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popolazione di staminali di riuscire a generare un elevato numero di cellule che poi si differenzieranno, ma di essere

esposte il meno possibile ad un rischio genetico: come in ogni cellula, c'è il rischio di una mutazione durante la

duplicazione del DNA (in fase S). Essendo i progenitori a dividersi tantissime volte per un tempo limitato ciò permette di

avere tante cellule che si differenzieranno mantenendo la staminale senza mutazioni.

Le cellule staminali di alcuni tessuti mantengono

selettivamente la marcatura → se in queste cellule la

duplicazione del DNA (fase S) è fatta in presenza della

promodeossiuridina (BrdU), un nucleoside sintetico che si

comporta come analogo della timidina, esso è usato

come se fosse timidina nel momento della duplicazione.

Esistono in commercio anticorpi che si legano alle

promodeossiuridina (anti-BrdU) e se coloriamo le cellule

usando un anticorpo, possiamo vedere dove va il DNA

neosintetizzato → c'è una ripartizione asimmetrica dei

filamenti di DNA, infatti solo in nucleo di una cellula è

colorato.

Questo fenomeno è stato spiegato con due ipotesi:

– La prima sostiene che, essendo la cellula staminale una cellula che si divide raramente, è lecito pensare che

questa marcatura si diluisca poco (tutte le volte che si divide questo verde è ripartito, ma visto che si divide

raramente è ipotizzabile che questa colorazione non venga diluita)

– La seconda è l'ipotesi dei filamenti immortali: è stata dimostrata per le cellule staminali neurali, degli epiteli e

del muscolo scheletrico. Indipendentemente dalla frequenza di divisione della cellula staminale, una possibile

interpretazione del mantenimento della marcatura del DNA è che le cellule staminali possano segregare in modo

asimmetrico i loro filamenti di DNA, in modo che in ogni divisione il DNA marcato in origine venga mantenuto

dalla cellula staminale. Cosa rende un filamento immortale rispetto all'altro? Non lo sappiamo ancora, forse la

presenza di una proteina nel cinetocore che è riconosciuta in modo asimmetrico dai microtubuli del cinetocore

del fuso, questo spiegherebbe perchè questa proteina che marca il filamento immortale verrebbe attaccata solo

dai microtubuli proveniente da un polo e non dall'altro e questo comporta la segregazione di tutti i filamenti

immortali verso la staminale e non verso l'altra cellula (che è il progenitore). Questa ipotesi dei filamenti

immortali risale agli anni '70 quando fu ipotizzata proprio come meccanismo di cellule adulte per evitare

l'accumulo di mutazioni che potrebbero promuovere l'insorgenza di tumori.

Abbiamo già detto quindi che la cellula staminale adulta contribuisce all'omeostasi del tessuto, essa è inoltre dotata di

autorinnovamento e darà origine ad un progenitore (che sia stimolato dall'ambiente o nasca già con queste

caratteristiche) che intraprenderà un cammino di differenziamento, portando ad un abbondante numero di cellule

terminalmente differenziate. La strategia del far duplicare rapidamente ma per un tempo limitato le cellule che si

amplificano in transito permette alla cellula staminale di essere rara e di avere una velocità di divisione bassa e questo è

sicuramente collegato alla necessità di proteggere dalle mutazioni che si verificano durante la replicazione del DNA. Se

poi fosse vera per tutte le cellule staminali tissutali l'ipotesi dei filamenti immortali, questo ridurrebbe ulteriormente

l'accumulo di mutazioni da parte della cellula staminale adulta. Il tenere bassa la velocità di divisione della staminale

adulta è anche un modo che permette un meccanismo di regolazione (si divide lentamente ma se ce ne fosse bisogno

può passare a divisioni molto frequenti a seconda delle necessità di turn-over del tessuto).

Epidermide: noi rinnoviamo continuamente gli strati esterni dell'epidermide e l'omeostasi di questo tessuto è garantita

dalla presenza di cellule staminali adulte epidermiche nello strato basale. A noi interessa l'epidermide (rivestimento

esterno), dove ci sono gli annessi cutanei (peli, ghiandole sebacee, unghie, ghiandole sudoripare) che si sviluppano come

specializzazioni dell'epidermide che dipendono dalle cellule staminali per ogni ciclo di crescita e ricostruzione. Sotto

l'epidermide vi è il tessuto connettivo, che comprende il derma, ricco di collagene, e l'ipoderma.

L'epidermide interfollicolare è un tessuto pluristratificato costituito da tipi cellulari chiamati cheratinociti, che

sintetizzano cheratire, cioè filamenti intermedi che conferiscono resistenza all'epidermide. Le uniche cellule che si

dividono sono quelle nello strato più interno dell'epidermide, separate dal connettivo dalla lamina basale, e sono le

cellule basali, cioè le staminali. Sopra di esse ci sono diversi strati di cellule spinose: esse sono più grandi e hanno

numerosi desmosomi, cioè giunzioni della membrana, siti di ancoraggio alle cheratine, che collegano le cellule le une alle

altre rendendo il tessuto più stabile. Al di sorpa delle spinose c'è uno strato più sottile e scuro che è il granuloso, qui ci

sono cellule saldate le une alle altre a formare uno strato impermeabile. Sopra esse infine abbiamo lo strato più esterno

dell'epidermide, formato da cellule metabolicamente inattive, morte, che hanno perso tutti gli organelli e sono ridotte a

scaglie appiattite dette squame, piene di cheratine compatte (sono quelle perse continuamente).

Lo strato basale (monostratificato) a livello delle punte delle papille del derma contiene le cellule staminali; esse si

dividono raramente mediante un movimento laterale, generando le cellule che sono quei progenitori che si amplificano

in transito, che invece vanno incontro a rapide e frequenti divisioni (ovviamente non sono più staminali, si dividono ma

non illimitatamente). Queste TA iniziano a differenziarsi: escono dallo strato basale e passano a quello successivo

andando incontro a stadi diversi di espressione genica e ad un processo di differenziamento che la porterà nell'ultimo

strato, quello metabolicamente attivo, ad essere cellule terminalmente differenziate, che esprimeranno una serie di

caratteristiche tipiche per svolgere una funzione (questo differenziamento si accompagna necessariamente a una

terminazione della divisione cellulare).

Il periodo che trascorre dalla nascita di una cellula nello strato basale al momento della sua perdita per desquamazione è

di circa un mese.

La presenza di cellule staminali adulte nello strato basale dell'epidermide rende conto dell'omeostasi di questo strato e

della necessità di sostituire le tantissime cellule che sono perse ogni giorno.

Trapianti di epiteli: il primo fu fatto nel 1983 su tre bambini ustionati, usando queste cellule staminali adulte epiteliali

derivate da biopsie della cute sana di questi pazienti. Queste cellule sono a contatto con la lamina basale, ciò è

importante per mantenerle tali, quindi devono essere cresciute su questo supporto di lamina basale anche in vitro per

farle espandere fino ad ottenere dei veri e propri lembi di pelle. Una singola cellula staminale (oloclone) può dividersi in

vitro un numero sufficiente di volte per generare la superficie epidermica di un essere umano.

Trapianti di cornea: il rinnovamento e riparazione della cornea dipendono dalle cellule staminali presenti nel limbus, che

si trova in una ristretta zona al confine tra cornea e congiuntiva. La trasparenza della cornea è indispensabile per una

corretta capacità visiva e dipende dalla mancanza di vascolarizzazione dello stroma e dall'integrità dell'epitelio corneale.

Ustioni oculari, termiche o chimiche possono distruggere il limbus, causando un deficit di cellule staminali limbari. Se

questo accade, la cornea viene ricoperta da un diverso epitelio attraverso l’invasione di cellule della congiuntiva. Tale

processo comporta neovascolarizzazione, infiammazioni croniche e ferite nello stroma, con conseguente opacizzazione

della cornea e perdita della capacità visiva. In presenza di tale quadro clinico, il tradizione trapianto allogenico di cornea

da donatore (chertoplastica) è destinato all’insuccesso. Se invece almeno in uno dei due occhi del paziente è rimasto

anche un residuo piccolissimo di limbus non danneggiato, è possibile ricostruire in laboratorio l’epitelio che ricopre la

superficie corneale, grazie alle cellule staminali raccolte da una biopsia di 1-2 mm2. Questo lembo di epitelio viene poi

trapiantato nel paziente e consente di ottenere una cornea trasparente stabile nel tempo e un pieno recupero della

capacità visiva, senza provocare nessuna reazione di rigetto perché costituito dalle cellule del paziente stesso (trapianto

autologo). La cornea si rinnova completamente ogni 6/12 mesi.

Epitelio intenstinale: il rivestimento dell'intestino è un

epitelio monostratificato. Nell'intestino tenue, ma non nel

crasso, ci sono dei villi (estroflessioni digitiformi che

consentono l'aumento della superficie assorbente) e per

l'omeostasi di questo epitelio diventa fondamentale il

ruolo svolto da cellule staminali adulte intestinali che

stanno alla base delle cripte dell'epitelio intestinale. I

microvilli quindi, grazie ad un'ordinata disposizione dei

microfilamenti actinici, permettono l'aumento della

superficie della membrana plasmatica. Queste cellule

assorbenti o enterociti sono quelle che assorbono i

nutrienti e secernono enzimi della digestione.

Tutte queste cellule si pensa derividono dalla stessa cellula staminale intestinale adulta. L'intestino tenue è caratterizzato

da cellule con elevato ritmo di produzione cellulare e hanno una rapida progressione in ciclo. Le cellule prodotte per

mitosi nella cripta impiegano solo 2 o 3 giorni per raggiungere l'apice del villo ed essere estruse nel lume intestinale,

quindi ogni 2 giorni grazie a queste cellule staminali si ha la sostituzione dell'epitelio della cripta, che può essere

danneggiato anche da agenti citotossici (3-4 giorni dopo un'irradiazione si possono osservare cripte in rigenerazione). Le

cellule assorbenti, a calice ed enteroendocrine proseguono verso i villi, quelle staminali rimangono immerse nelle cripte e

le cellule di Paneth (difesa immunitaria, sostituite ogni 20 giorni) migrano verso la base delle cripte. La particolarità

dell’intestino come modello biologico cellulare è data dal fatto che il ruolo gerarchico delle cellule staminali è correlato

alla posizione topografica nel tessuto. Effettuando una sezione longitudinale della cripta e seguendo le posizioni delle

cellule a partire dalla base, è possibile studiare i processi di rigenerazione e di risposta a un danno.

Ci sono persone che hanno una predisposizione ereditaria a sviluppare tumori del colon e prima del tumore sviluppano

un gran numero di adenomi precancerosi nell'intestino crasso (senza villi). La poliposi ereditaria del colon può essere

ricondotta a mutazioni a carico del gene APC (adenomatous polyposis coli). Gli adenomi originano da cellule in cui

entrambe le copie del gene sono perse e generano delle strutture simili a grandi cripte dove le cellule continuano a

proliferare. APC codifica per una proteina che impedisce l'attivazione impropria di Wnt → normalmente le cellule

staminali della cripta si dividono grazie a questa via di segnalazione attivata, ma quando poi escono dalla cripta e

migrano, la loro proliferazione deve essere spenta a vantaggio del programma differenziativo; quando però questo gene

che cofica per questa proteina (che controlla l'attivazione di questa via d'attivazione) è mutato, la via non viene bloccata

e questi continuano a proliferare formando strutture simili alle cripte, in cui si ha questa divisione incontrollata.

Via di segnalazione di Wnt: le proteine di Wnt sono proteine secrete che agiscono da morfogeni e mediatori locali.

Queste proteine sono state scoperte in Drosophila (insetti), in cui sono codificate dal gene Wingless (senza ali) coinvolto

nello sviluppo delle ali e nei topi “Int1”, coinvolto nello sviluppo di tumori alla mammella. Queste proteine secrete

presentano un acido grasso all'N-terminale, che permette loro il legame con le superfici cellulari (hanno un'ancora in più

per attaccarsi). Le proteine si legano a recerroti accoppiati a proteine G detti Frizzled, il complesso ligando-recettore

recluta la proteina dishevelled necessaria per trasdurre le vie di segnalazione a valle. Le proteine Wnt, legandosi ai loro

recerroti accoppiati a proteine C, possono attivare a livello intracellulare tre vie di segnalazione distinte:

Via canonica Beta catenina

Via che porta ad un aumento di calcio intracellulare

Via che induce la polarizzazione su un piano di un epitelio in via di sviluppo (ruolo di morfogeno).

Noi ci interessiamo della Beta catenina, che quando non è fosforilata si accumula e migra nel nucleo dove altera la

trascrizione genica. Il gene APC è coinvolto nel tenere sotto controllo questa via di segnalazione, che regola non solo la

proliferazione ma anche la possibilità di generare tutte le cellule differenziali di cui abbiamo parlato. Nella via canonica

oltre al recettore accoppiato al proteine C, entra in gioco un co recettore che è LRP, che si lega a questa proteina secreta

(Wnt). La betacatenina nelle cellule epiteliali è associata alle giunzioni aderenti dove collega le caderine, proteine

coinvolte nell'adesione cellula-cellula, ai microfilamenti di actina. Normalmente in assenza di Wnt la trascizione di geni

bersaglio è spenta perchè se la betacatenina non è associata alle caderine viene normalmente degradata. Quando invece

c'è Wnt che si lega al suo recettore e corecettore, la betacatenina che prima era degradata adesso è stabile, quindi si

accumula nel citoplasma e migra nel nucleo dove agisce da coattivatore insieme ad altre proteine (coattivatore insieme

ad altri fattori di trascrizione) a livello del promotore di specifici geni bersaglio ed essi vengono espressi. Quindi,

riassumendo, tutta la segnalazione sta nel degradare o rendere stabile la betacatenina, perchè se viene degradata (come

in assenza di Wnt), questa non potrà funzionare da coattivatore, se invece è stabile potrà farlo.

Sangue: i suoi elementi sono sostituiti ogni giorno grazie al lavoro di una cellula staminale adulta del midollo osseo che è

l'ematopoietica (HSC). Il sangue è fatto da molti tipi di cellule ma tutte hanno una vita limitata, quindi per l'omeostasi

entrano in gioco le cellule staminali adulte. L'ematopoietica è una cellula staminale adulta multipotente, grazie a

progenitori che si amplificano in transitano che generano una progenie che si differenzia in tutti gli elementi del sangue.

Questa cellula è molto rara (una su 10.000-100.000) e risiede nel midollo osseo insieme a tutti i precursori immaturi delle

cellule del sangue, mescolati con cellule connettivali (stromali, che secernono matrice extracellulare che fa da supporto

per queste cellule), cellule adipose e megacariociti (dimensioni enormi, poliploidi, danno vita a piastrine, cioè frammenti

cellulari che si distaccano da lunghi processi che si estendono attraverso fori nelle pareti di un seno sanguigno). Il tessuto

è rifornito di vasi sanguigni in cui vengono rilasciate le cellule.

I globuli rossi rimangono all'interno dei vasi sanguigni e

trasportano O2 e CO2 legati all'emoglobina.

Le piastrine sono piccoli frammenti cellulari derivanti dai

megacariociti e contribuiscono alla coagulazione del

sangue e al riparo delle ferite.

I globuli bianchi combattono le infezioni e digeriscono i

detriti, la maggior parte deve farsi strada attraverso le

pareti dei vasi sanguigni per migrare nei tessuti dove

svolgono la loro funzione; sono suddivisi in tre categorie:

monociti, granulociti e linfociti. I moniciti maturano in

macrofagi fuori dal circolo e funzionano da fagociti

specializzati, danno anche origine alle cellule dendritiche

che possono fagocitare sostanze ed organismi estranei ma

principalmente presentano antigeni estranei ai linfociti

per scatenare la risposta immunitaria. I granulociti si

distinguono in neutrofili, che fagocitano microrganismi e

sono coinvolti nell'immunità innata, in basofili, che

secernono istamina, correlati alle mast cellule, sono

coinvolti nelle reazioni infiammatorie e infine in eosinofili,

che contribuiscono a distruggere i parassiti e sono

coinvolti nelle reazioni allergiche. I linfociti sono coinvolti

nella risposta immunitaria, i linfociti B producono

anticorpi, i linfociti T uccidono le cellule infettate dai

virus.

Tutte queste cellule derivano da un'unica cellula staminale multipotente residente nel midollo osseo che, attraverso

tappe successive che prevedono la generazione di progenitori sempre più differenziati (c'è una precisa espressione genica

differenziale che limita contestualmente le proprietà staminali di queste cellule, quindi è chiaro che questa cellula può

diventare solo questa cellula mentre se torniamo indietro il precursone è più potente) arriva ad una diforcazione fra la

linea linfoide (che comprende i linfociti) e mieloide (che comprende tutte le altre cellule ematiche).

Trapianti del midollo: delle cellule staminali ematopoietiche si conoscono bene i marcatori (antigeni di superficie), quindi

è possibile prelevarle, eventualmente arricchirle per il tipo staminale desiderato, poi selezionarle sulla base di questi

antigeni e utilizzarle in trapianti sia di tipo autologo che allogenico per tutti quei pazienti con malattie a livello

ematopoietico.

7 aprile

Cosa limita la divisione cellulare alle cellule nella cripta? Quali sono le molecole segnale che organizzano l’intero

sistema delle cellule staminali nell’intestino? Una iniziale risposta a questa domanda è venuta da studi condotti su

tumori del colon. Esiste un’importante via di segnalazione che nella cripta dell’intestino dice

alle cellule staminali che cosa fare. Gli indizi per capire qual è la via di

segnalazione di queste cellule staminali dell’intestino è tenuta da tumori

intestinali: ci sono dei pazienti che hanno una certa tendenza ovvero una

predisposizione a sviluppare tumori del colon, quivi si formano un grande

numero adenomi precancerosi nell’intestino crasso che è privo di villi. Negli

adenomi

le cellule continuano a proliferare e si formano strutture simili a cripte.

Quindi evidentemente queste cellule hanno un problema nella

proliferazione ( stanno proliferano nel colon). È stato visto che questi

pazienti presentano mutazioni a carico di un gene, il gene Apc

(adenomatous polyposis coli) . Questo gene codifica per una proteina che

impedisce l’attivazione impropria di Wnt, una proteina che tiene a bada

un’attivazione incontrollata di questa molecola segnale. Quindi Wnt

mantiene normalmente le cellule della cripta in uno stadio proliferativo ed

una sua inattivazione arresta la loro divisione quando escono dalla cripta.

La via di segnalazione di Wnt

È una via di segnalazione importante nello sviluppo, nel differenziamento

ed anche nel mantenimento della staminalità. Nelle cellule intestinali

questa via di segnalazione è coinvolta non solo nel mantenere le cellule

staminali proliferanti ma anche nel permettere poi il successivo

differenziamento di quelli che sono i progenitori che la cellula staminale

eredita.

