Biologia cellulare- Parte 1

COMPONENTI

Un citometro a flusso è costituito da :

• Sistema fluidico → per il trasporto del campione e la sua focalizzazione idrodinamica

• Sistema Ottica:

◦ Sorgenti di eccitazione → laser

◦ Circuito di rilevazione → permetterà di rilevare segnali luminosi scaturiti da incontro.

• Sistema Elettronico → per l'acquisizione, l'elaborazione e la rappresentazione dei dati.

SISTEMA OTTICO

L'ottica di eccitazione consiste di :

• Uno o più laser come sorgente luminosa

• Lenti di focalizzazione per collimare il fascio luminoso prima del punto di interrogazione

L'ottica di rilevazione comprende :

• Una lente di collezione che raccolga tutti i segnali generati dall'interazione del fascio

luminoso con la singola cellula

• Un sistema di specchi e filtri ottici in grado di separare le specifiche lunghezze d'onda

che devono essere raccolte dai differenti rivelatori

SORGENTI LUMINOSE

• Laser, in grado di emettere luce monocromatica e unidirezionale di notevole intensità in

determinate regioni spettrali del visibile e dell’ultravioletto; Il laser ha un’elevata potenza

specifica e permette, perciò, di misurare minime quantità di fluorocromo. Inoltre

possiede grande stabilità spaziale e di intensità.

Ha l’inconveniente di emettere un numero limitato di frequenze utili. Nella maggior parte degli

strumenti viene impiegato un laser a ioni Argon, di potenza variabile, accordato sulla

lunghezza d’onda di 488 nm (blu). Questa particolare lunghezza d’onda consente una

efficiente misura dei parametri fisici e può eccitare contemporaneamente diversi fluorocromi.

LASER è un acronimo che sta per: Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation

Il laser è un dispositivo che crea e amplifica un sottile raggio di luce coerente di elevata

intensità. Nel laser gli atomi o le molecole di un cristallo o di un gas o di un liquido o di altre

sostanze sono eccitati a livelli energetici più alti. Il laser è progettato in modo che gli atomi

eccitati emettano fotoni di una sola o pochissime frequenze e con la stessa direzione: si deve

quindi trovare l’atomo adatto e creare un ambiente che consenta tale produzione.

L’interazione del fascio di luce con la cellula dà luogo a fenomeni di:

◦ LIGHT SCATTERING →

I due segnali che permettono di identificare le caratteristiche fisiche delle popolazioni cellulari

sono correlabili: alle dimensioni delle cellule. Se si osserva una cellula in controluce, si misura

un segnale legato alla diffrazione che è in relazione al diametro cellulare (Forward Scatter o

scatter lineare = FSC), rilevato lungo l’asse della luce incidente.

Alla granulosità cellulare, al rapporto N/C e alla irregolarità della superficie cellulare. Se ci si

pone ortogonalmente al fascio, si misura un segnale legato sostanzialmente alla riflessione e

alla rifrazione (Side Scatter o scatter a 90° = SSC)

La combinazione dei due tipi di segnali ( Side Scatter + Forward Scatter) permette di ottenere

un particolare diagramma di dispersione a punti denominato CITOGRAMMA nel quale si

possono evidenziare fino a 5 o 6 differenti popolazioni cellulari, in base alle sole caratteristiche

fisiche. Ogni cellula è identificata da un preciso valore di FSC e SSC.

◦ FLUORESCENZA →

E’ il fenomeno per cui una molecola colpita da una radiazione luminosa di definita lunghezza

d’onda ne emette un’altra a lunghezza d’onda maggiore e ad energia inferiore. Molte molecole

biologiche posizionate sulla membrana plasmatica, nel nucleo o nel citosol, possono venire

identificate con ligandi fluorescenti o con specifici anticorpi monoclonali marcati con

fluorocromi. Altre sostanze (DNA, RNA, proteine, ioni citoplasmatici) possono essere colorate

direttamente con fluorocromi che si legano ad esse stechiometricamente.

◦ IL FLUOROCROMO ASSORGE ENERGIA DAL LASER

◦ IL FLUOROCROMO RILASCIA ENERGIA ASSORBITA PER :

▪ vibrazione e dissipazione del calore

▪ Emissione di fotoni di lunghezza d'onda più lunga

FLUOROCROMI

Ogni fluorocromo presenta una caratteristica eccitazione, emissione e brillantezza.

Se si usano più fluorocromi (in analisi multiparametriche) nello stesso protocollo sperimentale,

le loro emissioni devono essere sufficientemente distanti per poter essere selezionate in modo

distinto, ciascuna da un rivelatore (PMT).

Anche le cellule non marcate con alcun fluorocromo presentano una debole fluorescenza di

fondo, l’autofluorescenza, misurabile.

Due dei fluorocromi più usati in CFM sono

• FITC isotiocianato di fluoresceina emette nel verde con massimo 520 nm

• PE ficoeritrina emette nel giallo/arancio (eccitazione 488-561nm) emissione 576 nm

L'intensità della fluorescenza dipende dall'intensità dei siti di legame

Principio di rilevazione dei dati

Le cellule, forzate ad allinearsi, attraversano individualmente un punto di misura, dove

interagiscono con il raggio luminoso del sistema di eccitazione. E’ da questa interazione che,

per fenomeni di diffrazione, rifrazione, riflessione e fluorescenza vengono generati dei segnali,

raccolti da un sistema di lenti, specchi dicroici e filtri ottici ed inviati ai relativi sensori

(fotomoltiplicatori) che ne misurano l’ampiezza.

