un sistema continuo di molecole.

Funzioni del glicocalice

Il glicocalice svolge diverse funzioni, attive e passive:

• Protezione da danni meccanici e chimici (ruolo passivo): costituisce un rivestimento che impedisce a molecole dannose di entrare facilmente a contatto.
• Blocco di interazioni molecolari (ad es. proteina-proteina) indesiderate.
• Interazioni molecolari: riconoscimento specifico (es: riconoscimento fra cellula uovo e spermatozoo); adesione cellula-cellula (cellule in tessuti); adesione cellula-matrice; coagulazione del sangue; risposte infiammatorie, ecc.

Composizione del glicocalice

• Oligosaccaridi legati covalentemente a proteine di membrana (glicoproteine).
• Oligosaccaridi legati covalentemente a lipidi di membrana (glicolipidi).
• Glicosaminoglicani legati covalentemente a proteine di membrana (proteoglicani).
• Glicosaminoglicani legati a proteine che, a loro volta, sono legate al doppio strato lipidico.
• Glicoproteine e proteoglicani prodotti dalla cellula, secreti nello spazio extracellulare ed adsorbiti sulla superficie cellulare.

Acido sialico, meglio conosciuto come acido acetilneuraminico, è un carbonio con carattere acido debole. In realtà, ci si riferisce ad una famiglia di oltre 40 aminozuccheri a carattere acido, tutti derivati da modificazioni enzimatiche dell'acido acetilneuraminico. La cosa di maggiore importanza è che quando presente in una catena glucidica, l'acido sialico occupa quasi sempre la posizione terminale delle catene oligosaccaridiche dei glico-coniugati, coinvolti nel mediare e regolare una larga varietà di interazioni cellulari, e che sono riconosciuti da un largo numero di patogeni e di molecole di adesione e segnale variabile. Le integrine contengono un limitato numero di residui di acido sialico, sempre in posizione terminale; alcuni recettori di membrana, come ad esempio il CD34, hanno un numero elevatissimo di ramificazioni glucidiche e tutte terminano con un residuo di acido sialico; i cosiddetti acidi polisialici, invece, si legano ai domini delle immunoglobuline formando delle catene lunghissime che sporgono dalla superficie delle cellule, donando a queste regioni una spiccata carica negativa; infine, piccole quantità di acido sialico possono essere legate ai lipidi di membrana. I glicosamminoglicani (GAGs) sono eteropolisaccaridi costituiti da una successione ordinata di numerosi dimeri; ogni dimero è formato da una unità solforata, nel caso dei GAGs carbossilati (carattere acido debole), oppure può essere solforata (una o più volte), conferendo alla molecola uno spiccato carattere acido (dovuto sia alla presenza di residui carbossilici, che di residui solforici). Quindi i vari GAGs si distinguono per il loro diverso grado di solfatazione e quindi di acidità.

Nel complesso, tutte queste molecole sopra citate non esistono in quanto tali, ma sono sempre strettamente legate ad altre componenti, per cui il complesso molecolare del quale fanno parte può essere indicato con un unico termine: glicoconiugato. I glicoconiugati sono molecole che hanno una componente glucidica (che può essere rappresentata da oligosaccaridi o da GAGs) legata a proteine, lipidi o ad altri componenti particolari. Per cui, parlando di glicoconiugati ci possiamo riferire a:

• Glicoproteine
• Proteoglicani
• Glicolipidi
• Ancore di glicosilfosfatidilinositolo (GPI)

Glicoproteine

Le glicoproteine sono complessi formati da una catena polipeptidica a cui si associano una o più catene oligosaccaridiche. Dal punto di vista quantitativo, la componente più significativa è la componente polipeptidica (generalmente 90-95%), mentre la componente oligosaccaridica va da un minimo di 2% fino ad un massimo del 10-12%. La componente oligosaccaridica determina le proprietà del complesso, non solo dal punto di vista chimico, ma anche dal punto di vista funzionale.