Le proteine Wnt sono proteine secrete che agiscono da morfogeni e

mediatori locali. Scoperte in Drosophila codificate dal gene «wingless»

coinvolto nello sviluppo delle ali e nei topi gene «Int1» coinvolto nello sviluppo di tumori alla mammella. Le

proteine Wnt presentano un acido grasso all’N terminale che permette loro il legame con le superfici cellulari. Le

proteine Wnt si legano a recettori accoppiati a proteine G detti Frizzled. Il complesso ligando –recettore recluta la

proteina dishevelled necessaria per trasdurre le vie di segnalazione a valle(un recettore che passa 7 volte nella

membrana plasmatica). Una volta che queste proteine si legano al recettore , il complesso legame recettore recluta

a livello di questo complesso vicino alla membrana plasmatica una proteina specifica , Dishevelled, che poi è

necessaria per trasdurre il segnale dentro la cellula. Queste proteine possono attivare almeno 3 vie di segnalazione

cellulare ma noi ci concentreremo soltanto sulla via canonica, la via canonica Beta Catenina. Questa beta Catenina

grazie alla segnalazione Wnt andrà nel nucleo, quindi si accumulerà ( normalmente questa beta catenina viene

degradata ) invece successivamente al legame di Wnt al proprio recettore vedremo che dentro la cellula questa

beta catenina non viene degradata a livello del proteosoma ,si accumula, migra nel nucleo e lì, ovviamente

legandosi a livello dl promotore del gene bersaglio, permette l’espressione di geni correlati a u e vedremo che uno

dei geni bersaglio è il c-myc . Quindi normalmente questa Beta Catenina viene degradata quindi se non c’è Wnt, non

c’è trascrizione dei geni bersaglio di Wnt dettati dalla Beta Catenina. Ergo se non c’è Wnt, Beta Catenina non si

accumula perché viene continuamente degradata. Chi è che la degrada? Descriviamo questa via parallela: oltre a un

recettore accoppiato a proteine, nella via canonica dobbiamo tirare in ballo anche un corecettore che si chiama LRP

. è una proteina recettoriale correlata al recettore LDL, le lipoproteine. Quindi in realtà quando si descrive, wint si

lega sia a Frizzled, il recettore accoppiato a proteine g, e anche al corettore LRP. Quindi adesso cosa succede?

Succede che successivamente a questo legame Beta Catenina non verrà distrutta. Perché? Perché il complesso che

normalmente distrugge la Beta Catenina viene inattivato. Da chi è composto questo complesso? In questo

complesso sono presenti due proteine Chinasi le quali fosforilano nel substrato. Queste due proteine Chinasi si

chiamano CK1 e GSK3. La prima è la caseina-chinasi ( è una serina ) e la seconda è glicogeno-simpasi-chinasi 3.

Queste sono le chinasi che fosforilano la beta catenina. In questo complesso oltre alle due chinasi ci sono anche

altre due proteine che non sono delle chinasi ma hanno una funzione strutturale ( in inglese “scuffle” , tenere

insieme, funzione di impalcatura per questo complesso ) e sono l’axina e l’APC, una proteina che è mutata nelle

persone affette da poliposi, nelle specifico il gene che codifica per la proteina APC è mutato nelle persone affette da

poliposi. Quindi questo complesso che normalmente degrada la

beta catenina, quando Wnt si lega al recettore e corecettore

difatto viene inattivato perché le due chinasi, GSK3 e CK1, invece

di fosforilare la beta catenina e indirizzarla alla degradazione,

hanno come substrato e fosforilano la coda citosolica del

recettore LRP che quindi, una volta fosforilato, replica una delle

due proteine scuffle , l’ axina. Quindi la beta catenina, poiché

questo complesso è stato inattivato, non viene più fosforilata, non

viene più indirizzata alla degradazione, può accumularsi e

migrare nel nucleo dove si lega insieme ad altre proteine a livello

di promotori di geni e la trascrizione di questi geni è accesa.

Dunque queste proteine Wnt sono dei morfogeni che permettono

vie di segnalazione molto importanti. Nel nostro caso servono

per stimolare la proliferazione delle cellule staminali nelle cripte

intestinali. Nesso via di segnalazione e cellule staminali:

studiando i tumori del colon dove la proliferazione di queste

cellule è fuori controllo, si è visto che questi pazienti con la

poliposi a livello del colon e predisposti a sviluppare tumori al

colon, il gene in questione mutato codifica per la proteina APC la

quale è una di quelle proteina che forma un complesso necessario

per la degradazione della beta catenina .

Questa sappiamo che se non viene degradata migra e si accumula

nel nucleo dove accende l’espressione di particolari geni che

renderanno possibile la proliferazione di queste cellule. Dunque

entrando nei dettagli della via di segnalazione notiamo che se

non c’è Wnt, i geni che Wnt controlla devono essere spenti (

trascrizione off ). Questo perché la beta catenina che funziona da

attivatore trascrizionale viene normalmente degradata da un complesso di cui fa parte anche APC. Quindi, non c’è

Wnt. Ricordiamo che questo complesso è formato da due chinasi (GSK3 e CK1) che hanno come bersaglio la beta

catenina ( se non c’è Wnt, esse fosforileranno la beta catenina la quale a sua volta si degraderà a livello del

proteasoma , poi ci sono l’APC e l’axina che sono due proteia scuffle con ruolo strutturale ( coinvolte nel

mantenimento dell’architettura di questo complesso. Quindi non c’è Wnt che si lega al suo recettore e corecettore,

la proteina Dishevelled che normalmente non viene reclutata e il nostro complesso formato da auxina, APC , GSK3 e

CK1 è attivo nel fosforilare la beta catenina e indirizzarla alla degradazione del proteosoma. Quindi beta catenina

non può colorarsi e legarsi a livello del promotore, insieme ad altre proteine, let1 e pcf che mediano, permettono la

trascrizione di geni bersaglio. Quando è presente wint cosa succede? Succede che wint si lega a recettore fris

accoppiato a c proteine e … dal corecettore. Quindi i due recettori formano un complesso. Cosa succede? La

proteina discvel viene reclutata a livello di questo complesso a livello della membrana e la formazione di questo

complesso recluta a membrana quelle due chinasi gsk3 e ck1 che normalmente se non c’è wint stanno nel

citoplasma e fosforilano la beta catenina e invece se c’è wint vengono reclutate a livello di questi recettori e che

cosa fanno? Fosforilano la coda del recettore llb e questa fosforilazione permette la reclutazione dell’auxina e

quindi il complesso che permetteva la fosforilazione e la successiva degradazione della beta catenina non è attivo e

allora la beta catenina può migrare nel nucleo. Nel nucleo essa spiazza un repressore.

Normalmente la trascrizione di questi geni è spenta perché a livello del promotore è presente questo repressore

trascrizionale che si chiama “Groucho”. Quindi di fatto la beta catenina arriva e spiazza Groucho e questo complesso

di proteine a livello del promotore passa da un complesso repressionale a un complesso di attiva trascrizione. Beta

catenina, funzionanando da coattivatore della trascrizione , permette la trascrizione di tutta una serie di geni. Fra

questi c’è c-myc che è un potente stimolatore della proliferazione cellulare (vedi ciclo cellulare, entrata in fase S) .

quindi in sintesi questa è una via di segnalazione che parte da proteine secrete che si legano al proprio recettore e il

legame Wnt al proprio recettore che cosa fa? Alla fine terminerà con l’espressione di particolari geni nel nucleo

grazie a una proteina che è la beta catenina la quale normalmente viene degradata ma grazia alla presenza di Wnt

che reclutando a livello del recettore e del corecettore parte del complesso responsabile della degradazione della

beta catenina, fa si che la beta catenina si accumuli nel citoplasma, migri nel nucleo dove insieme ad altre proteine

permette, spiazzando quella proteina che normalmente viene repressa questa trascrizione, permette la

trascrizione di geni bersaglio, fra cui c-myc. Questa via di segnalazione è importantissima nel mantenere lo stato

proliferativo delle cellule staminali dell’intestino ed è stata anche dimostrato con esperimenti con dei topi

transgenici in cui è possibile bloccare la via di Wnt e andare a vedere dopo un tot di tempo in che stato è l’intestino.

Quindi successivamente al blocco della via di segnalazione di Wnt si va a vedere come sta l’intestino e che cosa si

vede: si vede una situazione simile a quei pazienti con APC mutato e cioè si vedono delle cripte molto allargate con

cellule meno differenziate. Quindi è una conferma.

Ma questa via di segnalazione di Wnt in realtà non è soltanto necessaria per mantenere lo stato proliferativo delle

cellule staminali ma serve anche per rendere competenti e commissionati i progenitori verso i diversi tipi cellulari

che abbiamo visto essere presenti nell’intestino. Questo è stato visto sempre attraverso esperimenti con topi in cui

la via di segnalazione di Wnt è sempre bloccata. In questi topi in cui non si permette mai l’attivazione di Wnt si che

che la maggior parte delle cellule intestinali sono differenziati durante il ciclo in cellule assorbenti mentre mancano

completamente di altri tipi cellulari di cui abbiamo parlato. Questo dimostra che questa via di segnalazione che

ovviamente nel topo, a seconda di quando la via viene bloccata si può osservare questo effetto, questa via di

segnalazione è sia importante nel mantenere lo stato proliferativo delle cellule staminali ma è altrettanto cruciale

per conferire competenza a far si che i progenitori che derivano dalle cellule staminali dell’intestino possono

essere commissionati non sono a diventare enterociti (cellule assorbenti) ma anche cellule enteroendocrine ecc.

quando si tratta di cellule staminali è importante conoscere le vie di segnalazione che regolano il destino delle

staminali e il loro comportamento. La via di Wnt non è l’unica via cruciale nel regolare la cripta intestinale e le

cellule staminali perché in realtà la via di segnalazione che permette ai diversi progenitori di diventare enterociti

piuttosto che cellule enteroendocrine , ad esempio, è un’altra. E questa via di segnalazione è quella di Notch.

Essa viene di fatto attivata dalla via di Wnt. Dunque, ricapitolando, Wnt è richiesta per mantenere la cellula

staminale proliferante ma è anche una via richiesta per far si che da questa cellula staminale derivino dei

progenitori commissionati ad andare verso diverse vie: via enterocita, enteroendocrina e così via. La via che

controlla il fatto che una cellula diventi un enterocita piuttosto che un’altra, quindi quella via che controlla la

diversificazione delle cellule intestinali è la via di segnalazione di Notch. Si tratta di una proteina, nello specifico di

un recettore transmembrana ed è importante nello sviluppo. Essa è stata identificata in Drosophila durante lo

sviluppo embrionale, durante lo sviluppo delle cellule nervose perché la via di segnalazione di Notch è coinvolta in

quello che si chiama inibizione laterale : durante lo sviluppo, quando si sviluppano le cellule nervose

dall’ectoderma, foglietto embrionale che da origine anche a cellule epiteliali, questa cellula nervosa che già è

commissionata a diventare tale grazie alla segnalazione di Notch e all’inibizione laterale, dice alle cellule vicine di

non diventare anch’esse neuroni ma di diventare altro, epitelio. Quindi questa via di segnalazione di Notch è stata

identificata in Drosophila durante lo sviluppo delle cellule nervose perché è la via utilizzata dalla futura cellula

nervosa che esprime non Notch ma il suo ligando ( il ligando che si lega al recettore ) e in questo modo, grazie a

questa segnalazione, dice alle cellule circostanti di non seguire lo stesso percorso differenziativo.

VIA DI NOTCH

l ligando di Notch si chiama delta. Quindi abbiamo Notch che è il recettore e si trova sulla membrana plasmatica di

alcune cellule e il ligando delta, che si lega a Notch , è presente su un’altra cellula, ovvero quella circostante. Anche

per Notch vedremo che alla fine di questa segnalazione, entreremo nel nucleo e regoleremo, grazie a questa

segnalazione, l’espressione specifica di un particolare set di geni. Come avviene questo? Vediamo che tra gli esempi

di segnalazione cellulare, questo è l’esempio più diretto e ciò questo stesso recettore Notch, conseguentemente ad

una processazione proteolitica, vedremo che questo recettore subirà ben 3 tagli da parte di proteasi; alla fine di

questi tagli vedremo che un pezzettino, che è la coda citosolica di Notch, sarà lui stesso a migrare nel nucleo e a

regolare la trascrizione. Vediamo per bene cosa succede: vedi figura, Notch in verde, questo recettore, questa

proteina che attraversa la membrana plasmatica; distinguiamo sempre in figura il citosol e l’ambiente

extracellulare. Durante la maturazione, quindi successivamente alla sintesi proteica, a livello dell’apparato di Golgi,

il nostro Notch subisce un primo taglio proteolitico ma questo è necessario per andare a formare due porzioni che

andranno poi a costituire l’etero libero presente sulla superficie cellulare. Tenete presente che per avete Notch

maturo a livello del Golgi questa proteina subisce un taglio proteolitico in grado di generare un eterodimero che poi

sarà espresso sulla superficie della cellula (vedi figura: un eterodimero sporge nel versante extracellulare e parte

verso il citosol). Cosa succede quando arriva il ligando di questo recettore? Sappiamo che il ligando di Notch si

chiama delta (rappr. In rosso in figura) ed è una proteina transmembrana che è espressa sulla superficie di un’altra

cellula. Quindi il ligando di Notch , delta, espresso sulla membrana plasmatica di un’altra cellula si lega a Notch e

questo, l’attacco di delta, il ligando di notch, al proprio recettore Notch produce il secondo taglio proteolitico ( vedi

freccia in figura) . Quindi il secondo taglio proteolitico che Notch subisce è sempre nella porzione extracellulare da

parte di una proteasi ovviamente extracellulare . successivamente a questo secondo taglio da parte della proteasi

extracellulare, questa porzione di Notch rimane legata a delta nell’altra cellula e infatti poi verrà endocitata da

questa cellula che esprime delta. Adesso concentriamoci su ciò che rimane di Notch successivamente al secondo

taglio a livello della superficie della membrana plasmatica della cellula che si riduce. A questo secondo taglio ne

segue un terzo, questa volta nel versante citosolico da parte di una proteasi che si chiama gamma secretasi che

quindi porta avanti il terzo terminale taglio proteolitico di questo recettore e libera questa coda citosolica per il

recettore Notch. È questo pezzettino che dalla membrana plasmatica migrerà attraverso i pori nucleari dentro il

nucleo ed è proprio questa coda citosolica a legarsi al promotore di geni bersaglio: la coda citosolica in sostanza

permette la trascrizione, altrimenti bloccata di specifici geni bersaglio che sono poi coinvolti nell’azione biologica

di Notch.

Sempre parlando di distretti ( nell’adulto ) in cui risiedono cellule staminali, va citato il muscolo scheletrico: esso

presenta anche lui la sua riserva di cellule staminali . Sappiamo che il muscolo è costituito da cellule che sono

impegnate nella contrazione attraverso un sistema contrattile costituito da filamenti di actina e miosina. Le cellule

del muscolo scheletrico sono dei sincizi, sono molto grandi e possono essere lunghe anche 2-3 cm in lunghezza.

Sappiamo che i filamenti di actina e miosina sono organizzati in modo molto ordinato : si parla appunto di

sarcomeri, ovvero unità contrattili che proprio per questa disposizione così ordinata di filamenti spessi e sottili

conferiscono al muscolo scheletrico un aspetto striato. Le cellule del muscolo scheletrico, oltre ad avere una

peculiare modalità di sviluppo e , una volta differenziata, essere in grado di modulare una serie di caratteristiche (la

forza di contrazione ad esempio) ha anche una capacità di rigenerazione.

Facciamo un passo indietro. Durante lo sviluppo embrionale ci sono delle cellule che vengono commissionate (

cellule del mesoderma ) e che diventeranno poi dei mioblasti i quali sono i propulsori delle cellule dei sincizi

differenziati . In questo programma di differenziamento entrano in gioco dei fattori di trascrizione che permettono

che permettono una trascrizione specifica. Abbiamo già parlato di differenziamento come una regolazione

differenziale dell’espressione genica. È ovvio che per quanto riguarda l’actina e la miosina tipiche del muscolo

scheletrico , geni che codificano queste proteine contrattili sono presenti nel genoma del linfocita e vengono

espressi solo in quelle cellule il cui programma di differenziamento porta all’utilizzo di questi geni. In inglese si

chiamano “geni master”, cioè si conosce per il muscolo scheletrico quali sono quei geni che codificano fattori di

trascrizione e devono necessariamente essere accesi per permettere lo sviluppo di un mioblasto muscolare. Quindi

queste proteine codificate da questi geni master ( nel caso del muscolo scheletrico queste proteine appartengono

alla famiglia delle proteine parcs 37.. ) fanno si che quella cellula commissionata acquisisca una memoria da cellula

muscolare che a loro volta permettono la trascrizione di una batteria di geni muscolo-specifici che permetteranno

l’acquisizione di un fenotipo muscolare differenziato. Che cosa fanno questi mioblasti nel corso di questi step

sequenziali di differenziamento controllati da questi geni master che permettono l’espressione differenziale

muscolo-specifica, proliferano per un po’ , poi smettono di proliferare e si fondono insieme ( ricordate che la fibra

muscolare è un sincizio quindi è necessario che questi miotubi, dopo esser diventati in numero sufficiente, vadano

incontro ad un processo di fusione gli uni con gli altri e queste cellule, una volta che il differenziamento è terminato

non possono più dividersi : si definiscono cellule post- mitotiche. Quindi una volta che il differenziamento

muscolare è avvenuto, questa fibra muscolare è in grado di crescere e modulare le sue caratteristiche, rispondendo

a necessita diverse : ad esempio può modulare la forza di contrazione muscolare, la velocità, la resistenza (vedi

muscolo bambino vs adulto o vedi cosa succede dove aver assunto anabolizzanti ). Quindi pur essendo il numero

delle fibre muscolari stabilito molto precocemente , è comunque chiaro che potranno andare incontro a crescita e

modulazione delle loro caratteristiche. (ved figura: cellule con nucleo in blu= mioblasti indirizzate a differenziare

fibre muscolari) . In lab si studiano mioblasti che sotto opportune condizioni possono andare incontro a

differenziamento, quindi da mioblasti arrestano la proliferazione e cominciano a fondersi gli uni con gli altri

generando quindi queste enormi cellule che sono dei sincizi e che condividono un unico citoplasma in cui sono

presenti tanti nuclei. Sono cellule plurinucleate con aspetto striato e che grazie a questi geni master che regolano la

trascrizione, vengono espressi tutta una serie di geni che codificano proteine che servono al muscolo per contrarsi,

come ad es, proteine contrattili. Nel muscolo scheletrico sono presenti delle cellule staminali adulte tissutali che si

chiamano cellule satelliti (vedi figura --> si trovano tra la membrana della fibra e la membrana basale ). Sono così

chiamate per la loro posizione periferica. Hanno un comportamento peculiare rispetto alle cellule staminali adulte

ematopoietiche intestinali. Normalmente le cellule satelliti del muscolo scheletrico se ne stanno quiescenti, stanno

nella loro nicchia ferme. Ricordiamo sempre il ruolo biologico delle staminali adulte: mantenere l’omeostasi

qualora ce ne sia bisogno, in caso di perdita di altre cellule. Quindi se il nostro muscolo scheletrico subisce un

danno, ad esempio un trauma muscolare, che provoca danni a livello delle fibre muscolari, ci sono dei segnali che

svegliano e attivano le cellule staminali satelliti dalla loro quiescenza. Queste cellule vengono risvegliate da un

trauma muscolare, si attivano, proliferano, cominciano a dividersi e migrano verso quella fibra muscolare che ha

subito il danno e fondendosi ad essa ( o fondendosi tra di loro a generare miofibre ) contribuiscono alla

rigenerazione del muscolo scheletrico. Quindi di fatto la rigenerazione muscolare ricapitola quello che è lo

sviluppo embrionale perché tutte quelle tappe che durante lo sviluppo embrionale , dai mioblasti commissionati

vengono attivati quei geni master della famiglia parcs ecc, vengono in un certo senso ripercorsi conseguentemente

all’attivazione della cellula satellite della nicchia staminale che comincia a proliferare, divenire mioblasto che poi

verrà conseguentemente commissionato verso il differenziamento a miotubo, si fonderà alla fibra muscolare o più

in là si fondono fra di loro generando un’integra fibra muscolare e contribuendo alla rigenerazione del muscolo

scheletrico. Parlando di cellule staminali adulte e cercando di intravederne un possibile utilizzo nella terapia per

curare tutta una serie di malattie, di patologie , uno scossone ha generato tanti nuovi entusiasmi quando a fine degli

anni Novanta (abbiamo detto che risiedono in tutti i distretti dell’adulto e contribuiscono all’omeostasi ) .

