Biologia cellulare (parte della prof.ssa Donati)

Cellule staminali

La cellula è l'unità fondamentale della materia vivente e ne possiede tutte le proprietà.

Teoria cellulare

La riproduzione è la caratteristica fondamentale della cellula:

• Tutti gli organismi viventi sono costituiti da cellule.
• Le cellule sono unità fondamentali degli organismi.
• Le cellule si originano solo dalla divisione di cellule pre-esistenti.

L'unità di misura idonea è il μm (micrometro) che corrisponde a 10^-6m. Il parametro critico per le dimensioni cellulari è il rapporto Superficie/Volume, perché la diffusione di una sostanza diventa troppo lenta se il volume della cellula è troppo grande. Per mantenere le loro dimensioni, le cellule devono coordinare la loro crescita, cioè l’aumento della loro massa, con la divisione, ripartendo il citoplasma in maniera simmetrica.

Le variazioni di forma possono rappresentare una strategia per aumentare il rapporto superficie/volume. Es. microvilli degli enterociti o cellule assorbenti dell’intestino tenue che svolgono alcuni passaggi della digestione extracellulare e assorbono nutrienti. Questo processo è reso più semplice dalla presenza di microvilli, che aumentano la superficie di scambio (aumenta al massimo rapporto Superficie/Volume).

Ciclo cellulare

Una divisione cellulare produce un organismo completo per organismi unicellulari; per produrre un organismo funzionante devono avvenire tante divisioni necessarie durante la vita dell’adulto per la sostituzione delle cellule che muoiono. In tutti gli organismi, la replicazione del DNA e la segregazione nelle cellule figlie sono caratteristiche universali.

I meccanismi di controllo dei diversi eventi del ciclo cellulare sono essenzialmente gli stessi in tutte le cellule eucariotiche e sono apparsi un miliardo di anni fa e si sono conservati. Oltre a duplicare il loro genoma, la maggior parte delle cellule deve anche duplicare gli altri organelli e macromolecole, altrimenti le cellule figlie diventeranno sempre più piccole; in altre parole, la divisione cellulare deve essere coordinata con la crescita.

Durante lo sviluppo embrionale, si indirizzano specifiche cellule verso un preciso programma differenziativo. Tutto questo è strettamente regolato a livello genico. Tutte le cellule derivano dallo zigote, la cellula totipotente. Altre cellule hanno un potere pluripotente (staminali embrionali) o multipotenti (staminali tissutali).

Cellula staminale

La cellula staminale è una cellula che si divide (di solito raramente) per un tempo indefinito dando origine a due cellule diverse tra loro, una cellula figlia che è uguale alla cellula madre (staminale), dotata di self-renewal, mentre l’altra cellula, progenitore, è diversa, potrà dividersi numerose volte ma non indefinitivamente e la sua progenie andrà incontro a differenziamento terminale, diventando cellula matura. Divisione asimmetrica.

Il differenziamento darà origine a cellule mature con precise caratteristiche morfologiche e fenotipiche (es: cellule muscolari, neuroni, linfociti). Una cellula staminale può andare incontro sia a divisione simmetrica che asimmetrica. A seconda delle necessità, può intraprendere il percorso necessario (un danno a numerose cellule staminali rende ad esempio necessario una divisione simmetrica che genera due progenitori, quindi per auto-mantenimento).

Ad oggi non esiste una definizione esaustiva e puntuale di cellula staminale. Non disponiamo di marcatori molecolari che ci permettono di distinguere le due cellule figlie della cellula staminale. La definizione si basa su saggi funzionali retrospettivi e dipende quindi dal comportamento della cellula staminale (spesso in un tessuto diverso da quello di origine) e in vivo. Esiste quindi il problema della manipolazione che può alterare le attribuzioni funzionali della cellula staminale.

Saggio retrospettivo funzionale

Es: Un topo viene irradiato, uccidendo tutte le staminali emopoietiche. È possibile trapiantare da un topo sano una parte di midollo, facendo sopravvivere il topo irradiato. Il topo sopravvive se vengono trapiantate le staminali, perché hanno capacità di self-renewal; se però si trapiantano i progenitori, il topo vive per un po', ma poi muore perché tali cellule non hanno la capacità di self-renewal.

