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COMPONENTI
Un citometro a flusso è costituito da :
• Sistema fluidico → per il trasporto del campione e la sua focalizzazione idrodinamica
• Sistema Ottica:
◦ Sorgenti di eccitazione → laser
◦ Circuito di rilevazione → permetterà di rilevare segnali luminosi scaturiti da incontro.
• Sistema Elettronico → per l'acquisizione, l'elaborazione e la rappresentazione dei dati.
SISTEMA OTTICO
L'ottica di eccitazione consiste di :
• Uno o più laser come sorgente luminosa
• Lenti di focalizzazione per collimare il fascio luminoso prima del punto di interrogazione
L'ottica di rilevazione comprende :
• Una lente di collezione che raccolga tutti i segnali generati dall'interazione del fascio
luminoso con la singola cellula
• Un sistema di specchi e filtri ottici in grado di separare le specifiche lunghezze d'onda
che devono essere raccolte dai differenti rivelatori
SORGENTI LUMINOSE
• Laser, in grado di emettere luce monocromatica e unidirezionale di notevole intensità in
determinate regioni spettrali del visibile e dell’ultravioletto; Il laser ha un’elevata potenza
specifica e permette, perciò, di misurare minime quantità di fluorocromo. Inoltre
possiede grande stabilità spaziale e di intensità.
Ha l’inconveniente di emettere un numero limitato di frequenze utili. Nella maggior parte degli
strumenti viene impiegato un laser a ioni Argon, di potenza variabile, accordato sulla
lunghezza d’onda di 488 nm (blu). Questa particolare lunghezza d’onda consente una
efficiente misura dei parametri fisici e può eccitare contemporaneamente diversi fluorocromi.
LASER è un acronimo che sta per: Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation
Il laser è un dispositivo che crea e amplifica un sottile raggio di luce coerente di elevata
intensità. Nel laser gli atomi o le molecole di un cristallo o di un gas o di un liquido o di altre
sostanze sono eccitati a livelli energetici più alti. Il laser è progettato in modo che gli atomi
eccitati emettano fotoni di una sola o pochissime frequenze e con la stessa direzione: si deve
quindi trovare l’atomo adatto e creare un ambiente che consenta tale produzione.
L’interazione del fascio di luce con la cellula dà luogo a fenomeni di:
◦ LIGHT SCATTERING →
I due segnali che permettono di identificare le caratteristiche fisiche delle popolazioni cellulari
sono correlabili: alle dimensioni delle cellule. Se si osserva una cellula in controluce, si misura
un segnale legato alla diffrazione che è in relazione al diametro cellulare (Forward Scatter o
scatter lineare = FSC), rilevato lungo l’asse della luce incidente.
Alla granulosità cellulare, al rapporto N/C e alla irregolarità della superficie cellulare. Se ci si
pone ortogonalmente al fascio, si misura un segnale legato sostanzialmente alla riflessione e
alla rifrazione (Side Scatter o scatter a 90° = SSC)
La combinazione dei due tipi di segnali ( Side Scatter + Forward Scatter) permette di ottenere
un particolare diagramma di dispersione a punti denominato CITOGRAMMA nel quale si
possono evidenziare fino a 5 o 6 differenti popolazioni cellulari, in base alle sole caratteristiche
fisiche. Ogni cellula è identificata da un preciso valore di FSC e SSC.
◦ FLUORESCENZA →
E’ il fenomeno per cui una molecola colpita da una radiazione luminosa di definita lunghezza
d’onda ne emette un’altra a lunghezza d’onda maggiore e ad energia inferiore. Molte molecole
biologiche posizionate sulla membrana plasmatica, nel nucleo o nel citosol, possono venire
identificate con ligandi fluorescenti o con specifici anticorpi monoclonali marcati con
fluorocromi. Altre sostanze (DNA, RNA, proteine, ioni citoplasmatici) possono essere colorate
direttamente con fluorocromi che si legano ad esse stechiometricamente.
◦ IL FLUOROCROMO ASSORGE ENERGIA DAL LASER
◦ IL FLUOROCROMO RILASCIA ENERGIA ASSORBITA PER :
▪ vibrazione e dissipazione del calore
▪ Emissione di fotoni di lunghezza d'onda più lunga
FLUOROCROMI
Ogni fluorocromo presenta una caratteristica eccitazione, emissione e brillantezza.
Se si usano più fluorocromi (in analisi multiparametriche) nello stesso protocollo sperimentale,
le loro emissioni devono essere sufficientemente distanti per poter essere selezionate in modo
distinto, ciascuna da un rivelatore (PMT).
Anche le cellule non marcate con alcun fluorocromo presentano una debole fluorescenza di
fondo, l’autofluorescenza, misurabile.
Due dei fluorocromi più usati in CFM sono
• FITC isotiocianato di fluoresceina emette nel verde con massimo 520 nm
• PE ficoeritrina emette nel giallo/arancio (eccitazione 488-561nm) emissione 576 nm
L'intensità della fluorescenza dipende dall'intensità dei siti di legame
Principio di rilevazione dei dati
Le cellule, forzate ad allinearsi, attraversano individualmente un punto di misura, dove
interagiscono con il raggio luminoso del sistema di eccitazione. E’ da questa interazione che,
per fenomeni di diffrazione, rifrazione, riflessione e fluorescenza vengono generati dei segnali,
raccolti da un sistema di lenti, specchi dicroici e filtri ottici ed inviati ai relativi sensori
(fotomoltiplicatori) che ne misurano l’ampiezza.