Un gruppo di ricercatori italiani nel 1998, dimostrò attraverso un articolo pubblicato su “Science”, dei dati in cui la

cellula staminali del midollo osseo (ematopoietica) era in grado di (in opportune condizioni) di contribuire alla

rigenerazione del midollo osseo, quando invece si pensava solamente che facessero cellule del sangue.

Ammettendo una capacita maggiore di queste cellule. Dopo questo lavoro, ne furono pubblicati un’ampia serie,

pubblicati sempre su “Science”. Uno di questi riguardava le cellule staminali neurali (site in particolari zone del

sistema nervoso) in realtà potevano diventare cellule del sangue, quando invece ci si aspettava che avrebbero dato

soltanto origine a neuroni oligodendrociti ed ecc…quindi plasticità a 360°. In questa plasticità si videro delle

potenzialità della terapia cellulare. E ovviamente anche molte controversie. Però dimostrando in vitro non si può

escludere che possa essere sfruttata questa plasticità. Ovviamente il microambiente è cruciale in questo

cambiamento di comportamento. Nella nicchia sua la cellula staminale adulta fa quello che deve fare per il tessuto,

per l’omeostasi di quel tessuto, ma estrapolata da quell’ambiente e messa in coltura (coltura ex-vivo) cioè in

laboratorio, si cambiano dunque le condizioni di coltura e di conseguenza l’espressione di quella cellula fa

altrettanto. Questa plasticità si riferisce non soltanto alla capacità che derivano dallo stesso foglietto embrionale

ma anche da cellule che derivano da foglietti embrionali diversi. Questi dati rivoluzionano il concetto di staminalità

ovviamente senza manipolazioni in EX-VIVO cioè tolta la cellula staminale nelle condizioni in cui sta, sono ancora

validi. Se una cellula staminale è in grado di differenziarsi in cellule cui essere non genererebbe normalmente,

sicuramente questa discendenza cellulare in un altro tipo cellulare deve essere qualcosa che ha un ruolo fisiologico

in vivo. Poi per alcuni specifici eventi questo è stato ampiamente dimostrato. E’ importante dunque il

microamibente per la cellula staminale. La nicchia quindi è il microambiente, che influenza il differenziamento e

che segnala alla cellula staminale adulta cosa fare, ne regola il destino. Nel caso della cellula satellite staminale

adulta residente nel muscolo scheletrico ha una posizione periferica rispetto alla fibra ed è compresa fra la

membrana della fibra e la lamina basale. Nella sua nicchia la cellula staminale riceve dei segnali di tipo diverso

grazie a rilascio di molecole secrete oppure con un contatto diretto proveniente da cellule adiacenti. sia da cellule

quali ad esempio fibroblasti del tessuto connettivo aldilà della lamina basale, le cellule del sistema immunitario,

cosi anche la stessa fibra muscolare che la circonda, tutte cellule che inoltrano segnali di tipo diverso cosa che

influenza principalmente la cellula staminale dirigendo cosi il carattere della cellula staminale pronta sempre al

differenziamento futuro indotto. da non confondere le differenze della nicchia staminale di un muscolo giovane una

cosa è l'ambiente in cui la staminale adulta o cellula scheletrica si trova a "vivere" in un muscolo invecchiato. In

generale una cellula staminale che si trova in un muscolo giovane strutturato in una maniera più approssimata,

rispetto a un muscolo invecchiato, la cellula staminale riceverà dunque dei segnali che provengono da un certo

numero di fibroblasti e cosi via, il muscolo invecchiato invece, è piu fibrotico,i fibroblasti sono presenti in numero

maggiore cosi anche il numero degli (aritrociti?) lo spessore della lamina basale è aumentato\incrementato, e

dunque cambia anche l'aspetto e il comportamento del sistema immunitario. In deduzione, lungo il corso della vita

di un individuo le cellule staminali (contribuendo all'omeostasi di quel tessuto)subiscono dei profondi

cambiamenti in simmetria al microambiente in cui la cellula staminale si ritrova a vivere. è chiaro che parlare di

questo comportamento e quindi decidere un'autorigenerazione piuttosto che il differenziamento è importante per

garantire l'omeostasi dell'individuo. Durante il differenziamento cio che varia non è il patrimonio genetico ma si ha

un’espressione genica differenziale, grazie a regolazioni interne ed esterne quella cellula accenderà alcuni geni e se

silenzierà altri. Questo concetto durante il differenziamento non si ha alcuna perdita di geni, ma vengono utilizzati

in modo diverso. un neurone ha lo stesso p.g. di un linfocita. Ma per funzionare una cellula ha bisogno di aver

espressi tutta una serie di geni. Si parla di totipotenza nucleare delle cellule somatiche, che attraverso la clonazione

riproduttiva che serve soltanto a individuare il nucleo di una cellula e non differenziata, e quel nucleo non è

diverso da una cellula differenziata dimostrando quindi che il nucleo di una cellula somatica è in un certo senso

totipotente, riuscendo a prendere il nucleo di una cellula somatica in un anfibio, cellule intestinali di girino, e le

iniettò in una cellula uovo, non fecondata, quest’ultima Anucleata. Prende il nucleo di una cellula e la inietta in una

cellula uovo il quale nucleo era stato precedentemente distrutto, dimostrando cosi la totipotenza del mondo di

quella cellula somatica. se in queste cellule che sono differenziate a svolgere una determinata funzione, il nucleo di

queste cellule ha visto la perdita di alcuni geni? Se no, se sono presenti tutti questi geni presenti nel nucleo della

cellula differenziata e iniettati nella cellula uovo devono essere in grado se pur con bassissima frequenza devono

essere in grado a dar vita per clonazione riproduttiva a un organismo. Iniettò i nuclei di cellule intestinali

differenziate in cellule uovo in cui il nucleo era stato distrutto. il nucleo riusci ad andare dunque ad andare in

contro alla segmentazione ea riuscire a sviluppare il normale sviluppo dello zigote e del girino (intorno agli anni

sessanta). Nel 97 si arrivò poi alla clonazione del mammifero. Suscitando scalpore. Il concetto di base è lo stesso,il

nucleo della cellula somatica di una ghiandola mammaria, veniva fatta fondere con una cellula uovo e in 1 su 250

tentativi riusci a sviluppare la famosa pecora dolly, dunque un clone. Il clonaggio di tutti questi animali, compresa

dolly, ha portato a qualche effetto collaterale, infatti tutti morirono prematuramente. Ma aldilà di questo, la

totipotenza nucleare delle cellule somatiche differenziate è di FONDAMENTALE IMPORTANZA. Parlando di cellule

staminali, la clonazione terapeutica vuole bypassare quei problemi immunologici che invece potremmo avere

utilizzando cellule staminali. Grazie a questa clonazione che non è una clonazione riproduttiva, si arriva ad avere

delle cellule staminali embrionali, e quindi a servizio del paziente. Il concetto è lo stesso della clonazione

riproduttiva. Il nucleo della cellula somatica grazie a un capillare sottilissimo, viene riproiettato nel citoplasma

della cellula uovo enucleata, e questa cellula uovo attraverso divisioni mitotiche arriva allo stadio embrionale delle

blastocisti e questa viene impiantata nell’utero della madre ricevente (nella clonazione riproduttiva). Invece nella

clonazione terapeutica, abbiamo come fine ultimo delle cellule staminali totipotenti. Quindi dalla massa interna di

questa blastocisti vengono isolate queste cellule ed essendo pluripotenti vengono indirizzate a diventare qualsiasi

tipo cellulare derivato dai foglietti embrionali.

Con questa metodica partendo dal nucleo di una cellula somatica del paziente si puo arrivare ad avere una cellula

staminali embrionali pluripotenti che hanno lo stesso genoma di quel paziente che dal punto di vista immunologico

è riconosciuto come terapeutico. Dal punto di vista del ricercatore, è bene che la ricerca proceda, non ci sono

restrizioni purchè siano efficienti e operino nella totale sicurezza. Fra le patologie vi è la distrofia muscolare, quindi

un insieme di malattie di tipo degenerativo neuromuscolari genetico. Sono correlate dipendono dai geni coinvolti

nel formare la fibra muscolare. Quindi questi geni mutanti nella distrofia, codificano per proteine che formano una

complessa impalcatura proteica a livello del sarcolemma che compromettono la sua funzionalità. Queste cellule si

chiamano mesongioblasti, sono cellule considerate staminali. E possono essere utilizzate nella terapia della

distrofia muscolare. E associati ai vasi, grazie al circolo sanguigno sono in grado di aderire all’endotelio e migrano

laddove c’è bisogno di tessuto e in linea di principio sembrava fossero adatte per la terapia della distrofia

muscolare. Nella distrofia muscolare queste cellule satelliti sono quiescienti, dunque non sono attivate, non si

dividono, quindi è come se il muscolo fosse continuamente danneggiato, e quindi come se richiedesse di continuo le

cellule staminali. È chiaro che il danno non puo essere rigenerato, perché non è un muscolo funzionale. Queste

cellule satelliti continuamente a questo proliferare vanno in contro ad un esaurimento del fulcro staminale

residente nel muscolo scheletrico. Normalmente questa situazione si puo verificare per tutti i distretti staminali.

Ma qui è una situazione portata all’estremo. E si arriva effettivamente a uno stress delle cellule che non smettono

mai di dividersi.

11 aprile 2016

I mesoangioblasti sono cellule staminali associati ai vasi sanguigni definiti progenitori mesodermici in quanto

sono in grado di differenziarsi in vari tipi cellulari appartenenti a diversi tessuti, quali le cellule del muscolo

scheletrico, cardiaco, liscio, osteociti, condrociti, adipociti e cellule dell’endotelio.

Il loro scopritore è Giulio Cossu, da sempre interessato alla distrofia muscolare, studiò queste cellule per la

loro plasticità nel diventare cellule del muscolo scheletrico e ipotizzò una connessione tra questa loro

caratteristica e la rigenerazione del muscolo danneggiato dalla distrofia. Ciò è possibile perché non solo le

cellule satelliti, residenti nel muscolo scheletrico nella nicchia fra fibra muscolare e lamina basale,

contribuiscono alla rigenerazione del muscolo scheletrico ma anche altre cellule multipotenti come i

mesangioblasti possono contribuire al riparo del muscolo.

Sono stati quindi condotti degli studi in cui si notò che dopo aver iniettato mesoangioblasti nell’arteria

femorale di cavie distrofiche queste cellule avevano contribuito a migliorare sia la morfologia che la

funzionalità del muscolo scheletrico.

Un’altra cosa che venne ipotizzata e che potrebbe essere eseguita nella terapia cellulare è di non isolare

mesoangioblasti sani ed iniettarli in un paziente sano ma bensì prelevare i mesoangioblasti dal paziente

distrofico, purificarli e sfruttando la loro capacità di self-renewal (autorinnovamento) ed espansi in vitro.

Essendo stati isolati dal paziente distrofico, questi mesoangioblasti hanno geneticamente una mutazione a

livello del gene coinvolto: si può quindi ipotizzare la correzione di tale mutazione utilizzando dei vettori virali

che trasportano il gene sano.

Difatti i virus infettano in coltura i mesoangioblasti, “curano” il problema sostituendo il gene sano a quello

mutato; successivamente i mesoangioblasti vengono nuovamente iniettati nell’arteria dell’organismo malato

e contribuiscono alla rigenerazione del muscolo scheletrico, andando a sintetizzare la proteina mancante

nella distrofia.

Questa procedura è quindi molto efficace e, utilizzando mesoangioblasti dello stesso individuo si escludono

anche problemi di tipo immunologico.

Misurando la forza dei muscoli si vede che è significativamente ridotta nei muscoli di topi distrofici mentre

conseguentemente al trattamento con mesoangioblasti, le cellule muscolari del topo distrofico curato

riacquistano una forza pari a quella dell’individuo-controllo sano.

Forte di questi dati ottenuti in vivo, nel 2011 il professor Cossu ha iniziato un primo studio clinico basato sul

trapianto di mesoangioblasti isolati da donatori sani immunocompatibili, iniettati più volte in bambini affetti

da distrofia muscolare: lo studio ha fornito dei buoni risultati in termini di sicurezza ma non è stato molto

efficiente perché probabilmente il numero di mesoangioblasti non è stato sufficiente per raggiungere

l’estesissimo muscolo scheletrico e quindi contribuire alla rigenerazione.

Le cellule staminali adulte (ASC) che normalmente rimangono nella loro nicchia staminale per tutta la durata

della vita dell’individuo consentendo la rigenerazione e l’omeostasi del tessuto sono molto rare, il loro

comportamento cambia al variare della nicchia staminale e questa viene impoverita dalle cellule staminali

stesse in seguito all’invecchiamento dell’individuo.

Sicuramente, differentemente alle cellule staminali embrionali (ESC), le ASC non sono tumorigeniche e

qualora, in virtù della loro plasticità venissero impiegate per un trapianto autologo cioè prelevate dallo stesso

paziente e poi usate in terapia non presentano problemi di rigetto.

Ci sono però delle necessità che devono essere soddisfatte affinché queste cellule possano essere

efficacemente utilizzate nella terapia cellulare:

• devono poter essere facilmente isolate, quindi accessibili;

• devono poter essere espanse in vitro senza perdere staminalità e potenzialità differenziativa, in modo

da aver un ragguardevole numero di cellule per poi procedere al trapianto;

• devono poter essere veicolate (homing) al tessuto danneggiato in modo efficiente e selettivo;

• devono poter sopravvivere nel tessuto danneggiato e differenziare con alta efficienza.

Tutte queste necessità devono essere soddisfatte affinchè le cellule staminali adulte possano essere

impiegate nella terapia cellulare.

Nel 2012 il premio Nobel per la medicina è stato attribuito a John Gurdon e Shinya Yamanaka per il loro

contributo alle ricerche sulla riprogrammazione delle cellule adulte in staminali e per avere aperto una nuova

strada per la medicina rigenerativa.

Shinya Yamanaka è il padre delle cellule iPS, le cellule staminali pluripotenti indotte; infatti, forte di quello che

aveva dimostrato John Gurdon 40 anni prima (ossia trapiantando il nucleo di una cellula differenziata

intestinale di un anfibio in una cellula uovo nucleata e riuscendo ad ottenere un nuovo individuo, aveva

dimostrato che durante il differenziamento il nucleo della cellula somatica intestinale differenziata non aveva

perduto alcun gene ma, evidentemente, erano stati espressi in modo diverso durante il differenziamento), è

riuscito a riprogrammare cellule somatiche differenziate ossia riportarle da uno stato differenziato in uno

pluripotente tipico delle cellule staminali embrionali.

Per far ciò, Yamanaka, fece esprimere alle cellule somatiche quattro fattori di trascrizione:

• • • •

Oct4, cMyc, Klf4, Sox2.

Yamanaka scoprì quindi che l’espressione di questi quattro fattori di trascrizione ad una cellula somatica

differenziata è suffcicente per trasformare, o meglio riprogrammare, la cellula somatica in uno stato di

staminalità pluripotente tipico delle cellule staminali embrionali ESC.

Compì i suoi esperimenti inizialmente su fibroblasti murini, successivamente verificò l’esito positivo anche su

fibroblasti umani.

Le cellule adulte vengono riprogrammate conseguentemente ad un’infezione virale, i virus infatti sono i

vettori che contengono i geni codificanti per i 4 fattori trascrizionali in questione. Dopo l’infezione le cellule

somatiche esprimono questi geni e i fattori trascrizionali sono in grado di riprogrammarla, cambiando

profondamente l’espressione genica delle stesse in quanto viene riattivata la trascrizione di geni che in una

cellula differenziata sono spenti e inibita quella di altri.

Da questo momento in poi le cellule pluripotenti indotte iPS che derivano dalla riprogrammazione di cellule

somatiche (i fibroblasti) sono in grado di differenziarsi in tutti i tipi cellulari che derivano dai tre foglietti

embrionali, ectoderma, mesoderma, e endoderma, proprio come le cellule staminali embrionali.

Inoltre, se iniettate in un soggetto immunodepresso, sono in grado di indurre la formazione di tumori, come

le ESC.

È possibile generare iPS non soltanto a partire dai fibroblasti ma anche da altri tipi di cellule differenziate

come ad esempio le cellule del sangue. Nel 2010 infatti un gruppo di ricercatori in California è riuscito ad

ottenere dei neuroni funzionali direttamente dai fibroblasti senza passare attraverso lo stadio di cellula

staminale pluripotente.

Questa scoperta rivoluzionaria al di là di aver fatto luce sulle possibilità riguardanti la totipotenza al dare una

cellula differenziata da parte di un nucleo somatico, ha anche acceso grandi entusiasmi nel campo delle

cellule staminali al fine di usare queste cellule nella terapia cellulare perché ottenendo delle ESC direttamente

dal paziente si eliminerebbe il problema del rigetto da parte del sistema immunitario di quest’ultimo.

Nell’ottica di un eventuale impiego delle iPS nella terapia cellulare non si può ignorare la loro tumorigenicità,

tanto più che uno dei 4 fattori di trascrizione che vengono fatti esprimere dalle cellule per riprogrammarle,

myc, è coinvolto nella trasformazione cellulare ed una sua forzata espressione potrebbe far diventare la

cellula tumorale.

Ciononostante lo stesso gruppo di Yamanaka ha dimostrato che, se pur con un’efficienza minore rispetto

all’utilizzo dei 4 fattori usuali, è possibile utilizzare un altro cocktail di geni privato di myc.