Una cellula staminale adulta ematopoietica trapiantata in un topo letalmente irradiato ha la capacità di rigenerare tutti gli elementi figurati del sangue per tutta la vita di quel topo. È possibile, inoltre, trapiantare il midollo di quel topo in un secondo topo irradiato e ripetere la procedura più volte. Al contrario, se venisse trapiantato un progenitore, questo sarebbe in grado di dare vita agli elementi figurati del sangue solo per un periodo limitato di tempo. Se la cellula donatrice è isolata da un topo transgenico che esprime in tutte le sue cellule la proteina fluorescente verde (GFP), tutte le cellule derivate dalla cellula donatrice saranno facilmente identificabili perché verdi.

GFP è una sonda universale nella ricerca biologica con un potenziale virtualmente illimitato (molto versatile). È stata isolata da una medusa.

Animali transgenici

Gli animali transgenici possiedono in tutte le cellule del loro organismo un patrimonio genetico (genoma) modificato tramite l'inserzione di almeno un frammento di DNA di origine estranea (esogena), detto transgene.

In base alle conoscenze attuali le cellule staminali vengono divise in due gruppi:

• Cellule staminali embrionali (ESC): blastocisti – uno stadio di sviluppo molto precoce dell’embrione.
• Cellule staminali tissutali (adulte, ASC): feto, bambino e durante tutta la vita.

Bisogna considerare che fra le cellule staminali adulte si considerano quelle neonatali, quelle fetali, quelle isolabili da sangue cordonale e dalla placenta. Altra terminologia per le cellule staminali adulte ASC è cellule staminali tissutali o somatiche.

Il malfunzionamento dei meccanismi che assicurano l’equilibrio tra rinnovamento e differenziamento delle cellule staminali sono alla base di alcune patologie, dovute a:

• Le cellule staminali perdono la capacità di automantenersi.
• Un tessuto sottoposto a danno cronico vede il graduale esaurimento del compartimento staminale (non si rigenera il tessuto).
• Quando una popolazione staminale si autorinnova in maniera incontrollata, potrebbe instaurarsi un meccanismo in grado di sviluppare tumori.

Si deve al biologo tedesco Ernst Haeckel nel 1868 l’utilizzo del termine cellula staminale (stammzell, zell = cellula, stamm = stipite) per cellula capostipite di una discendenza cellulare. Successivamente altri scienziati come August Weismann (1885), Alexander Maximov (1908), Wera Dantschakoff (1908) iniziarono ad usare il termine cellula staminale.

• Cellula totipotente: è la capacità di una singola cellula di dividersi e produrre tutte le cellule differenziate in un organismo, compresi i tessuti extra-embrionali. Le cellule staminali totipotenti sono gli zigoti e i blastomeri, ossia le cellule della morula dell’embrione di 2-4 giorni.
• Cellula pluripotente: è la capacità di una singola cellula di dividersi e dar luogo ad una progenie in grado di differenziarsi in uno qualsiasi dei tipi cellulari derivati dai tre strati germinali (no tessuti extra-embrionali): endoderma, mesoderma, ectoderma. Le cellule staminali embrionali sono pluripotenti.
• Cellule multipotenti/oligopotenti: hanno la capacità di differenziarsi in diversi tipi di cellula. Le cellule staminali adulte ematopoietiche sono un esempio di cellule staminali multipotenti.
• Cellule bipotenti/unipotenti: hanno la capacità di differenziarsi in due oppure in un singolo tipo di cellula. Un esempio di cellula staminale adulta unipotente è la cellula satellite, residente nel muscolo scheletrico, che normalmente può generare un solo tipo di cellula, il miocita del muscolo scheletrico.

Le cellule staminali embrionali (ESC) sono presenti nella massa cellulare interna (o embrioblasto) della blastocisti, poco prima dell’impianto nella mucosa uterina.

Le ESC possono essere coltivate in opportune condizioni per lunghi periodi di tempo e sono in grado di generare un numero elevatissimo di cellule figlie in grado di differenziare in tutti i tessuti dell’organismo e per tale motivo sono definite pluripotenti. Per prendere l’embrioblasto si deve rimuovere il trofoblasto.