I segnali provenienti da ogni sensore sono digitalizzati, associati fra loro ed inviati ad un
elaboratore che provvede alla presentazione dei dati ed alla loro definizione statistica.
SISTEMA DI RILEVAZIONE
E’ costituito da sensori denominati fotomoltiplicatori (PMT) o detectors che trasformano i
segnali ottici in intensità di corrente elettrica, oltre ad amplificare lo stesso segnale in maniera
lineare o logaritmica. I segnali provenienti dai PMT sono impulsi analogici ossia proporzionali
in maniera continua alle dimensioni del parametro analizzato. Un convertitore spezzetta i valori
continui rendendoli discreti.
I segnali provenienti da ogni sensore sono digitalizzati, associati fra loro ed inviati ad un
elaboratore che provvede alla presentazione dei dati ed alla loro definizione statistica. La
statistica si basa sull’impostazione di cursori che definiscono le aree di interesse calcolando gli
eventi che cadono al loro interno.
QUANTIFICAZIONE DI UN IMPULSO
• ALTEZZA → è proporzionale alla quantità di fluorocromo legato alla celleula.
• AMPIEZZA → è proporzionale al tempo che la cellula impiega ad attraversare il raggio
laser
• AREA → è l'integrale matematico di un singolo impulso ; rappresenta l'emissione totale
di luce ed proporzionale alla quntità totale di fluorocromo sulla cellula.
Ogni singolo valore relativo a ciascun parametro misurato, dopo essere stato amplificato e
convertito, rappresenta il “quanto” citometrico e prende il nome di EVENTO
Tutti gli eventi relativi all’insieme dei dati misurati si accumulano nei canali, che rappresentano
la distribuzione dei valori.
RAPPRESENTAZIONE DEI DATI
• La rappresentazione più semplice di un dato citometrico è la creazione di un
istogramma, in cui gli eventi accumulati nei diversi canali forniscono un diagramma di
distribuzione delle frequenze. Il diagramma ad istogrammi rappresenta graficamente la
misura di un singolo parametro.
• Un’altra rappresentazione è quella detta bidimensionale a parametri correlati, il cui
diagramma è definito dot-plot .
Il diagramma di dispersione a punti o dot plot rappresenta la correlazione fra due parametri, in
cui ogni punto rappresenta un singolo evento dotato di un particolare valore per ciascuno dei
due parametri. All’interno dei dot plot si possono definire quadranti e finestre di diverse
dimensioni.
Vantaggi dell’analisi in CFM
• Multiparametricità
• Possibilità di mettere in relazione fra loro più caratteristiche della stessa cellula
• Analisi di grandi quantità di cellule
• Riproducibilità ed affidabilità statistica delle letture
• Grande sensibilità
• Rapidità dei tempi di analisi
• Possibilità di eseguire ulteriori analisi a posteriori su dati in memoria
Fluorocromi intercalanti, sono praticamente non fluorescenti quando liberi nel solvente, ma
aumentano notevolmente la loro efficienza quantica quando legati al DNA.
Si legano in modo stechiometrico al DNA, la fluorescenza emessa sarà proporzionale al
contenuto di DNA Ioduro di propidio (PI) ha una larga banda di assorbimento nel visibile
con massimo nel verde, ma anche nel blu ed un’altra in UV.
L’emissione avviene nel rosso con un massimo a 620 nm. Si può quindi usare in
multiparametrica con altri fluorocromi (FITC e PE) anche se vi è sovrapposizione parziale
con l’emissione di PE.
PI e il bromuro di etidio (EB) si intercalano sia con DNA che con RNA a doppia elica,
rendendo necessaria la digestione enzimatica dell’RNA o denaturazione ottenuta con
RNasi aggiunta al colorante.
Analisi del contenuto di DNA in CFM
Si può valutare la % di cellule in G1/G0, S, G2/M integrando le aree sottese alle varie zone
del grafico.
Le cellule che hanno un DNA non replicato sono in fase G1/G0 .
Le cellule che hanno replicato il proprio DNA hanno un contenuto doppio di DNA rispetto
alle cellule che si trovano in G1/G0 Le cellule che hanno un contenuto intermedio di DNA
sono in fase S.
PARAMETRI DERIVATI DALLA
DETERMINAZIONE DEL CONTENUTO DI DNA
Percentuale di cellule nelle fasi del ciclo cellulare:
• G0/G1
• S SPF S-phase fraction
• G2-M
La misura del contenuto di DNA fornisce anche
informazioni di tipo citogenetico (il grado di ploidia
per singola cellula) oltre che sullo stato
proliferante del clone in esame determinando con esattezza la distribuzione delle cellule
nelle varie fasi del ciclo.
Nelle cellule dei tumori solidi è spesso presente una variazione del contenuto di DNA
conseguenza di mutazioni genetiche nei cromosomi. Considerando le fasi del ciclo
cellulare, l’istogramma delle frequenze di DNA in una popolazione aneuploide mostra
almeno un picco di cellule in fase G0/G1 sovrannumerario rispetto ad una popolazione
diploide normale.
L’alterato contenuto di DNA può essere espresso come DNA index (DI) cioè dal rapporto
fra il contenuto in DNA delle cellule neoplastiche in fase G0/G1 e quello delle cellule
diploidi normali nella stessa fase del ciclo cellulare. Il DNA index è uguale a 1 nel caso di
una popolazione neoplastica diploide e diverso da 1 in caso di aneuploidia.
PARAMETRI DERIVATI DALLA DETERMINAZIONE DEL CONTENUTO DI DNA
DNA-index DI esprime il rapporto tra il canale modale del picco G0/G1 del campione in
esame ed il canale modale dello stes