Un’altra preoccupazione riguarda l’utilizzo dei vettori virali, questi possono inserirsi nel genoma delle cellule e

trasformarle in tumorali. Lo stesso Yamanaka nel 2008 ha dimostrato la possibilità di introdurre i fattori senza

l’impiego di virus ma usando altre metodiche più sicure.

Nel 2011 è stato visto che le iPS non sono del tutto identiche alle ESC: innanzitutto le prime presentano una

maggiore instabilità a livello del genoma che le rende più simili a cellule tumorali e per questo motivo

tendono ad acquisire caratteri tumorali più facilmente rispetto alle ESC.

In seconda battuta le iPS mantengono una sorta di memoria epigenetica dal tessuto da cui provengono, per

cui che anche se riprogrammato un fibroblasto mantiene nel suo genoma delle modificazioni epigenetiche

(come metilazione, acetilazione istonica etc..) che gli ricordano il tessuto da cui deriva: in questo modo

tendono a differenziarsi maggiormente verso le cellule tipiche del tessuto da cui derivano.

Dopo questa scoperta si riuscì a spiegare lo scarso successo dell’esperimento sulla clonazione terapeutica di

Gurdon: il nucleo della cellula intestinale del girino che viene trapiantato in una cellula uovo non fecondata e

nucleata ha una memoria epigenetica molto forte, che non viene completamente eliminata con la

riprogrammazione. Il nucleo, quindi continua ad esprimere alcuni geni che erano abbondantemente espressi

nelle cellule differenziate e ciò può interferire con la riprogrammazione.

Inoltre, da parte delle cellule differenziate, vi è una resistenza alla trascrizione dei geni che erano stati spenti

durante il differenziamento; ciò rende conto dell’estrema stabilità di queste cellule ed evita l’instaurarsi di

facili meccanismi che potrebbero portare all’insorgenza di cancro ed altri difetti.

Quando si parla di riprogrammazione è evidente che il nucleo della cellula somatica deve andare incontro a

profonde modifiche dello stato della cromatina come sostituzioni di varianti istoniche e demetilazione del

DNA.

Ad oggi le IPS sono uno strumento potentissimo per ottenere facilmente in vitro dei modelli cellulari di

patologie utili per studiare i meccanismi molecolari coinvolti in quella patologia e per lo screening (test) di

potenziali farmaci.

CELLULE STAMINALI TUMORALI

Così come le ASC sono rare all’interno di un distretto, dotate di self-renewal e in grado di differenziarsi in uno

o più tipi cellulari di cui quell’organo è composto, così è stata ipotizzata e dimostrata l’esistenza di cellule

staminali tumorali, rare cellule all’interno di un tumore che guidano sia la crescita del tumore che la sua

disseminazione nelle altre parti del corpo (metastasi).

Si crea quindi una nuova ipotesi sull’origine del cancro secondo la quale:

1. I tumori derivano da cellule staminali tumorali che hanno proprietà delle cellule staminali normali, in

particolare capacità di auto-rinnovamento e multipotenzialità.

2. Il bersaglio della trasformazione tumorale potrebbe essere la cellula staminale in quanto ha già

attivato il meccanismo dell’autorinnovamento e, permanendo nella nicchia staminale per un tempo

molto più lungo rispetto alla progenie differenziata che da essa deriva, potrebbe permettere

l’accumularsi di più mutazioni.

Una cellula staminale tumorale potrebbe originare anche da un progenitore che si amplifica in

transito che attraverso mutazioni e modificazioni epigenetiche abbia acquisito la capacità di auto-

rinnovamento, ma per far ciò sono richieste più mutazioni.

3. Il cancro è una malattia delle cellule staminali e non un semplice meccanismo in base al quale la

proliferazione cellulare è alterata.

Si possono infatti provare una serie di caratteristiche comuni tra le cellule staminali tumorali e le

normali:

▪ Mantenimento della nicchia staminale: nel tessuto normale le cellule si autorigenerano per

mantenere la nicchia staminale durante tutta la vita dell’organismo, nel tumore le cellule si

autorigenerano per permettere la crescita del tumore stesso.

▪ Differenziamento in diversi tipi cellulari: danno infatti origine ad una popolazione

eterogenea di cellule che compongono l’organo o il tumore.

▪ Sono regolate dagli stessi segnali intracellulari: le vie che controllano l’automantenimento

nelle celllule staminali sono spesso deregolate nelle cellule staminali tumorali.

▪ Molte vie di segnalazione (Notch, Hedgehog e Wnt) che regolano l’autorinnovamento delle

staminali sono associate con i tumori.

Come si originano le cellule staminali del cancro?

Considerando questo nuovo modello secondo il quale solo le cellule staminali tumorali a permettere la

crescita della metastasi, sono solo queste (in giallo) che possono estensivamente crescere nel tumore.

Modello precedente Modello nuovo

Non è facile però riconoscere una cellula staminale tumorale da una staminale non tumorale poiché sono

molto simili ed i marcatori utilizzati, specifiche proteine di membrana, non sono specifici per le staminali

tumorali poiché generalmente presenti anche sulle cellule staminali normali; inoltre le tumorali sono

caratterizzate dal poter espellere velocemente alcune sostanze chimiche, come i coloranti.

L’identificazione della staminale tumorale non è facile ma, tuttavia, bisogna tenerne conto in una efficace e

fruttuosa terapia contro i tumori, individuandole come bersagli di un’eventuale chemioterapia perché si deve

a loro la comparsa di recidive.

Una terapia, infatti, che ha come bersaglio le cellule staminali tumorali porterà una regressione del tumore ed

alla non ricomparsa di recidive; Viceversa, una terapia che distrugge la maggior parte delle cellule del tumore,

quelle discendenti dalla staminale tumorale, anche se porta ad un’iniziale regressione tumorale non esclude

la ricomparsa di recidive e la ricrescita del tumore.

Quindi le future terapie dovranno tenere in considerazione anche le cellule staminali tumorali

particolarmente resistenti a qualsiasi trattamento.

Parlando di vie di segnalazioni delle cellule staminali tumorali c’è la via di segnalazione di Hedgehog.

Le proteine Hedgehog sono state scoperte in Drosophila, la mutazione del gene Hedgehog produce una larva

ricoperta di spine che ricorda un riccio (Hedgehog).

Come le proteine Wnt, le proteine Hedgehog vengono secrete e si legano ai recettori di membrana presenti

sulle cellule: hanno un ruolo importante come mediatori locali (sia con attività paracrina che autocrina) e

potenti morfogeni in grado di segnalare il momento in cui le cellule si stanno sviluppando sia negli

invertebrati che nei vertebrati.

Nei vertebrati sono state riconosciute tre diverse proteine Hedgehog che entrano in gioco nella via di

segnalazione: 1. sonic hedgehog,

2. desert hedgehog,

3. indian hedgehog.

In modo simile a Wnt, le proteine Hedgehog legandosi ai recettori presenti sulla superficie cellulare mediano

la trascrizione di geni specifici funzionando come co-attivatori trascrizionali conseguentemente all’attivazione

per proteolisi di una proteina latente, che non viene più distrutta.

Così come per Wnt e Notch un’eccessiva segnalazione può portare alla formazione di tumori.

I recettori delle proteine Hedgehog sono due:

• Patched, che attraversa 12 volte la membrabna plasmatica;

• iHog, è il co-recettore.

Oltre a questi due elementi inseriti nella membrana plasmatica

occorre considerare una terza proteina, Smoothened, che attraversa

7 volte la membrana e che in assenza di Hedgehog è tenuta inattiva

da Patched a livello di vescicole intracellulari.

Quando arriva Hedgehog, si lega al suo recettore Patched e al co-

recettore iHog, questo legame fa sì che Patched venga inibito,

internalizzato e degradato e che Smoothened, non più inibito da

Patched, sia in grado di traslocare sulla membrana plasmatica.

Gli effetti a valle della via di segnalazione di Hedgehog sono mediate da una proteina latente chiamata Ci

(Cubitus interruptus).

In assenza di Hedgehog, Ci viene degradata dal complesso multiproteico di cui fanno parte una chinasi

chiamata Fused ed una proteina “scaffold” (impalcatura) col nome di Costal2.

Ci viene proteoliticamente degradata a formare un piccolo frammento proteico che si accumula nel nucleo e

funziona da co-repressore, contribuendo a silenziare la trascrizione di geni bersaglio di Hedgehog.

Per la degradazione di Ci a livello del complesso multiproteico citosolico sono necessari degli eventi di

fosforilazione di Ci catalizzati da varie proteine chinasi come GSK3, CK1 e PKA (protein-chinasi A).

In presenza di Hedgehog, questo si lega a Patched ed al co-repressore e questo legame permette a

Smoothened, non essendo più inibito da Patched, di migrare sulla membrana plasmatica.

Una volta in loco, Smoothened recluta la proteina Ci e gli altri membri del complesso multiproteico di

degradazione ossia la serina treonina chinasi Fused e la proteina scaffold Costal2.

A livello della membrana Costal2 non è più in grado di legare GSK3, CK1 e PKA così che Ci non è più fosforilata

e quindi non viene più degradata.

In questo modo Ci non viene più tagliata e non si genera più il frammento

proteolitico che funziona da co-repressore: Ci pertanto si accumula, può

traslocare nel nucleo e funzionare da co-attivatore attivando la trascrizione

di geni bersaglio di Hedgehog di cui fa parte lo stesso Patched (è un circuito

negativo).

Il fatto che Hedgehog stimoli la trascrizione mediata da Ci dello stesso

recettore che tiene inibito Smoothened è un modo intrinseco per cui questa

via di segnalazione ha in sé la capacità di spegnersi.

Mutazioni a carico del gene che codifica per Patched comportano una

deregolazione della via, infatti questo gene è spesso mutato in vari tumori,

tra i quali i carcinomi della pelle.

Per trattare tumori associati ad un’eccessiva proliferazione di Hedgehog si

ha a disposizione un farmaco contenete ciclopamina, molecola isolata da

una particolare specie di giglio selvatico, che si lega indissolubilmente a

Smoothened inibendolo. Questa molecola è essenziale per spegnere la via

di segnalazione di Hedgehog nelle situazioni in cui si ha un’eccessiva

produzione di esso.

Questa molecola è stata identificata poiché apportava profondi difetti di

sviluppo alle pecore che pascolavano in terreni in cui erano presenti questi

gigli. I difetti in questione includono la presenza di un unico occhio in

posizione centrale.

14 Aprile 2016

Meccanismi molecolari del controllo traduzionale

Sapete già che la sintesi proteica o traduzione avviene a livello di complessi macromolecolari che sono i

ribosomi i quali sono costituiti da RNA ribosomiale e da proteine ribosomiali e che il loro assemblaggio

avviene a livello del nucleolo per quanto riguarda le cellule eucariotiche.

Geni che codificano per gli RNA ribosomiali vengono trascritti da una particolare isoforma dell’RNApolimerasi

che è quella di tipo 1 che lavora quindi specificatamente a livello del nucleolo e successivamente alla loro

trascrizione, questi trascritti vanno incontro nel nucleolo ad una maturazione.

A livello del nucleolo della cellula eucariotica viene trascritto l’RNA da parte dell’RNA-p di tipo 1 e sempre nel

nucleolo il trascritto primario subisce dei tagli che libereranno RNA 18 S ecc, e contemporaneamente

arriveranno le proteine ribosomiali tradotte nel citoplasma, entreranno attraverso i pori nucleari e a livello

del nucleolo verranno assemblate insieme agli RNA portando alla formazione della sub unità minore e della

sub unità maggiore ribosomiale.

Ovviamente poi queste sub unità ribosomiali dovranno uscire dal nucleo perché la traduzione avviene fuori

dal nucleo nelle cellule eucariotiche.

Si possono individuare delle popolazioni di ribosomi liberi (tenete presente che la traduzione di qualsiasi

mRNA inizia a livello di ribosomi liberi nel citosol) ma esiste anche una popolazione di ribosomi che è

fisicamente associata alle membrane del RER e anche alla carioteca ovvero l’involucro nucleare sul versante

citoplasmatico. Questo perché questi ribosomi stanno traducendo proteine che avranno un particolare

destino ma comunque dobbiamo inquadrare queste popolazioni in un quadro dinamico cioè non è che i

ribosomi associati al RER rimangono sempre associati ad esso; da esso si staccheranno una volta finita la

traduzione della proteina e torneranno ad essere dei ribosomi liberi… successivamente se si troveranno a

tradurre un mRNA con una particolare sequenza segnale (che quindi marca una proteina della via secretoria)

allora questi ribosomi torneranno ad associarsi con il reticolo endoplasmatico rugoso.

In una tipica cellula eucariotica sono presenti milioni di queste macchine, di questi complessi macromolecolari

specializzati che rendono possibile la sintesi proteica.

Considerando ribosomi eucariotici ma anche procariotici possiamo dire che differiscono per quanto riguarda

le dimensioni: quelli procariotici sono più piccoli di quelli eucariotici; ma essenzialmente sono entrambi

costituiti da una subunità minore e una sub unità maggiore(ciò è a conferma del fatto che la sintesi proteica è

un processo fondamentale evolutosi fin dai tempi dei tempi).

Questi complessi vedono il verificarsi di una simile sequenza di reazioni che portano alla formazione di un

polipeptide.

Questi ribosomi sia nei procarioti che negli eucarioti sono dei grossi complessi molecolari,perciò usare il

dalton non è efficace perché non sono numeri facilmente gestibili per questo si preferisce parlare di ribosoma

procariotico 70S e di ribosoma eucariotico 80S.

Svedberg era un norvegese che ha messo in atto queste tecniche ultracentrifugative e il termine oggi sta ad

indicare il coefficiente di sedimentazione. Questi complessi macromolecolari vengono ultracentrifugati quindi

sottoposti a centrifugazione in condizioni standard e quello corrisponde al coefficiente di sedimentazione che

si ottiene tenendo conto del peso molecolare e di tutta un’altra serie di caratteristiche come densità ecc…

Composizione molecolare dei ribosomi

Nella sub unità minore procariotica l’rRNA è il 16 S, mentre quella maggiore vede la presenza di due rRNA che

sono 23S e 5S; associati a questi rRNA troviamo tutta una serie di proteine(34 per la sub unità maggiore, 21

per quella minore).

Non è importante ricordare questi numeri ma bisogna tener presente che questi complessi macromolecolari

sono costituiti da rRNA e proteine.

Spostandoci al ribosoma eucariotico vediamo che esso è più grande( 80S) e che l’rRNA presente nella sub

unità minore è il 18S mentre nella sub unità maggiore insieme ad un numero maggiore di proteine troviamo

tre diversi tipi di rRNA (28S 5,8S, 5S).

Prendendo in considerazione questi rRNA si può notare la struttura secondaria che queste molecole

assumono grazie ovviamente a sequenze di complementarietà tra le basi.

L’evoluzione ha conservato la struttura secondaria che ne rende possibile la funzione mentre se si va a vedere

la sequenza nucleotidica si nota che è diversa tra procarioti ed eucarioti: infatti l’rRNA 18S ha dei nucleotidi in

più rispetto al 16S ma è stato visto, considerando le strutture, che questi nucleotidi in più nel 18S è come se

fossero delle aggiunte successive e quindi dei domini extra che però lasciano di fatto invariata la struttura che

troviamo già in quello procariotico.

RNA 18S

Queste molecole sono molto conservate infatti vengono usate anche per gli studi filogenetici per capire la

distanza evolutiva esistente. Nelle analisi di routine di laboratorio il gene che codifica per l’rRNA viene

utilizzato come normalizzatore in certi esperimenti perché è sufficiente avere il modo di misurare

l’espressione del 18S per poterlo applicare a modelli cellulari diversi(dal momento che è molto conservato).

Il primo a scoprire l’importanza di questi complessi macromolecolari studiando le cellule del pancreas(che

hanno un’elevata attività di sintesi proteica) fu Palade che nel 1974 ha vinto il Nobel per gli studi sulla sintesi

proteica e sulla secrezione delle proteine. Fu il primo a chiarire i meccanismi della sintesi proteica e i vari

passaggi che riguardano la secrezione delle proteine.

Ma è del 2000 la risoluzione della struttura tridimensionale dei ribosomi (nel 2009 il nobel è stato dato per gli

studi sui ribosomi) e questa è considerata una delle scoperte più importanti della biologia strutturale dell’RNA

perchè è stato possibile risolvere a livello atomico la struttura di questi complessi macromolecolari.

Questi studi hanno anche permesso di capire che di fatto il ribosoma si comporta come un grande

ribozima(una proteina con attività catalitica) e vedremo che la formazione del legame peptidico da parte della

subunità maggiore del ribosoma è a carico della peptidil-transferasi che è un rRNA della sub maggiore.

La subunità minore del ribosoma accoglie, grazie alla formazione di siti specializzati (sitoA,P,E), i tRNA

permettendo l’interazione dell’anticodone del tRNA con il codone presente sul messaggero.

La subunità maggiore è quella che contiene attività catalitica portata avanti dalla peptidil-transferasi che

permette l’allungamento della catena polipeptidica; nella sub unità maggiore è presente una specie di

galleria: infatti è noto che via via che il polipeptide nascente si allunga, prima di sporgere fuori dal ribosoma

attraversa un tunnel riempito di soluzione acquosa le cui dimensioni sono note grazie alla risoluzione

tridimensionale della struttura del ribosoma e che corrispondono a 10nm di lunghezza X 1,5 nm di diametro.

Questo tunnel è costituito da rRNA e la proteina passa attraverso questo tunnel ancora in una forma non

ripiegata(perché l’intervento di chaperon molecolari sarà successivo alla fuoriuscita del polipeptide dal

ribosoma). Questo tunnel fornisce come una sorta di rivestimento che permette al polipeptide in crescita di

scorrere e uscire fuori dal ribosoma. Questi complessi macromolecolari sono estremamente efficienti:

parlando di velocità possiamo dire che i ribosomi eucariotici aggiungono un aminoacido al secondo, sono più

lenti rispetto a quelli procariotici che in un secondo ne aggiungono 20. Vedremo che c’è un compromesso tra

la velocità di sintesi proteica (può impiegare secondi fino a diversi minuti) e l’accuratezza (che ovviamente

richiederebbe una maggior lentezza).

Qui è rappresentata la struttura degli rRNA: quello che è possibile vedere è che questi rRNA, il 22S e il 5S,

grazie alla formazione di questi ripiegamenti dovuti all’appaiamento di basi complementari, riescono a

formare delle vere e proprie tasche(pensate all’enzima e al sito attivo) dove il meccanismo di catalisi procede

grazie all’orientamento dei reagenti aiutato dalla formazione del legame a H.

Tenete presente che rispetto a una catena proteica, l’RNA non ha dei gruppi funzionali che si possono

facilmente idrolizzare e che quindi aiutano a livello del sito attivo la catalisi (la reazione dei due reagenti per

essere trasformati nei prodotti); quindi si pensa che queste molecole di RNA ripiegandosi e formando con i

reagenti dei legami a H riescono comunque a permettere reazioni sofisticate.