Test della pluripotenza

Le cellule staminali sono state inizialmente isolate da una blastocisti murina (Evans e Kaufman). Una volta in vitro, tali cellule potevano essere tenute in coltura tramite automantenimento, presentavano self-renewal e potevano dare vita a tutti gli altri tipi cellulari. Per convincersi che tali cellule erano effettivamente staminali pluripotenti, effettuarono diversi test:

• Formazione di chimere (ovviamente non applicato a ESC umane): Quando iniettate nella cavità di una blastocisti ospite, la blastocele, le ESC sono in grado di colonizzare tutti i tessuti dell’embrione chimerico (chimerico perché composto da due genomi diversi) compresa la linea germinale. Se queste cellule sono pluripotenti possono quindi sostenere la formazione di tutti i tessuti.
• Formazione di teratomi: Se iniettate sottocute in un topo immunodepresso, le cellule pluripotenti generano un teratoma. Il teratoma è un tumore dei tessuti embrionali, che è indice della potenza differenziativa (la pluripotenza) delle cellule che lo generano. Infatti, è composto da tessuti derivanti da tutti e tre i foglietti embrionali: ectoderma, endoderma e mesoderma. Di qui la sua composizione morfologica che include tessuto nervoso, peli, tessuto tiroideo, tessuto osseo, cartilagineo, muscolare e così via.
• Differenziamento in vitro: Le ESC possono essere coltivate in opportune condizioni e sono in grado di perdere le caratteristiche di pluripotenza e sono in grado di differenziare in popolazioni cellulari mature appartenenti a ciascuno dei tre foglietti germinativi. Per mantenere una ESC nel suo stato differenziato è necessario che esprima fattori trascrizionali embrionali come Oct4 e Nanog e riceva costantemente nel mezzo di crescita la citochina LIF (Leukemia Inhibitory Factor) su uno strato di cellule nutrici (feeder layer).

Le prime blastocisti umane utilizzate per prelevare cellule staminali erano sovrannumerarie in un processo di fecondazione assistita. Queste cellule avevano citoplasma ridotto e marcatori di pluripotenza.

Problematiche nell’utilizzo di cellule staminali

• Polemiche di natura etica.
• Mancanza di leggi o leggi troppo restrittive o poco chiare.

Molteplici studi in modelli animali hanno dimostrato che le ESC possono migliorare alcune malattie congenite, malattie cardiovascolari e diabete e traumi del midollo spinale. Ad oggi sono in corso sperimentazioni cliniche fase I e fase II con ESC (Prof. Pete Coffey, UCL Londra, terapia cellulare per curare degenerazione maculare legata all’età che porta alla perdita della visione).

Tuttavia, le ESC umane ottenute da embrioni non impiantati ottenuti in eccesso durante le procedure di fecondazione in vitro (IVF) sono immunologicamente diverse dal paziente trapiantato, si renderebbero necessarie dunque terapie immunosoppressive come nei trapianti d’organo. Non è da sottovalutare il rischio dell’insorgenza di teratomi. Si cerca di utilizzare ESC già parzialmente indirizzate (parzialmente differenziate) verso il tipo cellulare da curare. Le ESC possono essere modificate geneticamente sostituendo un gene di interesse con uno mutato mediante ricombinazione omologa. Iniettate nella blastocele di una blastocisti ospite, le ESC modificate geneticamente possono colonizzare tutti i tessuti dell’embrione, creando dei modelli di malattie umane.

Cellule staminali adulte (ASC)

È oggi superata la classificazione di Giulio Bizzozero, medico ed istologo torinese dell’Ottocento (al quale si deve l’inizio dello studio sistematico sulle cellule staminali), in:

• Tessuti ad elementi labili: midollo osseo, epiteli di rivestimento e loro derivati.
• Tessuti ad elementi stabili: fegato, rene, pancreas, alcune ghiandole, tessuti connettivi e muscolo liscio.
• Tessuti ad elementi perenni: muscolo striato scheletrico e cardiaco, tessuto nervoso.

Capacità rigenerative del fegato note da molto tempo (Mito di Prometeo).

Lo studio delle cellule staminali embrionali è ancora agli inizi e devono essere chiariti a fondo i meccanismi che regolano l’espansione in vitro, l’instabilità cromosomica, le mutazioni cromosomiche che potrebbero subire in coltura, la loro tendenza spontanea al differenziamento, devono essere identificati i marcatori di staminalità in modo esaustivo.

La cellula staminale adulta tissutale (ASC) è una cellula indifferenziata, non specializzata che appartiene ad un tessuto differenziato. Essa è capace di autorinnovamento che permane per tutta la durata dell’individuo, e dà origine a un grande numero di discendenti, le cellule specializzate mature di quel tessuto cui appartiene.