Le glicoproteine possono essere classificate in vari modi: in base al modo in cui gli oligosaccaridi si attaccano, le glicoproteine possono essere classificate in N-glicosilate (la catena glucidica si lega ad un residuo di azoto di un residuo amminoacidico) e O-glicosilate (la catena glucidica si lega ad un atomo di ossigeno di un residuo amminoacidico). Tra i vari amminoacidi che presentano nella loro catena laterale un gruppo amminico, gli amminoacidi in grado di formare un legame con i residui saccaridici tramite un gruppo ossidrilico (-OH), possono essere diversi, anche se quelli più comunemente coinvolti sono la Serina e la Treonina (anche alcuni amminoacidi particolari, quali idrossiprolina e idrossilisina).

La N-glicosilazione è più monotona, la O-glicosilazione è più flessibile poiché può vedere coinvolti diversi residui amminoacidici. Per la N-glicosilazione è necessaria la presenza, nella catena peptidica, di una sequenza segnale che permette la glicosilazione (un amminoacido qualunque seguito da Ser o Thr; quindi la sequenza che permette la N-glicosilazione è: Asn-X-Ser/Thr). La glicosilazione in N di tutte le proteine avviene sempre e solo nel RER e quindi le glicoproteine N-glicosilate sono sintetizzate qui; questo perché nel RER si trova la glicosiltransferasi che taglia il residuo saccaridico dal dolicolo e lo attacca alla proteina. Successivamente, queste glicoproteine si staccano dal RER e attraverso delle vescicole, vengono trasferite alla faccia cis del Golgi, dove la componente glucidica verrà ulteriormente processata ad opera degli enzimi glicosidasi e glicosiltransferasi presenti nelle cisterne golgiane.

Le glicoproteine che fuoriescono dal Golgi, saranno tutte diverse tra di loro (ricordiamo che erano entrate tutte con la stessa catena saccaridica proveniente dal dolicolo) grazie al diverso corredo enzimatico presente in ogni cisterna del Golgi. La O-glicosilazione, invece, avviene nel Golgi e il residuo saccaridico legato al polipeptide è molto più piccolo (2-3 residui saccaridici) rispetto a quello delle proteine N-glicosilate (9-12 residui saccaridici). La O-glicosilazione avviene direttamente nel Golgi. La glicosilazione inizia sempre nel RER, mentre la O-glicosilazione non sempre inizia e finisce nel Golgi.

Questo è il caso del collagene, una glicoproteina O-glicosilata, la cui glicosilazione avviene, in genere, nel RE (ricordiamo che esistono 14 diversi tipi di tropocollagene, che differiscono appunto per la composizione della catena saccaridica).

La diversità delle strutture oligosaccaridiche è enorme; i fattori che determinano questa variabilità sono:

• Quantità di zuccheri presenti nella glicoproteina;
• Variazioni della sequenza zuccherina (ogni glicoproteina ha una sua specifica sequenza oligosaccaridica che è diversa da quella di tutte le altre glicoproteine);
• Posizione dei legami glucosidici;
• Configurazione anomerica (α o β) del legame glucosidico (genera importanti differenze sia dal punto di vista strutturale che dal punto di vista enzimatico);
• Posizione delle ramificazioni.

La variabilità delle catene saccaridiche e la posizione delle ramificazioni rivestono una particolare importanza nelle glicoproteine N-glicosilate, che hanno alberi glucidici più lunghi e più variamente ramificati. N.B.: lo zucchero terminale della catena saccarica riveste sempre una particolare importanza. Uno zucchero molto importante, che non si ritrova normalmente come costituente di altre molecole ma che è spesso presente negli oligosaccaridi, è il fucosio, e in particolare l'α-L-FUCOSIO; questo zucchero viene spesso utilizzato nei meccanismi di riconoscimento e interazione tra spermatozoo e cellula uovo, nella nostra specie.

Lectine

Da quanto detto appare evidente che conoscere la struttura, la sequenza, e soprattutto, qual è lo zucchero terminale (che in genere funge da segnale per il riconoscimento) di una catena oligosaccaridica di un qualsivoglia glicoconiugato di membrana, è un fatto di notevole rilevanza. Come si è arrivati a conoscere la struttura di queste catene oligosaccaridiche? Ci si è arrivati grazie allo studio delle lectine, proteine in grado di riconoscere e legare specifiche strutture carboidratiche: in particolare, riconoscono e legano lo zucchero terminale della catena oligosaccaridica. Per ogni zucchero esiste una o più specifiche lectine in grado di riconoscerlo e legarlo; inoltre, esistono lectine in grado di riconoscere e legare un dato zucchero solo se legato ad un altro. Quindi per ogni residuo terminale di una catena glucidica e per ogni sequenza di zuccheri, esiste una lectina in grado di riconoscerlo e legarlo specificamente. Si ritrovano, ubiquitarie, in animali, piante, funghi e batteri; intervengono pesantemente nelle interazioni cellula-cellula proprio grazie alla loro capacità di riconoscere e legare specifici residui glucidici: le lectine presenti sulla superficie di una cellula interagiscono con i carboidrati presenti sulla superficie di altre cellule.