Da questa immagine si può notare che le proteine in un ribosoma rimangono all’esterno della struttura(sono

colorate in arancione) mentre il cuore del ribosoma è costituito da rRNA. Ricordatevi che il ribosoma è da

considerare un grande ribozima quindi un complesso macromolecolare in cui le reazioni sono portate aventi

non da proteine, ma da RNA; infatti a conferma di questo le proteine ribosomiali sono generalmente disposte

sulla superficie quindi il loro ruolo è più di stabilizzare la struttura funzionale dell’RNA

In questo caso il dominio globulare della proteina rimane

all’esterno, infilandosi con una coda in quegli spazi lasciati

dall’rRNA.

Ma è l’rRNA, grazie a questi ripiegamenti, a formare i siti specifici

di legame per i tRNA: il sito P, peptidilico; A, aminoacidico e il sito

E che sta per exit dal quale passa il tRNA scarico privato

dell’aminoacido.

Esistono due popolazioni di ribosomi:

-quelli liberi nel citosol a livello dei quali iniziano tutte le traduzioni e le sintesi proteiche

-quelli che traducono proteine con una particolare sequenza segnale che dovranno entrare nel lume del

reticolo endoplasmatico si assoceranno alle membrane del RER per poi da esso distaccarsi dopo che il

polipeptide sarà stato completamente tradotto

Quindi la popolazione dei ribosomi va vista in un complesso dinamico dove c’è un continuo ciclo tra quelli

liberi e quelli associati.

Per quanto riguarda l’efficienza di traduzione e quindi intesa come la quantità di proteina tradotta nell’unità

di tempo, sia nei Procarioti che negli Eucarioti si assiste alla formazione di complessi che prendono il nome di

poliribosomi che rendono conto del fatto che un mRNA viene contemporaneamente tradotto da più ribosomi

. Non appena il primo ribosoma ha percorso l’mRNA di un ottantina di nucleotidi, ecco che può arrivare un

secondo ribosoma a formare questi complessi citoplasmatici che aumentano l’efficienza della sintesi proteica.

Ovviamente per quanto i ribosomi eucariotici e procariotici si comportino allo stesso modo, ci sono una serie

di differenze da considerare : nei procarioti, non avendo l’involucro nucleare, la trascrizione avviene

pressoché contemporaneamente alla traduzione oltre che nello stesso distretto: la regione nucleoide. Si può

dire di fatto che la trascrizione di un gene da parte dell’RNA polimerasi non è ancora terminata, che questo

mRNA comincia ad essere tradotto da parte di un ribosoma; questo non può avvenire negli eucarioti dove il

DNA è racchiuso all’interno di un nucleo e successivamente alla trascrizione gli mRNA devono andare incontro

a tutta una serie di modificazione post-trascrizionali prima di essere tradotti.

È importante porre l’attenzione sul controllo traduzionale ovvero i meccanismi che la cellula attua per

regolare la quantità di proteina tradotta; questi meccanismi avvengono nella fase di inizio.

Caratteristiche dell’mRNA eucariotico maturo

Lo splicing consiste nella rimozione delle sequenze introniche: quando si parla di traduzione ovviamente si

parla di un mRNA maturo che ha già subito la rimozione intronica.

Abbiamo una sequenza codificante compresa tra il codone di inizio AUG e il codone di terminazione(uno dei

tre); dobbiamo tenere presente che questo mRNA maturo presenta all’estremità 5’ un cappuccio e

all’estremità 3’ una coda poliadenilata lunga fino a 200 adenine che ha un ruolo importante nel conferire

stabilità a questa molecola.

L’mRNA è infatti l’RNA più instabile rispetto al trasfer e al ribosomiale, quindi questo messaggero che se ne va

dal nucleo al citoplasma rischia di subire l’attacco di una serie di esonucleasi che tendono a degradarlo

pertanto la coda poli-a è da vedere come una protezione dell’estremità da parte di un attacco esonucleasico:

infatti è proprio la lunghezza di questa coda a rendere più o meno stabile questo mRNA. Quando la coda

diventa troppo corta funge da segnale perché quell’mRNA venga degradato e quindi non più tradotto.

In generale nella maggior parte degli mRNA la traduzione inizia dal primo codone AUG a partire dall’estremità

5’; questo AUG in genere è il primo che il ribosoma incontra durante la sua scansione a partire dall’estremità

5’ e si lega grazie al cappuccio. Nel 90% dei casi il codone di inizio rappresenta il primo AUG incontrato, ma ci

sono dei casi in cui i nucleotidi che circondano questo AUG influenzano il riconoscimento di quello che sarà o

meno il codone di inizio. Identificare un codone di inizio è importante perché questo imposterà quella che si

chiama la cornice di lettura visto che il ribosoma leggerà lo stampo procedendo una tripletta alla volta senza

saltare nucleotidi e senza sovrapposizioni.

Sono state identificate delle sequenze conservate di quelli che devono essere i nucleotidi intorno all’AUG di

inizio che possono influenzare questo riconoscimento. Cosa può accadere? Può accadere che, proprio per la

presenza di questi nucleotidi, il ribosoma nella sua scansione incontri un primo AUG ma non lo riconosca

come codone di inizio e lo salti e va ad iniziare la traduzione all’AUG successivo. Questo è un meccanismo

detto della leaky scanning ovvero “scansione che perde” e serve per generare dallo stesso mRNA maturo

proteine che differiscono leggermente per l’estremità aminoterminale.

Quindi ricapitolando, l’mRNA maturo presenta:

-una sequenza codificante compresa tra il codone di inizio AUG e il codone di terminazione; ovviamente la

lunghezza di questa sequenza può variare (da poche centinaia a migliaia di nucleotidi)

- a monte del codone di inizio e a valle del codone di terminazione quindi rispettivamente comprese tra il

codone di inizio e il cappuccio al 5’ e tra il codone di terminazione e la coda poli-a al 3’ esistono dei segmenti

di mRNA che non vengono tradotti e che prendono il nome di segmento all’estremità 5’ non tradotto o

5’UTR(regione non tradotta) e di segmento non tradotto all’estremità 3’ o 3’UTR. Queste due regioni non

tradotte, che possono essere lunghe da decine a centinaia di nucleotidi, sono importanti perché è qui che

risiede tutta una serie di informazioni che verranno lette da certe proteine, certi fattori ed è qui che la

maggior parte delle regolazioni traduzionali ha luogo!

-il cappuccio chimicamente è una guanosina metilata (può essere metilata sia la base che il ribosio) attaccata

non con il tipico legame fosfodiesteo 5’3’ ma è attaccata attraverso un ponte trifosfato testa-testa ovvero

5’5’. Ciò vuole dire che dopo l’aggiunta del cappuccio all’estremità 5’ non sporgerà più il gruppo fostato

(come invece accade normalmente per una catena polinucleotidica).

Il cappuccio ci interessa molto perché oltre ad essere una protezione, è cruciale nella fase di inizio della

traduzione perché è il cappuccio ad essere riconosciuto da fattori proteici di inizio che permettono il

reclutamento da parte della sub unità minore ribosomiale del messaggero.

Tra l’altro questi messaggeri che quindi hanno il cappuccio 7metil-guanosinico al 5’ e la coda poly-a al 3’, dal

punto di vista funzionale è noto che quando funzionano da stampo per una proteina di fatto sono delle

molecole circolari perché la coda poly-a grazie a delle proteine di connessione che legano la coda e che a

loro volta si legano al cappuccio rendono tale struttura circolare e non più lineare.

Ma perché diventa circolare? Forse perché il ribosoma inizia a tradurre il messaggio a partire dall’estremità

5’, in questo modo se ha a disposizione una molecola circolare ha già la sicurezza che l’mRNA non è degradato

perché ha un inizio ma ha sicuramente anche una fine visto che è circolare. Ma forse la circolarità della

molecola ha anche a che vedere con la efficienza della traduzione: quando le due subunità del ribosoma si

assemblano con la formazione del complesso di inizio e cominciano a tradurre codone dopo codone

arrivando in fondo al codone di terminazione, a questo punto le due sub unità si separano; ma qualora sia

ancora necessario tradurre questo mRNA dal punto di vista spaziale sono già vicine al cappuccio pronte per

cominciare una nuova traduzione di quel messaggio. Quindi questo è da interpretare come una strategia che

aumenta l’efficienza dell’inizio della traduzione qualora il messaggero debba essere tradotto più volte.

Nell’immagine sono evidenziate in verde delle proteine che legano la coda poly-a, ci sono delle proteine a

forma di L che legnoa le proteine che legano la coda di poly-a con altri fattori di inizio che riconoscono invece

il cappuccio

Quindi in definitiva ci sono delle proteine che legano in modo specifico il cappuccio e proteine che legano in

modo specifico la coda, ancora proteine di connessione che rendono circolare l’mRNA.

Fase di inizio

Essa è importante sotto vari aspetti: sia perché in questa fase viene assemblato il complesso che permetterà

l’inizio di questi processi sia perché è qui che la maggior parte dei meccanismi di regolazione ha luogo.

Identificare il codone di inizio AUG permetterà di impostare la cornice di lettura della traduzione.

Le proteine(già viste prima) che rendono circolare l’mRNA si chiamano eiF4G, eiF4E. Parlando di meccanismi

di regolazione della sintesi proteica un ruolo cruciale è svolto da fattori proteici di inizio e nel caso degli

eucarioti vengono identificati come e(eucariotico)IF(fattori di inizio).

Il numero dei fattori di inizio tra procarioti ed eucarioti la dice lunga sui meccanismi di controllo: quelli

procariotici sono solo tre, mentre quelli eucariotici che intervengono solo per l’assemblaggio del complesso di

inizio 80S sono più di dieci. Ciò ovviamente rende conto della maggiore complessità degli Eucarioti ma offre

anche tante più possibilità di regolazione soprattutto a livello dell’inizio; infatti nella fase di allungamento ci

sono tre fattori che si chiamano EF (elongation factor) sia per gli eucarioti che per i procarioti.

Quindi praticamente le due subunità all’inizio della sintesi proteica sono separate: entreranno in gioco dei

fattori di inizio che legano la subunità minore e la tengono separata dalla maggiore. Quest’ultima si

aggiungerà solo alla fine mentre la subunità minore prende contatto prima con il tRNA carico(iniziatore), poi

con il cappuccio al 5’ del messaggero.

Da ricordare che l’aminoacido legato al tRNA si dice attivato, mentre il tRNA si dice carico!

Il tRNA iniziatore è un metionil-tRNA perché porta la metionina; esso per posizionarsi correttamente sulla sub

unità minore ribosomiale forma precedentemente un complesso ternario con un GTP e un fattore di inizio

che è eIF2(ricordarsi bene il ruolo di questo fattore di inizio). Il GTP verrà idrolizzato solo successivamente,

solo dopo che anche l’mRNA con il suo cappuccio sarà entrato a far parte di questo complesso.

eIF2 fa sì che il tRNA prenda contatto con la sub unità minore del ribosoma!

Quando arriva il messaggero con il suo cappuccio, interviene un altro fattore di inizio, eIF4E che riconosce il

cappuccio 7metil-guanosinico e permette all’mRNA di essere reclutato a livello della subunità minore

ribosomiale.

“Ricorda il fattore eIF4G che faceva da collegamento tra le proteine che legano la coda poly-a e il fattore che

lega il cappuccio quindi è anche prevista l’entrata in gioco di eIF4G che si lega a eIF4E a sua volta legato al

cappuccio”. C’è anche un altro fattore di inizio che entra in gioco e che è eIF4A che è un’ elicasi quindi rompe i

legami a idrogeno con una modalità ATPdipendente(quindi si accoppia l’idrolisi di energia con l’azione

elicasica di questi enzimi). Ma perché? Che legami a H devono essere rotti? Abbiamo detto che la subunità

minore inizia la sua scansione a partire dal cappuccio fino al primo AUG; ma nella regione non tradotta che

può essere anche centinaia di nucleotidi, si possono formare una serie di forcine perché regioni

complementari all’interno di questo segmento si appaiano mediante legami a H. Quindi affinchè la subunità

minore possa fare efficacemente la sua scansione per arrivare al codone AUG di inizio è chiaro che deve

essere necessario l’ intervento di un’elicasi che rompa queste strutture secondarie che rappresentano degli

ingombri sterici alla progressione della subunità minore del ribosoma.

In sintesi eIF4E ha legato il cappuccio, eIF4G ha legato il cappuccio e ha permesso la formazione di una

molecola di mRNA circolare, l’elicasi ha svolto quelle strutture secondarie del 5’ UTR permettendo la

scansione della subunità minore dal cappuccio fino a posizionarsi correttamente a livello dell’AUG quindi il

primo codone si trova adesso sulla sub unità minore ribosomiale in quello che diventerà il sito P, peptidilico,

quando anche la sub unità maggiore sarà arrivata. Prima che la subunità maggiore possa legarsi è necessaria

l’idrolisi del GTP del complesso ternario e quando la subunità maggiore si posiziona la fase di inizio termina.

Fase di allungamento

Questa fase si ripeterà tante volte fino ad arrivare al codone di terminazione: il sito A è libero, arriva un

secondo aminoacil tRNA il cui anticodone è complementare al codone successivo all’AUG di inizio esposto sul

sito A del ribosoma. Perché questo secondo aminoacil tRNA possa correttamente posizionarsi è necessario il

fattore di allungamento eF1 che lega l’aminoacil tRNA in modo che esso si posizioni sul sito A. In questo modo

la metionina del sito P e il secondo amminoacido adesso sono vicini alla stessa altezza (anche se i tRNA

possono avere un numero di nucleotidi che varia da 70 a 90, l’altezza rimane uguale perché la differenza di

nucleotidi si va a localizzare lungo l’ansa della classica struttura a trifoglio in modo tale che la distanza tra gli

aminoacidi rimane costante per tutti i diversi tRNA).

La peptidil transferasi, il ribozima ribosomiale della subunità maggiore catalizza la formazione del legame

peptidico: questa è l’unica fase della sintesi proteica che non richiede idrolisi di GTP o ATP perché la

metionina di fatto legata covalentemente al braccio accettore del proprio tRNA viene staccata dal momento

che questo legame covalente era stato catalizzato dall’aminoaciltRNA sintetasi in quelle reazioni di attivazioni

aminoacidica tanto costose per la cellula; dunque questo legame viene rotto e l’idrolisi di questo legame tra la

metionina e il proprio tRNA fornisce energia perché il legame peptidico tra la metionina e il secondo

aminoacido qualunque esso sia, possa essere catalizzato dalla peptidil transferasi.

Il tRNA nel sito P è scarico, mentre il secondo tRNA nel sito A è ora dipeptidil tRNA.

Adesso deve entrare in gioco un secondo fattore di allungamento che lega il GTP per permettere la

traslocazione del ribosoma, cioè questo macchinario si deve spostare della lunghezza pari a un codone verso

l’estremità 3’ di modo che il nostro dipeptidil tRNA che era presente sul sito A conseguentemente a questa

traslocazione si troverà nel sito P, il tRNA scarico che era nel sito P attraverso il sito E di uscita se ne va e il sito

A sarà ora libero esponendo il terzo codone rispetto all’AUG di inizio pronto per dar vita ad un nuovo ciclo di

allungamento e questo si ripete finchè nel sito A non verrà esposto uno dei tre codoni di terminazione.

I fattori di allungamento sia nei Procarioti che negli

Eucarioti sono tre: EF1 e EF2 funzionano grazie

all’idrolisi del GTP, mentre alla fine è necessario un

fattore che sostituisca il GDP con il GTP

permettendo a EF1 alfa di funzionare nuovamente

ed ecco che questo fattore è EF1beta gamma.

Parlando di accuratezza della traduzione è interessante prendere in considerazione il fattore EF1(quello che

forma il complesso ternario con il GTP e il tRNA) perché è grazie a questo fattore di allungamento che la

sintesi proteica è ancora più accurata. Questo fattore lega l’aminoaciltRNA, con un meccanismo che ancora

non è stato capito nei dettagli ma sta di fatto che quando lega l’aminoaciltRNA è come se controllasse se

quest’ultima ha lavorato bene cioè se ha formato il giusto complesso aminoacido tRNA.

Questo fattore di allungamento è anche coinvolto nell’aumentare l’accuratezza della traduzione verificando

che il giusto tRNA con il giusto anticodone si leghi al codone presente nel sito A del ribosoma. Come fa a

controllare? Questo controllo è basato sempre sull’RNA ribosomiale e questo è l’ulteriore conferma di quali

strutture sofisticate possono assumere gli RNA garantendo queste forme altrettanto sofisticate di controllo.

L’rRNA a livello del sito A avvolge codone e anticodone.

Questo avvolgimento da parte del ribosoma è in grado di discriminare se l’appaiamento codone-aticodone è

quello giusto secondo le regole del codice genetico. Se l’appaiamento non è giusto succede che dopo l’idrolisi

del GTP (che serve per posizionare il tRNA nel sito A quindi si è già ha consumato energia per posizionarlo) ma

prima che avvenga la formazione del legame peptidico c’è una sorta di ritardo che permette, qualora il tRNA

sia quello sbagliato, di essere allontanato, di staccarsi.

Questo meccanismo è un meccanismo costoso perché si è usata energia però poi il ribosoma è così sofisticato

che riesce a riconoscere se l’anticodone è quello giusto e dà tempo prima che la peptidil transferasi

intervenga a questo tRNA di allontanarsi se non è quello giusto.

Fase di terminazione

Quando uno dei tre codoni di terminazione è presente nel sito A ecco che non esiste alcun tRNA il cui

anticodone è complementare a questi codoni di stop per cui intervengono altri fattori proteici che sono i

fattori di rilascio. Essi sono degli esempi di mimetismo molecolare cioè la loro struttura assomiglia molto a un

tRNA. Questa somiglianza permette ai fattori di rilascio di infilarsi nel sito A dove normalmente si posizionano

i tRNA e forzano la peptidil transferasi ad aggiungere una moleocola di acqua invece che un aminoacido e

quindi permettono il rilascio della catena polipeptidica.

L’elevata accuratezza della sintesi proteica (1 errore su 10000 aminoacidi incorporati) richiede

una velocità di sintesi totale pari a 20 aminoacidi al secondo nei batteri.

Esistono dei mutanti batterici in cui la sintesi proteica presenta un’accuratezza maggiore

ma è così lenta che quei batteri non riescono a sopravvivere:

COMPROMESSO FRA LA VELOCITA’ E L’ACCURATEZZA DELLA TRADUZIONE

Il processo di sintesi proteica richiede una grande quantità di energia.

Ciascuna tappa del processo di allungamento richiede l’idrolisi di due molecole di GTP.

La formazione del legame peptidico è sostenuta dalla concomitante idrolisi del legame

fra la catena polipeptidica in formazione e il tRNA. Tale legame estereo si era formato

durante le reazioni di attivazione dell’aminoacido ed era costato l’idrolisi di ATP a AMP+2Pi.