La cellula staminale genera dei tipi cellulari intermedi detti progenitori che sono commissionati e solo parzialmente differenziati, ancora proliferanti e in grado di dare origine alle cellule differenziate.

La funzione principale delle cellule staminali adulte è di mantenere l’omeostasi e sostituire le cellule che vengono perse, seppur con alcune limitazioni, per malattia o traumi. Il comportamento delle cellule staminali adulte è molto influenzato dal microambiente in cui si trovano.

Le cellule staminali sono necessarie dovunque ci sia bisogno di sostituire cellule differenziate che non possono dividersi. Lo studio dei fattori alla base della rigenerazione dei tessuti in vivo è una parte importante della ricerca sulle cellule staminali, le quali devono parte della loro notorietà alle abilità terapeutiche prospettate per risolvere malattie ad oggi altrimenti incurabili.

Dove si trovano le cellule staminali adulte dei tessuti?

Le cellule staminali adulte sono presenti virtualmente in tutti i tessuti anche in quelli considerati privi di cellule mitotiche allo stadio adulto. Le cellule staminali adulte si trovano nel midollo osseo, sangue, cornea, fegato, epidermide, epitelio bronchiale, pancreas, tratto gastrointestinale, tessuto adiposo sono fonti di cellule staminali adulte. Presenti nei tessuti a rapido ricambio fisiologico: epiteli e sangue. Recentemente sono state evidenziate in tessuti una volta considerati “perenni”: nervoso, muscolare scheletrico.

Negli anni '90, Samuel Weiss e Brent Reynolds hanno identificato le cellule staminali neurali nel cervello maturo. Tali cellule sostengono la produzione di un numero limitato di neuroni nell’ippocampo, deputato alla memoria e all’apprendimento, e nella zona sottoventricolare. Tessuti diversi ne contengono quantità diverse, sono rare e poco proliferanti.

In condizioni di equilibrio, il 50% della progenie delle cellule staminali di una generazione deve rimanere staminale. In teoria esistono due meccanismi per mantenere tale equilibrio, per asimmetria ambientale o per asimmetria divisionale.

Nella asimmetria divisionale la cellula staminale ha un’asimmetria interna e si divide in due cellule figlie già dotate di determinanti diversi al momento della nascita. Nella asimmetria ambientale le cellule figlie di una cellula staminale sono inizialmente simili e possono essere indirizzate a destini diversi sulla base di diverse influenze ambientali che agiscono dopo la loro nascita.

Le capacità di self-renewal e di generare discendenti differenziati sono difficili da provare in vivo. La cellula staminale adulta è cioè clonogenica in grado di generare una linea di cellule identiche in grado di differenziare nei tipi cellulari dei tessuti in cui risiede. La clonogenicità viene dimostrata in vitro. La clonogenicità è difficile da dimostrare in vivo, viene valutata la capacità di potenziali cellule staminali adulte di rigenerare il tessuto. È difficile, se non impossibile, distinguere la cellula staminale dal progenitore.

Le cellule che si amplificano in transito (TA) transitano dal carattere staminale al carattere differenziato e grazie ai cicli di divisione che attraversano hanno l’effetto di aumentare il numero di progenie differenziata che deriva da una sola divisione di una cellula staminale. Questo permette alla popolazione di cellule staminali di dividersi raramente e di generare un’abbondante riserva di nuove cellule differenziate. Da un progenitore si ottengono tanti altri progenitori e quindi tante cellule differenziate.

L’utilizzo di cellule che si amplificano in transito permette alle cellule staminali di essere presenti in un numero limitato e possedere una velocità di divisione bassa. Ciò riduce l’accumularsi di mutazioni durante la replicazione del DNA. Inoltre, una velocità di divisione staminale bassa in condizioni normali permette un notevole aumento quando vi è una necessità urgente.

Ipotesi dei filamenti immortali

Le cellule staminali possono segregare in modo asimmetrico i loro filamenti di DNA in modo che in ogni divisione il DNA marcato in origine venga mantenuto dalla cellula staminale. Questo filamento dovrebbe aver acquisito un contrassegno speciale. Ipotesi non universalmente accettata, ma dimostrata in cellule staminali di muscolo, staminali epiteliali.