I segnali provenienti da ogni sensore sono digitalizzati, associati fra loro ed inviati ad un

elaboratore che provvede alla presentazione dei dati ed alla loro definizione statistica.

SISTEMA DI RILEVAZIONE

E’ costituito da sensori denominati fotomoltiplicatori (PMT) o detectors che trasformano i

segnali ottici in intensità di corrente elettrica, oltre ad amplificare lo stesso segnale in maniera

lineare o logaritmica. I segnali provenienti dai PMT sono impulsi analogici ossia proporzionali

in maniera continua alle dimensioni del parametro analizzato. Un convertitore spezzetta i valori

continui rendendoli discreti.

I segnali provenienti da ogni sensore sono digitalizzati, associati fra loro ed inviati ad un

elaboratore che provvede alla presentazione dei dati ed alla loro definizione statistica. La

statistica si basa sull’impostazione di cursori che definiscono le aree di interesse calcolando gli

eventi che cadono al loro interno.

QUANTIFICAZIONE DI UN IMPULSO

• ALTEZZA → è proporzionale alla quantità di fluorocromo legato alla celleula.

• AMPIEZZA → è proporzionale al tempo che la cellula impiega ad attraversare il raggio

laser

• AREA → è l'integrale matematico di un singolo impulso ; rappresenta l'emissione totale

di luce ed proporzionale alla quntità totale di fluorocromo sulla cellula.

Ogni singolo valore relativo a ciascun parametro misurato, dopo essere stato amplificato e

convertito, rappresenta il “quanto” citometrico e prende il nome di EVENTO

Tutti gli eventi relativi all’insieme dei dati misurati si accumulano nei canali, che rappresentano

la distribuzione dei valori.

RAPPRESENTAZIONE DEI DATI

• La rappresentazione più semplice di un dato citometrico è la creazione di un

istogramma, in cui gli eventi accumulati nei diversi canali forniscono un diagramma di

distribuzione delle frequenze. Il diagramma ad istogrammi rappresenta graficamente la

misura di un singolo parametro.

• Un’altra rappresentazione è quella detta bidimensionale a parametri correlati, il cui

diagramma è definito dot-plot .

Il diagramma di dispersione a punti o dot plot rappresenta la correlazione fra due parametri, in

cui ogni punto rappresenta un singolo evento dotato di un particolare valore per ciascuno dei

due parametri. All’interno dei dot plot si possono definire quadranti e finestre di diverse

dimensioni.

Vantaggi dell’analisi in CFM

• Multiparametricità

• Possibilità di mettere in relazione fra loro più caratteristiche della stessa cellula

• Analisi di grandi quantità di cellule

• Riproducibilità ed affidabilità statistica delle letture

• Grande sensibilità

• Rapidità dei tempi di analisi

• Possibilità di eseguire ulteriori analisi a posteriori su dati in memoria

Fluorocromi intercalanti, sono praticamente non fluorescenti quando liberi nel solvente, ma

aumentano notevolmente la loro efficienza quantica quando legati al DNA.

Si legano in modo stechiometrico al DNA, la fluorescenza emessa sarà proporzionale al

contenuto di DNA Ioduro di propidio (PI) ha una larga banda di assorbimento nel visibile

con massimo nel verde, ma anche nel blu ed un’altra in UV.

L’emissione avviene nel rosso con un massimo a 620 nm. Si può quindi usare in

multiparametrica con altri fluorocromi (FITC e PE) anche se vi è sovrapposizione parziale

con l’emissione di PE.

PI e il bromuro di etidio (EB) si intercalano sia con DNA che con RNA a doppia elica,

rendendo necessaria la digestione enzimatica dell’RNA o denaturazione ottenuta con

RNasi aggiunta al colorante.

Analisi del contenuto di DNA in CFM

Si può valutare la % di cellule in G1/G0, S, G2/M integrando le aree sottese alle varie zone

del grafico.

Le cellule che hanno un DNA non replicato sono in fase G1/G0 .

Le cellule che hanno replicato il proprio DNA hanno un contenuto doppio di DNA rispetto

alle cellule che si trovano in G1/G0 Le cellule che hanno un contenuto intermedio di DNA

sono in fase S.

PARAMETRI DERIVATI DALLA

DETERMINAZIONE DEL CONTENUTO DI DNA

Percentuale di cellule nelle fasi del ciclo cellulare:

• G0/G1

• S SPF S-phase fraction

• G2-M

La misura del contenuto di DNA fornisce anche

informazioni di tipo citogenetico (il grado di ploidia

per singola cellula) oltre che sullo stato

proliferante del clone in esame determinando con esattezza la distribuzione delle cellule

nelle varie fasi del ciclo.

Nelle cellule dei tumori solidi è spesso presente una variazione del contenuto di DNA

conseguenza di mutazioni genetiche nei cromosomi. Considerando le fasi del ciclo

cellulare, l’istogramma delle frequenze di DNA in una popolazione aneuploide mostra

almeno un picco di cellule in fase G0/G1 sovrannumerario rispetto ad una popolazione

diploide normale.

L’alterato contenuto di DNA può essere espresso come DNA index (DI) cioè dal rapporto

fra il contenuto in DNA delle cellule neoplastiche in fase G0/G1 e quello delle cellule

diploidi normali nella stessa fase del ciclo cellulare. Il DNA index è uguale a 1 nel caso di

una popolazione neoplastica diploide e diverso da 1 in caso di aneuploidia.

PARAMETRI DERIVATI DALLA DETERMINAZIONE DEL CONTENUTO DI DNA

DNA-index DI esprime il rapporto tra il canale modale del picco G0/G1 del campione in

esame ed il canale modale dello stes