Energia extra viene consumata ogni volta che il legame non corretto di un aminoacido

viene idrolizzato dalla aminoacil-tRNA sintetasi e ogni volta che un tRNA non corretto

entra nel ribosoma nel sito A, scatena l’idrolisi di GTP e poi viene rilasciato.

Per essere efficaci questi meccanismi di correzione devono anche rimuovere una frazione

apprezzabile di interazioni corrette e per questo richiedono maggiore energia

di quanto possa sembrare.

Quindi in sintesi per ogni aminoacido aggiunto:

-per attivarlo sono stati idrolizzati due gruppi fostato nella fase di attivazione da parte dell’aminoaciltRNA

sintetasi

-per ogni ciclo di allungamento vengono idrolizzate due molecole di GTP

-energia extra viene poi utilizzata ogni volta che a livello del sito A si inserisce un aminoacil tRNA sbagliato

perché abbiamo visto che il suo allontanamento avviene dopo l’idrolisi del GTP

E ancora durante la fase di attivazione aminoacidica la stessa aminoaciltRNA sintetasi qualora si accorgesse di

aver formato un complesso tRNA aminoacido sbagliato è dotata di attività di proof reading ,di correzione di

bozze quindi può rismontare questo complesso e ricominciare da capo.

Questi meccanismi di correzione per essere efficaci devono anche essere pedanti nel senso che devono

rimuovere una frazione apprezzabile di interazioni corrette per garantire che il processo sia il più accurato

possibile.

Come le cellule possono regolare la traduzione? La maggior parte di questi meccanismi ha luogo nella fase di

inizio, rarissimi nella fase di allungamento e non esistono nella fase di terminazione.

In linea generale possiamo dire che esistono due strategie di controllo:

-meccanismi che vanno sotto il nome di controllo globale della sintesi proteica (avvengono se mancano gli

aminoacidi o mancano i nutrienti o se c’è un’infezione virale in corso o se la cellula entra in G0). In questi casi

c’è una diminuzione globale della velocità della sintesi proteica che coinvolge tanti mRNA diversi

- ci sono altri controlli specifici per un determinato mRNA. In questi meccanismi di controllo specifico entrano

in gioco quelle caratteristiche che sono racchiuse in quelle porzioni non tradotte del messaggero sia al 5’ che

al 3’.

Sicuramente quando i messaggeri maturi escono dal nucleo e vanno nel citoplasma dove poi dovranno essere

tradotti, le cellule sono in grado di dirigere controllando le caratteristiche soprattutto del primo UTR quindi

della regione non tradotta al 3’ dei messaggeri: quindi gli mRNA non vanno nel citoplasma in maniera casuale

ma c’è una precisa organizzazione della loro localizzazione. Questo permette di stabilire nel citosol delle

asimmetrie. Nello sviluppo abbiamo già parlato di determinanti cellulari: il fatto che un mRNA venga

accumulato in una particolare zona, lontano dal nucleo, vicino alla membrana plasmatica e vicino ai

mitocondri permette di garantire delle asimmetrie nel citosol che potranno regolare la concentrazione di una

proteina all’interno della cellula semplicemente controllandone la traduzione. Quindi l’accumulo di una

proteina in una determinata regione della cellula è dovuto essenzialmente alla localizzazione dell’mRNA al

momento della traduzione: ad esempio nei fibroblasti si mammifero l’mRNA che codifica l’actina viene

accumulato sotto la membrana plasmatica vicino la corteccia perché in questo punto serviranno i filamenti di

actina grazie al riconoscimento di un particolare segnale che si trova nella regione non tradotta al 3’.

Questo meccanismo che localizza mRNA da tradurre in una particolare zona della cellula diventa importante

in cellule molto grandi: pensate al neurone! Per la funzionalità sinaptica certi mRNA vengono accumulati

vicino la sinapsi, molto lontana dal nucleo e questa traduzione permette un controllo dell’espressione genica

indipendente dalla trascrizione nucleare che supporta la funzionalità della sinapsi.

18 aprile

Rendendo la cromatina eucromatina invece che eterocromatina le cellule, con diversi meccanismi, possono

regolare l'espressione genica a livello del genoma.

Possiamo distinguere due meccanismi di controllo della traduzione:

1. meccanismo globale, ossia un meccanismo molecolare di controllo della traduzione che riguarda la

maggior parte degli mRNA che una cellula traduce;

2. controllo più specifico che controlla la regolazione della sintesi proteica di un particolare specifico

messaggero.

In linea generale possiamo dire che questi meccanismi di controllo sono dei meccanismi molecolari di

controllo di tipo negativo, inibitorio: un mRNA maturo è come se venisse tradotto, quindi normalmente la

cellula traduce i suoi messaggeri e ci sono dei meccanismi di regolazione che eventualmente inibiscono o

bloccano questa traduzione.

Questo non vuol dire che tutti i messaggeri, usciti dal nucleo della cellula, maturi, pronti per essere tradotti,

vengano effettivamente tradotti, anche perchè considerando tutti quei fattori di inizio molto più abbondanti in

numero che nei procarioti (dove sono 3, mentre negli eucarioti sono 15-20) in generale sono un po' i fattori

….... Quindi questo previene la possibilità di poter tradurre tutti gli mRNA presenti in una cellula, ammesso

che questo possa essere ottenuto.

Preso in considerazione quelle che sono le caratteristiche strutturali di un messaggero, queste sono cruciali

per questi meccanismi di regolazione.

Abbiamo già parlato del cappuccio 7 metil guanosinico all'estremità 5', la coda poliadenilica all'estremità 3'

aggiunta da un'enzima che è la Poly A polimerasi: queste sono modificazioni post-trascrizionali, quindi il

messaggero subisce queste modificazioni nel nucleo prima di poter uscire dal nucleo e dividersi nel

citoplasma.

Ma abbiamo detto che sono cruciali delle sequenze che non verranno tradotte, per questo verranno chiamate

regioni non tradotte, sia al 5' che al 3'.

Quindi, di fatto, la UTR al 5', ossia la regione non tradotta al 5', è compresa tra il cappuccio 7 metil guanosinico

e il codone di inizio AUG. Questa in giallo è la sequenza codificante, quello che verrà dopo compresa tra l'AUG

di inizio e il codone di terminazione.

Tra il cappuccio e il codone AUG di inizio vi è questo segmento che ha una funzione importante regolatoria e

come vedete qui sono indicati degli elementi di struttura secondaria, quindi di fatto questo filamento

polinucleotidico di RNA in queste regioni si ripiega, mediante la formazione di legami idrogeno tra basi

complementari, a formare degli elementi di struttura secondaria (Hairpin, forcina). Questo momento è

cruciale in questi meccanismi di controllo, perchè queste strutture verranno riconosciute da proteine che si

legheranno ad esse che possono essere presenti sia al 5' ma anche al 3' che non sono indicate nella regione

non tradotta al 3' e permetteranno o meno la regolazione del processo traduzionale.

Quindi dobbiamo aver ben presente, per comprendere questi meccanismi di controllo molecolare della

traduzione, queste caratteristiche strutturali del messaggero eucariotico; non solo il cappuccio e la coda, ma

anche queste strutture secondarie che possono essere presenti sia nella regione non tradotta nel 5' che nella

regione non tradotta al 3'.

Indicato con il rettangolo giallo possono anche esserci dei moduli di lettura a monte rispetto alla sequenza

codificante, indicati come uORF (dove u sta per upstream, in inglese significa “a monte”, cioè si trova prima

della sequenza codificante) e hanno una funzione regolatoria quindi funzionano intrappolando il ribosoma e

diminuendo di fatto l'efficacia con la quale la sequenza codificante viene tradotta.

È un esempio di come questi moduli di lettura a monte, non solo uno ma ce ne possono essere più di uno a

monte della sequenza codificante, possono essere degli elementi regolatori della traduzione di quel

messaggero.

Questo concetto, cioè una proteina che si lega a una regione ripiegata del messaggero e in questo modo

regola la traduzione, è presente nei procarioti. Non ne abbiamo parlato, ma sappiamo che il messaggero

procariotico non ha un cappuccio, quindi è evidente che altri devono essere i meccanismi con i quali quel

messaggero procariotico, che non ha cappuccio, viene reclutato dalla subunità minore durante la fase di inizio

della traduzione.

Inoltre i messaggeri procariotici, a monte del codone di inizio AUG, contengono una sequenza, la famosa

sequenza di SHINE E DALGARNO, che è una sequenza di pochi nucleotidi, complementare all'RNA ribosomiale

16S, quindi la subunità minore.

È proprio questa complementarietà, la sequenza di Shine e Dalgarno nel messaggero e l'RNA ribosomiale 16S

nella subunità minore ribosomiale, che di fatto permette il corretto posizionamento del messaggero, quindi

del riconoscimento a livello del complesso di inizio.

Anche nei procarioti il mascheramento da parte di una proteina che è un repressore della traduzione di quel

messaggero, della sequenza di Shine e Dalgarno, quindi proteine che si legano in corrispondenza di quella

sequenza, a monte del codone di inizio AUG, maschera la sequenza di Shine e Dalgarno e impediscono che

quella sequenza possa appaiarsi con la sua sequenza complementare nella subunità dell'RNA ribosomiale 16S.

Questo è un modo che i procarioti utilizzano per regolare la traduzione dei loro messaggeri.

Senza scendere nei dettagli del mondo procariotico, questo concetto, ossia che esistono delle proteine che si

legano a questi elementi di struttura secondaria dell'RNA nel messaggero, è ampiamente ripreso negli

eucarioti, dove oggi vedremo tanti esempi di questi meccanismi di regolazione.

Parliamo di questo controllo globale della sintesi proteica.

Di fatto le cellule procariotiche in risposta a varie situazioni, in genere di stress, mancanza di nutrienti,

aumento improvviso della temperatura, diminuiscono globalmente la velocità della sintesi proteica. Questa

riduzione sostanziale della velocità di sintesi proteica riguarda non uno specifico mRNA ma la maggior parte

dei messaggeri che quella cellula sta traducendo.

Questo meccanismo globale di riduzione della velocità della sintesi proteica deriva dalla fosforilazione di quel

fattore di inizio, di cui abbiamo già parlato, che è EIF-2.

EIF-2 era quel fattore di inizio che formava un complesso ternario con il metionil t-RNA iniziatore e il GTP,

quindi di fatto EIF-2 è il fattore di inizio che lega il metionil tRNA, cioè il primo tRNA carico dell'amminoacido

metionina (il codone di inizio AUG codifica per l'amminoacido metionina), e lo aiuta a posizionarsi

correttamente a livello del sito attivo della subunità minore ribosomiale nella fase di inizio.

Abbiamo parlato di ciclo cellulare, ci ricordiamo della fase G0; questo meccanismo molecolare che porta alla

fosforilazione di EIF-2 e quindi riduce globalmente la sintesi proteica, nelle cellule di mammifero è

particolarmente importante per l'entrata delle cellule in G0.

E' chiaro che certi mRNA dovranno comunque essere prodotti, ma riferendoci globalmente alla maggior pare

degli mRNA di una cellula, in G0 essa traduce un quinto degli mRNA che invece traduce in ciclo.

Vediamo cosa provoca questa fosforilazione del fattore di inizio EIF-2.

EIF-2 è il fattore proteico costituito da 3 subunità:

1. subunità alfa

2. subunità beta

3. subunità gamma

Il complesso ternario è formato da EIF-2, metionil tRNA iniziatore e GTP. Questo GTP, poco prima che la

subunità maggiore del ribosoma si unisca a questo complesso di pre inizio, viene idrolizzato.

Quindi è chiaro che per rendere nuovamente attivo EIF-2 che

ha legato il GDP, è necessario un altro fattore che si chiama EIF-

2B che di fatto funziona da scambiatore nucleotidico, quindi

cambia il GDP con il GTP, nuovamente riportando nella sua

forma attiva il fattore di inizio EIF-2.

Nella fase di inizio, dopo che il metionil tRNA si è posizionato

sulla subunità minore del ribosoma, dopo che è arrivato il

messaggero con il suo cappuccio, deve arrivare la subunità

maggiore. Prima che questa possa arrivare, un altro fattore EIF-

5 idrolizza il GTP, che era legato a EIF-2. La maggior parte dei fattori di inizio si staccano e la subunità maggiore

prende parte a questo complesso. Si forma il complesso di inizio, quindi termina la fase di inizio, e si passa alla

fase di allungamento.

Conseguentemente a questa idrolisi del GTP a GDP e fosfato, il nostro EIF-2 legato al GDP è inattivo. Quindi,

affinchè questo possa essere utilizzato nuovamente per un'altra fase di inizio, è necessario che il fattore EIF-2B

sostituisca questo GDP con GTP, quindi EIF-2B è il fattore di inizio che funziona da scambiatore nucleotidico,

GDP con GTP, e riporta EIF-2 nella sua forma attiva.

Se si parla di fosforilazione verranno attivate delle chinasi, quindi in situazioni specifiche vengono attivate

delle chinasi che come besaglio hanno proprio EIF-2, in particolare è il residuo di Ser 51 della subunità alfa ad

essere fosforilato da queste chinasi.

Cosa succede quando EIF-2 è fosforilato a livello del residuo di Ser 51? in questa forma, quando si lega a EIF-

2B, che deve scambiare il GDP con il GTP, quindi portare EIF-2 nella sua forma attiva, di fatto questo EIF-2B

rimane come sequestrato in questo complesso, perchè quando EIF-2 è fosforilato la costante di dissociazione

di EIF-2B cambia e non si stacca più.

Poiché EIF-2B è in concentrazione limitata rispetto a EIF-2, con questo giochino, conseguentemente alla

fosforilazione di EIF-2, tutto EIF-2B rimane intrappolato nel complesso di EIF-2 e non si ha più la rigenerazione

della forma attiva GTP legata di EIF-2 e la fase di inizio della traduzione non può procedere.

Quindi questo è un meccanismo globale che giocando sulla fosforilazione di questo fattore di inizio EIF-2,

blocca la traduzione della maggior parte degli mRNA, proprio perchè non si possono più generare complessi

ternari attivi, perchè non abbiamp più disponibile EIF-2 GTP legato attivo.

Chi è che fosforila EIF-2?

Questa riduzione globale della sintesi proteica si ha in risposta a varie situazioni, un aumento improvviso di

temperatura, la mancanza di nutrienti, si parla di STARVAZIONE, dall'inglese TO STARV (essere affamati).

Le cellule in colture si privano di nutrienti, per avere una risposta maggiore una volta aggiunto il nostro ….......

; questa privazione di nutrienti, la mancanza di fattori di crescita, un aumento improvviso di temperatura,

infezioni virali, portano a una risposta di tipo inibitorio nella cellula che riduce sensibilmente la velocità della

sintesi proteica andando a fosforilare il fattore EIF-2 e con il meccanismo che abbiamo appena visto ridurre la

sintesi proteica.

Queste chinasi che vengono attivate sono:

• PKR è una chinasi che viene attivata da RNA a doppio filamento, che non è certo tipico delle cellule

eucariotiche, quindi la sua presenza mette in guardia la cellula da una presunta infezione virale.

Quindi questa chinasi viene attivata da un infezione virale ed è proprio una risposta a questa infezione

ed ha come substrato il fattore di inizio EIF-2

• GCN-2 è una chinasi di lievito che viene attivata qualora la cellula si trovi in assenza o viva una

sostanziale sottrazione di nutrienti.

• HRI è una chinasi attivata da una mancanza di ferro

• PERK è una chinasi che viene attivata conseguentemente a uno stress del reticolo endoplasmatico

Comunque, in particolari condizioni, di virus, di mancanza di nutrienti o di crescita, di aumenti improvvisi della

temperatura, le cellule reagiscono con una riduzione sostanziale della velocità di sintesi proteica.

Questo meccanismo non è l'unico che porta ad un controllo globale della sintesi proteica, per esempio,

possiamo descrivere un altro meccanismo di controllo globale della traduzione che va a interferire con la

disponibilità di quel complesso di fattori proteici di inizio che si aggrega intorno al cappuccio 7 metionil

guanosinico del messaggero.

In alto si vede il complesso ternario: EIF-2 è legato al GTP e al metionil tRNA, il complesso ternario prende

contatto con la subunità 40 S (minore) ribosomiale e successivamente il fattore di inizio EIF-4E riconosce il

cappuccio 7 metil guanosinico del messaggero e grazie a questo riconoscimento, insieme all'azione portata

avanti dalla elicasi EIF-4A (elicasi ATPdipendente) che svolge le possibili strutture secondarie presenti al 5'

UTR.

In questo modo permette la scansione della subunità minore che si è legata all'estremità 5', ma deve

procedere verso l'estremità 3' per indentificare il codone di inizio AUG.

EIF-4E insieme a EIF-4A, ma insieme anche ad altri fattori di inizio, in particolare EIF-4G, fattore di inizio

chiamato in inglese “scuffled” , rende possibile la formazione di un complesso che concettualmente ci spiega

come la molecola di messaggeri con la sua estremità 5' e la sua estremità 3' alla fine , si comporti di fatto

come una molecola circolare in cui la coda poliadenilica interagisce funzionalmente con l'inizio, ossia con il

cappuccio al 5'.

Questo avviene grazie a questo fattore di inizio EIF-4G che permette la formazione di questo complesso

perchè da una parte lega le proteine, le PABP, che si legano alla coda di poly A e dall'altra si lega al fattore di

inizio EIF-4E che si lega al cappuccio.

Quindi questa proteina EIF-4G fa proprio da ponte fra la coda poliadenilica e le sue proteine associate e il

cappuccio riconosciuto da EIF-4E.

Questo complesso di fattori prende più generalmente il nome di EIF-4F.

Quello di cui stiamo per parlare è un meccanismo che va ad interferire con la possibilità di assemblare questo

complesso EIF-4F.

Quando abbiamo parlato di crescita, vi ho accennato ad una via importante di segnalazione, che è quella

mediata dalla fosfatidil inositolo chinasi, PKB, mTOR. Se ricordiamo bene alla fine di questa via di

segnalazione, per evocare l'effetto biologico di crescita cellulare vi era una profonda e sostanziale

stimolazione della sintesi dell'elica.

A questo proposito qui capiremo qualcosa di più.

La nostra mTOR, chinasi con un ruolo centrale in questa via di segnalazione, fosforila ed ha come bersaglio

delle proteine, che si chiamano 4E-BP. Queste proteine sarebbero 4E binding protein, quindi sono proteine

che si legano a EIF-4E.

EIF-4E, durante la fase di inizio, si deve legare a EIF-4G perchè questo complesso si formi, l'mRNA funzioni

come molecola circolare e così via.

Le proteine 4E-BP sono come dei competitori di EIF-4G, cioè competono per il legame con EIF-4E. Quindi se

sono legate 4E-BP non si può legare EIF-4G e viceversa.

mTOR porta alla fosforilazione di 4E-BP e questa fosforilazione porta a una forte stimolazione della sintesi

proteica.