La prima classificazione delle lectine animali si è fondata, inizialmente, sulla base della sequenza carboidratica riconosciuta; oggi si basa, piuttosto, sulle omologie di sequenza amminoacidica e sulle loro relazioni evolutive.

Proteoglicani

Sono costituiti da un asse proteico a cui si legano delle enormi catene di GAGs. Il sistema di ancoraggio è costituito da un trisaccaride con sequenza Xyl-Gal-Gal. I proteoglicani vengono rilasciati nella matrice extracellulare e, in genere, tendono ad aggregarsi fra loro, formando i cosiddetti aggregati proteglicanici, costituiti da una gigantesca molecola di acido ialuronico (che funge da scheletro) alla quale si legano i proteoglicani; questi aggregati raggiungono dimensioni talmente elevate che possono essere fotografati al microscopio elettronico. I proteoglicani sono molecole molto reattive grazie alla presenza di numerosi gruppi carichi negativamente, che consentono a queste molecole una grande quantità di interazione ionica (con altre molecole di carica opposta). Quindi nella matrice extracellulare, i proteoglicani possono interagire fra di loro e con tutti gli altri componenti della matrice stessa; queste connessioni imprimono alla matrice delle caratteristiche peculiari, che sulla base della quantità di queste molecole assume un grado di consistenza variabile (più o meno gelificata). È proprio la grande quantità di proteoglicani che consente alla matrice cartilaginea di raggiungere una consistenza tale da renderla un ottimo tessuto di sostegno.

Un discorso a parte va fatto per i proteoglicani di membrana, costituiti da piccole catene polipeptiche, che si inseriscono, in varia misura, come proteine transmembrana, alle quali si trovano legate, sul versante extracellulare, delle piccole catene di GAGs. Oggi si conoscono diverse tipologie di queste molecole di membrana, anche se le famiglie più conosciute sono rappresentate dai sindecani e dai glipicani.

Sindecani

I sindecani sono meglio conosciuti con la sigla HSPGs (eparan-solfato proteoglicani trans membrana); sono proteine transmembrana di tipo I, che presentano domini transmembrana e citoplasmatici omologhi. Tali domini contengono quattro residui di Tyr ben conservati che svolgono un ruolo critico nelle loro funzioni biologiche. La coda citoplasmatica del sindecano-1 interagisce con i microfilamenti mentre quella del sindecano-4 interagisce con le molecole di adesione focale; questo significa che ciascun sindecano svolge un ruolo ben preciso. I sindecani svolgono importanti funzioni quali fattori anticoagulanti nelle cellule endoteliali, funzioni recettoriali per il FGF (fattore di crescita per i fibroblasti) o nella trasduzione del segnale.

Glipicani

I glipicani, altra famiglia di HSPGs della superficie cellulare, possiedono una regione extracellulare con siti di attacco per GAG; contengono 14 residui invarianti di Cys che servono a stabilizzare una struttura terziaria altamente compatta ed un'ancora C-terminale di glicosil-fosfatidilinositolo (GPI). I glipicani sono espressi selettivamente in diversi tipi cellulari (non sono ubiquitari) e si ritiene svolgano importanti funzioni quali, ad esempio, il controllo della biodisponibilità di alcuni fattori di crescita, anche se in molti casi le funzioni sono sconosciute.

Glicolipidi

I glicolipidi sono componenti ubiquitari della membrana plasmatica di quasi tutti i tipi cellulari. I più comuni glicolipidi presenti nelle membrane delle cellule dei mammiferi sono rappresentati da una classe di sfingolipidi, i glicosfingolipidi. Il più importante gruppo di glicosfingolipidi è rappresentato dai gangliosidi, derivati dalla glucosil-ceramide. I glicolipidi di membrana sono meno rappresentati rispetto alle glicoproteine, ma svolgono importanti e peculiari funzioni di riconoscimento.