Queste 4E-BP possono legarsi a EIF-4E SOLO se non sono fosforilate o lo sono poche. Quindi, quando la via di

mTOR è attiva, fosforila 4E-BP che sono legate a EIF-4E e quindi inibiscono la sintesi proteica perchè spiazzano

EIF-4G; successivamente a questa fosforilazione, se non possono più legarsi a EIF-4E lasciano il campo libero a

EIF-4G e quindi la formazione di questo complesso EIF-4F.

Quindi la fosforilazione mTOR dipendente delle proteine 4E-BP porta a una potente stimolazione della sintesi

proteica e questa via è stimolata dall'insulina e da fattori insulino-simili.

Questo è un altro meccanismo globale che porta alla via di crescita cellulare in quanto c'è una grossa spinta

alla sintesi delle proteine.

Un altro meccanismo globale è quello che da sempre interferisce a questo livello ed è un meccanismo globale

di riduzione della sintesi proteica che si ha durante la morte apoptotica.

Gli effettori finali della morte apoptotica sono le famose caspasi. È stato dimostrato che queste proteasi

cambiano, quindi esercitano un taglio proteolitico sia sul nostro EIF-4G che sulle PABP, in particolare la caspasi

30. Questo taglio proteolitico ovviamente fa venir meno la possibilità di formare questo complesso quindi

questo spiega perchè durante l'apoptosi si abbia una sostanziale riduzione della sintesi proteica.

È chiaro che ci devono essere dei meccanismi che permettono, durante la morte apoptotica, la traduzione di

mRNA che codificano per proteine cruciali per portare avanti questo programma di morte cellulare.

Vedremo che ci sono delle sequenze, IRES (internal ribosomal enter sites, ossia siti di ingresso interno dei

ribosomi), nella regione non tradotta al 5', che permettono l'inizio della traduzione in modo indipendente

dalla presenza del cappuccio.

Questo fa sì che, relativamente alla nostra situazione in cui le caspasi 3 hanno tagliato EIF-4G che quindi è

stato proteoliticamente degradato e non può legarsi a EIF-4E, la traduzione di mRNA che codificano per

proteine cruciali per la morte cellulare potrà in questa situazione di blocco globale della sintesi proteica

procedere, perchè quegli mRNA probabilmente sono svincolati da un inizio cappuccio-dipendente, proprio

perchè dotati di queste sequenze al 5' UTR che permettono al complesso di inizio di formarsi con una modalità

indipendente da EIF-4E e dal cappuccio.

Quindi questi sono alcuni degli esempi con i quali si può spiegare il meccanismo molecolare globale di

controllo della sintesi degli mRNA.

Considerando le caratteristiche strutturali del messaggero, vediamo come siano stati identificati meccanismi

che spiegano come la cellula riesca a regolare la traduzione di un messaggero specifico e non di altri.

Il primo che trattiamo è un controllo della traduzione specifico di un mRNA specifico.

L'esempio che faremo è il messaggero che codifica per la proteina ferritina, una proteina che accumula ferro

dentro la cellula.

Le cellule possono in maniera specifica regolare la traduzione di questo messaggero in risposta alla

disponibilità di ferro.

La ferritina è una proteina che accumula ferro, quindi se il ferro è molto abbondante la cellula deve tradurre

molto e efficacemente quel messaggero che codifica per la proteina che accumula ferro; invece, se il ferro non

è presente, quindi la cellula non ha disponibile il ferro, è inutile che quell'mRNA venga tradotto.

Quindi ci deve essere un meccanismo specifico per quel messaggero che ne permette di regolare la

traduzione.

Qui entrano in gioco quegli elementi di struttura secondaria, in questo caso presenti all'estremità 5' della

regione non tradotta al 5', che, analogamente ai procarioti, avvengono anche negli eucarioti.

Queste sequenze che formano questi elementi di struttura secondaria che verranno riconosciuti da una

proteina, in questo caso prendono il nome di IRE (iron responsive element).

Quindi queste sequenze al 5' UTR nel messaggero della

ferritina si chiamano IRE, ossia elementi di risposta al ferro.

Queste sequenze formano la forcina, con l'appaiamento delle

basi complementari, che verrà riconosciuta da una proteina

che regolerà la traduzione di quel messaggero.

Questo meccanismo è di ingombro sterico: qualora questa

proteina si leghi a questa forcina, elemento di struttura

secondaria 5'UTR, impedirà alla nostra subunità minore

ribosomiale di effettuare la sua scansione dal 5' a cui essa si è

legata verso il codone di inizio.

Quindi la presenza di questa proteina legata su questa struttura

secondaria impedirà alla subunità minore ribosomiale che si è

legata all'estremità 5' di scorrere fino a identificare il codone di

inizio AUG e quindi in queste condizioni non sarà possibile la

traduzione di questo messaggero che codifica per la proteina

ferritina. Questo in condizioni di mancanza di ferro.

Invece quando il ferro diventa abbondante, c'è anche necessità della proteina ferritina, la quale permette

l'accumulo di ferro. La proteina riconosceva l'elemento di struttura secondaria al 5'UTR e conseguentemente

al legame con UTR e a una variazione conformazionale, non può più legarsi all'elemento di risposta al ferro,

alla forcina 5' UTR quindi non essendo più legata non rappresenta più un ingombro sterico alla subunità

ribosomiale durante la sua scansione e questo mRNA può essere efficacemente tradotto.

Questa proteina è l'isoforma citosolica dell'aconitasi che ha una funzione regolatoria in risposta alla

disponibilità o meno di ferro.

Con questo esempio abbiamo visto come un elemento di struttura secondaria al 5'UTR può permettere o

meno, con un semplice meccanismo di ingombro, la scansione da parte della subunità ribosomiale e l'inizio o

meno della traduzione.

Queste IRES sono sequenze che possono essere anche lunghe centinaia di nucleotidi che si ripiegano a

formare anch'esse delle strutture secondarie e quindi verranno riconosciute da dei fattori proteici. La

presenza di siti di ingresso interni ai ribosomi in un particolare mRNA rende possibile l'inizio della traduzione

con una modalità svincolata dal cappuccio 7 metil guanosinico e quindi dal fattore di inizio EIF-4E.

Nella diapositiva si ha sulla sinistra la situazione dove l'mRNA ha il suo cappuccio al 5' riconosciuto da EIF-4E,

EIF-4G, le binding protein e la coda poly A, la situazione che abbiamo finora descritto. I siti di ingresso interni

ai ribosomi, lunghi anche centinaia di nucleotidi, si ripiegano a formare delle strutture secondarie (in questo

complesso non c'è EIF-4E perchè gli mRNA possono essere efficacemente tradotti nel ribosoma eucariotico

anche senza cappuccio, quindi anche senza l'intervento di EF-4E). Quindi è possibile formare il complesso di

inizio anche senza cappuccio grazie a questi IS, ossia siti di ingresso nei ribosomi.

Tra l'altro i virus che codificano per mRNA privi di cappuccio usano proprio questa strategia per permettere di

impossessarsi dell'apparato biosintetico della cellula eucariotica e per permettere la traduzione dei loro

messaggeri privi di cappuccio ma dotati di questi siti IRES.

E' stato dimostrato che il genoma virale codifica per una proteasi che va a tagliare EIF-4G; lo taglia in modo

che il frammento terminale perde la capacità di legarsi a EIF-4E, quindi in questo modo viene bloccata la

traduzione degli mRNA della cellula che hanno cappuccio.

Ma EIF-4G tagliato rimane comunque in grado di legarsi alle sequenze IRES e quindi di permettere la

traduzione degli mRNA virali a scapito della traduzione degli mRNA della cellula che non vengono tradotti.

Tra i diversi tipi di RNA, i messaggeri sono tra i più stabili, quindi, parlando di emivita, hanno una durata più

breve rispetto agli rRNA o ai tRNA.

Parlando di procarioti, la emivita degli mRNA procariotici è davvero corta, in media sono delle molecole molto

instabili che vengono rapidamente degradate e hanno un emivita di pochi minuti.

Rispetto a questi mRNA quelli eucariotici sono un po' più instabili, dobbiamo fare infatti delle differenze: ci

sono degli mRNA che hanno un'emivita anche di diverse ore, ad esempio l'mRNA che codifica per la beta

actina, mentre ci sono altri mRNA, in particolare quelli che codificano per fattori di crescita o proteine che

hanno una funzione regolatoria, hanno un emivita molto breve, proprio perchè questo meccanismo, cioè il

controllo della degradazione dell'mRNA è di fatto un modo per controllare quanta proteina viene generata. In

generale, mRNA che codificano per proteine regolatrici hanno emivita molto più breve rispetto all'emivita

dell'mRNA che codifica per la beta actina, con emivita di diverse ore.

Cosa rende più o meno stabile un mRNA? La poly A è sicuramente una modificazione post-trascrizionale dei

messaggeri eucariotici e più lunga è, più l'mRNA è stabile. Questa coda poly adenilica lunga fino a 200 adenine

subisce un graduale accorciamento ad opera di esonucleasi, si arriva ad una lunghezza critica di 10-30

adenine. In queste condizioni, quelle proteine che riconoscono la coda di poly A si staccano e l'mRNA con

questa coda poly adenilica molto breve diventa improvvisamente instabile; quindi la cellula comincia a

degradare quei messaggeri.

Quindi la degradazione viene scatenata proprio dall'accorciamento fino a un livello critico della coda poly

adenilica a cui consegue poi il distacco delle proteine che legano la coda e a quel punto quell'mRNA diventa

molto instabile e viene rapidamente degradato.

Senza scendere nei dettagli, successivamente all'accorciamento della coda poliadenilica, cioè quando poi

l'mRNA diventa instabile, questo mRNA poi può essere sia accorciato dal 3' al 5', ma anche dal 5' al 3', ossia in

tutti e due i sensi. Prima che viene degradato dal 5' al 3' bisogna rimuovere il cappuccio.

Quando l'mRNA diventa instabile, perchè la coda poliadenilica è diventata molto corta, da entrambe le parti ci

sono le esonucleasi che degradano molto rapidamente la molecola. Degradare l'mRNA significa non produrre

più la proteina che esso codifica.

Detto questo, ci sono degli mRNA in cui la degradazione ha inizio non con questo meccanismo ma per

intervento di nucleasi, che non sono delle esonucleasi, cioè delle nucleasi che cominciano a rimuovere i

nucleotidi dall'esterno, ma sono in particolare endonucleasi, quindi enzimi che riconoscono particolari

sequenze di taglio localizzate a livello della regione non tradotta 3' UTR.

Normalmente è l'accorciamento della coda a un livello critico che poi scatena la degradazione irreversibile di

quel messaggero.

Ora facciamo un esempio specifico per un mRNA, dove nella regione non tradotta al 3' esiste un sito che viene

riconosciuto da un endonucleasi, quindi una nucleasi che taglia in un punto che è interno alla sequenza del

messaggero. Questo sito di taglio è all'interno di una struttura secondaria che verrà o meno riconosciuta da

una proteina, quindi, quando la proteina si lega a questa regione o struttura secondaria, il legame di questa

proteina maschera il sito di taglio. Quando invece questa proteina non è legata, il sito di taglio è esposto,

l'endonucleasi può tagliare e quindi quell'mRNA verrà degradato.

L'mRNA di cui facciamo l'esempio è l'mRNA che codifica per il recettore della trasferrina. Quindi la proteina

che riconosce questo elemento di struttura secondaria al 3' UTR è la proteina citosolica, la aconitasi, che con

un meccanismo diverso, si lega a degli elementi di struttura secondaria nelle UTR e regola la traduzione.

Questa volta il legame della proteina, differentemente da prima, rende l'mRNA stabile e quindi verrà tradotto.

Quindi, il legame dell'aconitasi citosolica a questo elemento di struttura secondaria al 3' UTR avviene in

condizioni di mancanza di ferro.

Quando c'è poco ferro, è tutto interesse della cellula di tradurre l'mRNA che codifica per il recettore della

trasferrina, al fine di esporre il maggior numero possibile di recettori sulla superficie cellulare nel tentativo di

captare il maggior numero di …... per “endocitare” la trasferrina responsabile del trasporto della ferro.

Quando invece il ferro è abbondante, meno recettori devono essere esposti sulla superficie quindi c'è un

controllo traduzionale mRNA specifico che porta ad un blocco della traduzione di questo mRNA che codifica

per il recettore della trasferrina, anzi non serve più, quindi questo mRNA non solo non verrà tradotto, ma

viene degradato. In presenza di ferro, la aconitasi citosolica non è più affine a questi elementi di struttura

secondaria, questa volta localizzati al 3' UTR.

Quindi la aconitasi non si lega, il sito di taglio da parte dell'endonucleasi è ora esposto, l'endonucleasi taglierà

l'mRNA che verrà rapidamente degradato.

Quando c'è ferro non viene sintetizzato il recettore per la trasferrina, quindi l'aggiunta di ferro fa proprio

diminuire la stabilità di questo mRNA che viene degradato rapidamente. Questo si traduce in una sostanziale

riduzione nella produzione di questo recettore.

Parlando di coda polyA, normalmente l'aggiunta da parte della poly A polimerasi della coda è una

modificazione post-trascrizionale nucleare. Quindi la poly adenilazione avviene nel nucleo e questo è tra i

meccanismi che rendono l'mRNA maturo pronto per essere trasportato nel citoplasma. Talvolta l'aggiunta

della coda di poly A avviene nel citoplasma e questa poly adenilazione citoplasmatica è un altro meccanismo

per regolare la traduzione dei propri messaggeri.

Ma parlando in termini generali la coda di poly A viene aggiunta nel nucleo.

Abbiamo visto che la coda di poly A viene poi legata da poly A binding protein, che nella fase di inizio queste

proteine grazie al fattore EIF-4G permettono la formazione del complesso EIF-4R, EIF-4F e la formazione di

una molecola di mRNA circolare.

La poliadenilazione può, per alcuni mRNA, essere regolata e quindi la coda può essere allungata per certi

mRNA a livello citoplasmatico. Quando a livello citoplasmatico la coda di poly A viene allungata, questo è il

meccanismo per permettere la traduzione di RNA messaggeri.

Abbiamo più volte parlato degli oociti, durante la loro fase di maturazione e abbiamo detto che durante la

maturazione, in attesa della fecondazione, queste cellule accumulano tutta una serie di riserve, sia di natura

proteica ma anche mRNA. Questi depositi di mRNA non vengono tradotti; verranno tradotti solo al momento

della fecondazione rendendo di fatto dotata quella cellula di tutta una serie di proteine importanti poi per lo

sviluppo.

Quindi nell'oocita in maturazione, tanti mRNA sono lì accumulati e non vengono tradotti. La coda poliadenilica

di questi messaggeri è molto corta, poche decine di adenine. È ovvio che ci devono essere dei meccanismi che

impediscono, differentemente a quanto visto prima, di scatenare immediatamente la degradazione. Quindi ci

sono dei meccanismi tipici di queste cellule che tengono questi mRNA con la coda corta.

Quando questa cellula verrà fecondata si assiste, nel citoplasma, ad un allungamento della coda.

Per questi mRNA, dopo la fecondazione, c'è proprio una poliadenilazione della coda che scatena la traduzione

di questi messaggeri.

Conseguentemente alla fecondazione, all'allungamento della coda, le poly A binding protein, le EIF-4G e così

via, possono permettere la formazione di un complesso EIF-4F che dà inizio alla traduzione.

È stato scoperto che quella corta coda poliadenilica di questi messaggeri che non vengono né degradati né

tradotti , ma semplicemente accumulati nel citoplasma degli oociti in maturazione, si lega a due proteine, in

particolare alla proteina CIED che si lega nella regione non tradotta al 3' di questi mRNA, che a sua volta si lega

alla proteina Maskin (non bisogna ricordare questi nomi).

Questa proteina Maskin si lega a EIF-4E e ad una proteina legata all'estremità 3' del messaggero.

Questa proteina si può vedere come una 4E binding protein specifica per questi messaggeri che si lega a EIF-

4E che a sua volta lega il cappuccio, spiazzando gli eIF-4G, quindi impedendo la formazione di questo

complesso. Ovviamente interagisce anche con una proteina che a sua volta si lega a degli elementi regolatori

al 3'UTR.

Questa situazione rende possibile il blocco della traduzione di questi messaggeri.

Quindi, analogamente al meccanismo globale di sintesi proteica che va a interferire con la formazione del

complesso eIF-4F, questo è un esempio di controllo di un mRNA specifico; grazie a proteine specifiche di

questi messaggeri va ad interferire con la formazione per questi messaggeri del complesso eIF-4F, quindi

intererisce con la fase di inizio della traduzione.

Nella situazione in cui eIF-2 è fosforilato, ci sarà un blocco globale della sintesi proteica.

Questo esempio tratta di un lievito, in cui le cellule non hanno nutrienti, quindi la chinasi GCN2 attivata in

condizioni di mancanza di nutrienti, si attiva, fosforila eIF2 e poi fa un blocco globale della traduzione della

maggior parte degli mRNA. In queste condizioni ci aspettiamo che la traduzione di tutti gli mRNA sia rallentata

drasticamente.

In queste condizioni di blocco globale della sintesi proteica, dovuto ad attivazione della chinasi attivata dalla

mancanza di nutrienti che fosforila eIF2, la fosforilazione di eIF2 porta alla traduzione selettiva di particolari

mRNA. La cellula deve disporre di meccanismi che in queste situazioni di blocco globale riescano in modo

selettivo a stimolare la traduzione di particolari mRNA.

In questo meccanismo entrano in gioco queste sequenze, questi moduli uORF di lettura aperti che si trovano a

monte della sequenza codificante. Possono essere più di uno, sono brevi, hanno un codone di inizio e uno di

terminazione e in generale hanno un ruolo regolatorio negativo. Questo ruolo regolatorio sta a significare che

diminuiscono l'efficenza di traduzione della sequenza codificante perchè intrappolano le subunità del

ribosoma.

Le nostre cellule di lievito sono state private di nutrienti, quindi questa è una situazione di stress che attiva la

china GCN2 che fosforila eIF2, quindi c'è il blocco globale della sintesi proteica.

In queste condizioni per mancanza di nutrienti queste cellule di lievito continuano e traducono in modo

specifico mRNA che codificano per proteine coinvolte nella sintesi di amminoacidi, quindi c'è si una risposta

che tende a bloccare globalmente la sintesi proteica, ma allo stesso tempo la cellula reagisce stimolando la

produzione di quegli enzimi che permettono la sintesi di amminoacidi. Questo fattore di trascrizione che

continua ad essere tradotto in condizioni di blocco globale della sintesi proteica si chiama GCN4.

La sequenza codificante è la seguente: cappuccio a 5' e nella regione non tradotta a 5' ci sono 4 moduli di

lettura aperti. Quindi consideriamo un meccanismo specifico di traduzione di un mRNA; nella regione non

tradotta a monte dell'AUG esistono delle sequenze regolatorie che sono questi moduli di lettura che sono 4,

ognuno con il proprio codone di inizio, di terminazione.