Una specifica categoria di glicolipidi di membrana, ossia quelli che costituiscono i determinanti dei gruppi sanguigni e in particolare quelli che rappresentano il principale sistema di gruppi sanguigni, ovvero il Sistema AB0. Gli antigeni protagonisti alla superficie eritrocitaria sono degli sfingolipidi e quindi sono molecole costituite da una lunga coda lipidica che si insinua nel bilayer lipidico della membrana e sporge nel versante citoplasmatico; sul versante citosolico la coda lipidica porta legata una catena oligosaccaridica.

Nella nostra specie si distinguono due tipi di antigeni principali: A e B. Tutti e tre gli antigeni hanno una base strutturale comune, che è quella che caratterizza l'antigene 0. Se la catena oligosaccaridica si ferma a questa tipologia di zuccheri, non vengono manifestate proprietà antigeniche: ecco perché si parla di antigene 0. Se al Gal(1,3), un residuo di N-acetilgalattosamina o galattosio, si aggiunge un residuo di Galattosio (Gal), sempre con ramificazione (1,3), avremo l'antigene B. Quindi: gli antigeni A e B differiscono dall'antigene 0 per la presenza di un residuo di N-acetilgalattosamina o galattosio. A, sulla superficie dei globuli rossi potrà essere presente:

• Antigene A: individuo A;
• Antigene B: individuo B;
• Antigene 0: individuo 0;
• Antigeni A e B: individui AB.

Questi antigeni rappresentano la principale serie di antigeni del sangue, ma non sono i soli poiché esistono altre serie antigeniche seppur di minore importanza dal punto di vista della citocompatibilità; ad esempio, esistono gli antigeni della serie M-N, dimostrato che possono essere trovati anche a carico di certi lipidi di membrana. Un altro importante antigene della superficie eritrocitaria è rappresentato dal fattore Rh, che può essere presente o assente; gli individui che lo presentano si dicono essere Rh-positivi, mentre gli individui che non lo presentano si dicono Rh-negativi. Gli individui Rh-negativi rappresentano circa il 15% della popolazione.

La presenza o assenza di questi antigeni non è un fatto a sé stante, perché sappiamo che nel siero del sangue sono presenti degli anticorpi, sotto forma delle cosiddette agglutinine, capaci di riconoscere tali anticorpi; la presenza degli anticorpi nel siero del sangue è correlata alla specifica manifestazione antigenica: gli individui che portano entrambi gli antigeni, A e B, non hanno anticorpi nel siero; gli individui 0, invece, possiedono anticorpi contro gli antigeni A e B. Quindi, se il sangue di un individuo viene trasfuso in un individuo che ha un gruppo sanguigno diverso, possono derivarne varie implicazioni, a seconda del tipo di antigene che donatore e ricevente manifestano. Questo sistema è stato scoperto grazie all'opera di Karl Landsteiner, che fu il primo ad individuare il sistema AB0.

La presenza dei diversi gruppi sanguigni è legata al fatto di possedere, nel proprio corredo genetico, specifici geni che codificano per enzimi della famiglia delle glicosiltransferasi, che determinano la produzione degli antigeni A e B; se questi geni non sono presenti nel corredo genetico di un individuo, viene prodotto solo l'antigene 0. Il sistema AB0 è caratterizzato dalla mancanza di antigenicità e quindi il primitivo gruppo sanguigno si ritiene sia stato il gruppo 0; successivamente è comparso il gruppo A, poi il gruppo B, e solo in tempi molto recenti è comparso il gruppo AB (infatti, in percentuale sono quelli meno rappresentati nella popolazione: 2-4 %, fino ad un massimo del 10% in alcune popolazioni della Corea).

Normalmente, gli antigeni del sistema AB0 sono presenti nei glicolipidi della membrana plasmatica dei globuli rossi; inoltre, in circa l'80% degli individui, noti come "secretori", essi vengono secreti come componenti O-linked di glicoproteine. Tali glicoproteine vengono secrete dalle ghiandole esocrine e per certi versi si ritrovano anche nelle mucose.