Di fatto, con quel meccanismo di cui abbiamo parlato, il complesso di inizio si assembla, si posiziona su questo

AUG e comincia la traduzione di questo breve modulo di lettura. Questa traduzione non porta alla sintesi di

una proteina rilevante, ma è una traduzione con significato regolatorio.

Prima si lega la subunità minore, arriva un metionil tRNA , poi la subunità maggiore, il complesso di inizio e il

primo modulo di lettura viene tradotto. Si ammette che successivamente alla traduzione di questo modulo,

mentre la subunità maggiore si stacca, quella minore rimane attaccata a questo mRNA e continua la sua

scansione.

La traduzione della quarta uORF subito prima della sequenza codificante (ecco il ruolo inibitorio), per una

particolare configurazione del messaggero subito successivo al codone di terminazione di questa quarta uORF,

porta ad un distacco delle subunità ribosomiali da questo mRNA.

La presenza di questi 4 moduli di lettura, a monte della sequenza codificante, porta a una diminuzione

dell'efficenza di traduzione della sequenza codificante.

Questo in condizioni di disponibilità di nutrienti, quando cioè non c'è alcun blocco della sintesi proteica.

Le cellule di lievito procedono normalmente con la loro traduzione globale dei messaggeri, non c'è mancanza

di nutrienti, la chinasi GCN2 non è attivata e così via.

Infatti nella diapositiva, in alto, si vedono tanti metionil tRNA iniziatori disponibili, quindi c'è effettivamente

una elevata probabilità che quando questa subunità minore ribosomiale rimane attaccata a questo

messaggero, arrivi un metionil tRNA, poi la subunità maggiore e quindi vengano tradotte queste sequenze.

La situazione cambia drasticamente in mancanza di nutrienti. La chinasi GCN2 viene attivata, eIF2 viene

fosforilato, eIF2B viene intrappolato, non c'è più rigenerazione di eIF2 GTP legato attivo, quindi sono pochi i

complessi ternari disponibili. In queste condizioni queste cellule attivano in modo specifico la traduzione di

questo messaggero che codifica per un fattore di trascrizione che permetterà l'espressione di enzimi coinvolti

nella sintesi di amminoacidi, ciò di cui queste cellule private di nutrienti hanno bisogno.

Il complesso di inizio traduce il primo modulo di lettura, analogamente a prima la subunità minore rimane

associata con il messaggero, ma adesso, poiché sono pochi i metionil tRNA disponibili, i complessi ternari

disponibili, questa subunità minore rimane lì, continua a fare la scansione in attesa che uno dei pochissimi

disponibili complessi ternari arrivi. In questa fase la subunità minore salta la traduzione del primo, della terza

e anche la quarta in queste condizioni di pochissima disponibilità di complessi ternari. Per assurdo aumenta la

probabilità che la nostra subunità minore oltrepassi queste sequenze regolatorie ed arrivi a tradurre la

sequenza codificante. In condizioni di privata disponibilità di complessi ternari non verrà praticamente

tradotta perchè i moduli di lettura aperti a monte della sequenza codificante, in quelle condizioni di non

blocco della sintesi proteica, di mancanza di nutrienti, vengono tradotte, sequestrano i ribosomi e

diminuiscono l'efficenza della traduzione di questo mRNA.

Questi moduli di lettura aperti a monte sono delle brevi sequenze con AUG e codone di terminazione ed

hanno un ruolo regolatorio. Vanno a interferire con la traduzione della sequenza codificante perchè

sequestrano le subunità ribosomiali.

In condizioni di disponibilità di nutrienti, la traduzione di GCN4 è inefficiente perchè il quarto modulo di

lettura viene tradotto, le subunità minori e maggiori del ribosoma si dissociano e GCN4 non viene tradotto.

In condizioni opposte, in mancanza di nutrienti, la sintesi proteica globale è bloccata, ci sono pochi complessi

ternari disponibili.

In questa situazione, la nostra subunità minore ribosomiale, che sta facendo la sua scansione verso la

sequenza codificante, proprio perchè non arriva il metionil tRNA quando dovrebbe tradurre il secondo, il terzo

e il quarto modulo di lettura aperto, c'è una maggior probabilità che arrivi a tradurre la sequenza codificante.

Tutti questi meccanismi di cui abbiamo parlato vanno a interferire con l'inizio della sintesi proteica, cioè tutti

questi meccanismi vanno a interferire con la possibilità di iniziare la traduzione del messaggio.

Ora parliamo di uno dei meccanismi di regolazione della sintesi proteica a livello della fase di allungamento. La

difterite è una malattia provocata da un batterio, il quale, una volta entrato, rilasca una tossina che danneggia

i tessuti e ha come bersaglio il fattore di allungamento EF2 (elongation factor), che rende possibile la

traslocazione GTP dipendente del ribosoma, conseguentemente alla formazione del legame peptidico da

parte della peptidil transferasi, e il conseguente rilascio dal sito E (exit) di uscita del tRNA scarico che era

presente nel sito P. Quindi il nostro tRNA dal sito A, conseguentemente alla traslocazione, si trova ora nel sito

P.

La tossina difterica va a modificare covalentemente (con modalità NAD dipendente) ed inibire questo fattore

di allungamento, quindi viene bloccata la traduzione degli mRNA.

È abbastanza recente la scoperta che la traduzione può essere regolata non solo da fattori proteici ma anche

da piccoli RNA non codificanti con funzione regolatoria. Questi microRNA poi vengono inglobati in un

complesso RISC; questa sequenza del microRNA trova il suo bersaglio in un mRNA la cui traduzione verrà

bloccata e nella maggior parte dei casi, il miRNA (piccolo RNA non codificante con funzione regolatoria) andrà

a trovare la sua sequenza consenso più o meno complementare a livello dell'UTR al 3' dell'mRNA bersaglio.

Conseguentemente a questo legame, quell'mRNA non verrà tradotto e quindi non si formerà proteina.

Sono stati identificati centinaia di questi miRNA ed hanno un ruolo nello sviluppo, nel differenziamento e

regolano tanti mRNA codificanti, proteine.

I geni che codificano per questi piccoli RNA regolatori sono trascritti dall'RNA polimerasi 2, la stessa che

trascrive i geni che codificano per proteine.

I precursori dei miRNA subiscono attacco del cappuccio e poliadenilazione ma nel nucleo subiscono un primo

taglio, come si vede in alto. Quello che viene chiamato pre-miRNA, cioè il precursore di quello che sarà l'RNA

regolatorio, a livello nucleare, dopo essersi ripiegato a formare questa struttura con stelo ed ansa, da parte di

una ribonucleasi chiamata DROSHA, subisce un taglio e quindi rilascia questa struttura stelo ed ansa. Il nostro

precursore esce dal nucleo e va nel citoplasma, dove subirà un altro taglio da parte di un altro enzima

chiamato DICER.

Al di là del processamento che questi piccoli RNA subiscono, si arriva, conseguentemente a questo taglio, a

una struttura a doppio filamento. La stessa DICER degrada uno dei due filamenti, quindi rimane un corto RNA

che viene inglobato in un complesso che prende il nome di COMPLESSO DI SILENZIAMENTO INDOTTO

DALL'RNA, di cui fa parte il nostro piccolo RNA insieme a tutta una serie di proteine.

Il nostro piccolo RNA presente nel complesso RISC guiderà questo complesso verso un mRNA bersaglio; quindi

il nostro piccolo RNA si appaierà ad una sequenza consenso complementare. Possono essere più di una per

diversi miRNA. Uno stesso miRNA può regolare la traduzione di diversi RNA, più miRNA possono legarsi allo

stesso RNA messaggero bersaglio a livello del 3' UTR e a seconda del grado di complementarietà, quell'mRNA

potrà essere degradato oppure spostato a livello di regioni nel citoplasma che prendono il nome di CORPI DI

PROCESSAZIONE (P bodies).

Questo mRNA, collegato il miRNA, viene spostato in delle strutture citoplasmatiche e quindi quell'mRNA non

viene tradotto almeno temporaneamente.

Queste proteine, DICER, ARGONAUTA, che fanno parte del complesso RISC, sono proteine che partecipano

anche a quel processo più generale di silenziamento, che va sotto il nome di INTERFERENZA A RNA che è un

meccanismo antico che rende conto della degradazione, grazie a queste proteine, di molecole di RNA estranee

alla cellula, a doppio filamento.

Quindi questa interferenza a RNA, questa risposta della cellula che porta al silenziamento traduzionale di

mRNA è un meccanismo antico che è stato stimolato dalla presenza di RNA a doppio filamento nella cellula,

sintomo di un' infezione virale.

Conseguentemente al taglio citoplasmatico di DICER, anche il precursore del miRNA passa attraverso una fase

a doppio filamento, ecco perchè questo meccanismo regolatorio dei miRNA nasce da una risposta antica nelle

cellule alla presenza di RNA a doppio filamento nelle cellule, sintomo di infezione virale.

Questo meccanismo così fine è stato riutilizzato dalle cellule per un meccanismo fisiologico di regolazione. Ma

molte di queste proteine rientrano anche in questa interferenza a RNA che porta a un tentativo della cellula di

bloccare l'infezione virale andando a inibire la traduzione dei messaggeri virali.

Questo RNA a doppio filamento attiva DICER nel citoplasma, quindi si generano dei piccoli RNA interferenti, in

questo caso si parla di siRNA (silencing RNA, RNA di silenziamento) che analogamente al meccanismo appena

descritto, vengono incorporati nel complesso di silenziamento RISC. Questo piccolo RNA guiderà il complesso

RISC verso mRNA virali che presentano sequenza complementare e quindi verranno distrutti e non verrano

mai tradotti in proteine.

Questo meccanismo dell'interferenza a RNA in alcuni casi va ad agire anche a livello della cromatina, quindi a

livello della trascrizione, non della traduzione di un messaggero, ma della sintesi dell'RNA.

Il complesso che si forma non si chiama RISC ma si chiama RITS (trascriptional silencing complex, quindi

complesso di silenziamento trascrizionale indotto dall'RNA). Nel nucleo viene reclutato questo piccolo RNA

incorporato in questo complesso. Questo piccolo RNA guiderà il complesso nel nucleo dove l'RNA polimerasi

sta formando il messaggero e in quel punto, quindi nelle vicinanze del gene sul DNA, il complesso recluterà

tutta una serie di enzimi, di fattori che porteranno ad un silenziamento trascrizionale; andando ad agire sulla

metilazione del DNA, metilazione degli istoni, si converte quel tratto di DNA da eucromatico attivo dal punto

di vista trascrizionale ad un tratto eterocromatico e quindi questi piccoli RNA non codificanti regolatori hanno

anche un ruolo di silenziamento trascrizionale.

21 aprile

APPROCCI METODOLOGICI PER LO STUDIO DEL CICLO CELLULARE

Vi sono vari metodi per quantificare la proliferazione cellulare, il più semplice consiste nel contare le cellule

oppure vi sono misure indirette come ad esempio l’andare a determinare la quantità di DNA, RNA o proteine

tenendo conto che dovrebbero essere direttamente proporzionali all’aumento di cellule, oppure è possibile

usare anticorpi.

Parlando di approcci metodologici per lo studio del ciclo cellulare non si può non parlare della

citofluorimetria a flusso (CFM), operata con il citofluorimetro, uno strumento assai potente che consente la

misurazione e la caratterizzazione di cellule poste in una sospensione cellulare: difatti se occorre studiare la

proliferazione delle cellule di un tessuto per prima cosa è necessario disgregarlo in modo tale da ridurlo in

una sospensione.

Le cellule in sospensione vengono indirizzate in un capillare ove vengono messe in fila cosicché lo strumento

possa compiere un’analisi su una singola cellula per volta, analisi che può essere multiparametrica.

Il citofluorimetro consente analisi di parametri fisici (dimensioni,

rugosità, struttura interna e molti altri), che di parametri

“biochimici”, andando a misurare marcatori fluorescenti.

Il principio su cui si basa l’analisi è quello della focalizzazione

idrodinamica: nei capillari dello strumento circola una soluzione

salina isotonica che consente il trasporto delle cellule in fila

indiana, l’una dietro l’altra, fino alla cella di flusso.

Dopo l’analisi il campione può essere scartato, ma alcuni

citofluorimetri possono separare le cellule e recuperarle in base a

certe caratteristiche selezionate (processo detto sorting). Per

comprendere il funzionamento di un citofluorimetro dobbiamo

elencarne le componenti:

• sistema fluidico, consente il trasporto del campione e l’allineamento delle cellule;

• sistema ottico, formato da una sorgente di eccitazione (laser monocromatici) e un circuito di

rilevazione;

• sistema elettronico di elaborazione (converte segnali ottici in segnali di intensità di corrente).

Normalmente la sorgente consiste in un laser a ioni argon, che emette una radiazione monocromatica

unidirezionale di notevole intensità in determinate regioni spettrali del visibile e dell’ultravioletto. Spesso il

laser viene accordato sulla lunghezza d’onda λ=488 nm, che consente una efficiente misura dei parametri

fisici e può eccitare contemporaneamente diversi fluorocromi.

Il laser ha un’elevata potenza specifica e permette, perciò, di misurare minime quantità di fluorocromo, è

molto sensibile.

Inoltre possiede grande stabilità spaziale e di intensità ma ha l’inconveniente di emettere un numero

limitato di frequenze utili.

Quando la luce impatta sul fluorocromo dà luogo a due fenomeni che consentono li studio delle

caratteristiche fisiche e “biochimiche” della cellula: light scattering (diffrazione, riflessione e rifrazione della

luce) e fluorescenza.

Light Scattering

I due segnali che permettono di identificare le caratteristiche fisiche delle popolazioni cellulari sono:

• Forward Scatter o Scatter Lineare (FSC), osservabile “in controluce”, lungo l’asse della luce incidente,

tiene conto del fenomeno della diffrazione

e dà indicazioni sulle dimensioni della

cellula (sul suo diametro). SSC

• Side Scatter o Scatter a 90° (SSC),

ortogonalmente al fascio incidente,

segnale legato a fenomeni di riflessione e

rifrazione dovuti all’architettura interna FCS

della cellula, al rapporto

nucleo/citoplasma e alle scabrosità della sua superficie.

Combinando FSC e SSC si ottiene un particolare diagramma a dispersione a punti (scatter-plot) detto

citogramma, nel quale si possono osservare fino a 5 o 6 differenti popolazioni cellulari, in base alle sole

caratteristiche fisiche.

Ogni cellula è, infatti, identificata da un preciso valore di Foward scatter e Side scatter.

Ad esempio, in un citogramma di sangue si può notare che i linfociti cellule più piccole e regolari dei

granulociti, presentano valori di Side scatter e Foward scatter molto bassi mentre, al contrario, i granulociti

hanno alti valori di Side scatter (hanno un’architettura complessa) e alti valori di Foward scatter (dimensioni

maggiori) cellular detritus

Fluorescenza

I fenomeni di fluorescenza vengono innescati su appositi fluorofori, proteine coniugate a molecole

fluorescenti (ri-emissione di luce a λ maggiore e, quindi, energia minore) se eccitate da certe fonti luminose.

Queste proteine sono generalmente degli anticorpi che si legheranno all’antigene relativo sulla superficie

cellulare, nel nucleo o nel citosol delle cellule sotto analisi.

Altre sostanze, come il DNA, possono direttamente essere colorate con sostanze fluorescenti (il bromuro di

etidio è un colorante classico del DNA) senza bisogno di agenti intermedi quali gli anticorpi.

Ciascun fluorocromo ha particolari proprietà che lo identificano, difatti ciascuno di essi è caratterizzato da

una propria eccitazione, emissione e brillantezza.

Se si usano più fluorocromi (in analisi multiparametriche) nello stesso protocollo sperimentale, le loro

emissioni devono essere sufficientemente distanti per poter essere selezionate in modo distinto, ciascuna

da un rivelatore (PMT).

I due più usati in citofluorimetria sono:

Isotiocianato di Fluoresceina (FITCH) – emette nel verde

1. Ficoetrina (PE) – emette nel giallo.

2.

Le cellule, forzate ad allinearsi, attraversano individualmente un punto di misura, dove interagiscono con il

raggio luminoso del sistema di eccitazione, il sistema di lenti del sistema ottico raccoglie i segnali, li smista e

li invia a sensori (detti fotomoltiplicatori o detectors), che trasformano i segnali ottici in intensità di

corrente elettrica, oltre ad amplificare lo stesso segnale in maniera lineare o logaritmica.

I segnali provenienti dai PMT sono impulsi analogici ossia proporzionali in maniera continua alle dimensioni

del parametro analizzato.

Un convertitore spezzetta i valori continui rendendoli discreti. I segnali provenienti da ogni sensore sono

digitalizzati, associati fra loro ed inviati ad un elaboratore che provvede alla presentazione dei dati ed alla

loro definizione statistica.

La statistica si basa sull’impostazione di cursori che definiscono le aree di interesse calcolando gli eventi che

cadono al loro interno.

L’analisi più semplice produce un istogramma, ovvero un diagramma monodimensionale che rappresenta

quanti eventi posseggono un determinato valore.

Alternativamente può originare un diagramma di dispersione (dot-plot o scatter-plot), un’analisi

bidimensionale in cui ogni punto è dato dall’intersezione fra due parametri correlati. In un diagramma

bidimensionale si possono identificare dei campi (finestre) che delimitino popolazioni cellulari distinte.

L’analisi citofluorimetrica comporta tutta una serie di vantaggi, ad esempio:

• Poter prendere in considerazione fino a otto parametri contemporaneamente,

• Possibilità di mettere in relazione fra loro più caratteristiche della stessa cellula (multiparametricità),

• Tempi rapidi per numeri molto ampi di cellule,

• Elevata affidabilità statistica delle letture,

• Possibilità di effettuare ulteriori analisi poiché lo strumento memorizza l’esperimento (analisi a

posteriori).

Nel caso di DNA e RNA esistono fluorocromi che si intercalano in modo stechiometrico agli acidi nucleici,

detti fluorocromi intercalanti; l’intensità della loro fluorescenza è direttamente proporzionale alla quantità

di materiale genetico presente nel campione.

Tali molecole sono, classicamente:

• Ioduro di propidio (PI) – è caratterizzato da uno spettro di assorbimento nelle regioni del visibile del

verde e in parte del blu, mentre il suo spettro di emissione si concentra nella regione visibile del

rosso, con un picco di emissione a 620 nm.

Tale spettro consente il suo uso insieme ad altri fluorocromi come la FITCH e la PE.

• Bromuro di etidio (EB)

Gli intercalanti si legano, però, sia alla doppia elica del DNA che a quella dei dsRNA (double strand RNA),

fattore che rende necessaria la purificazione del campione, tramite digestione enzimatica dell’RNA per

mezzo di RNAasi dosate insieme al colorante.

In citofluorimetria è quindi possibile ottenere il dato percentuale esatto di

cellule in G1/G0, quelle che stanno in fase G2/M (che presentano una

quantità doppia di DNA rispetto a quelle in fase G1/G0) e quelle che

stanno in fase S (con un contenuto di materiale genetico intermedio

rispetto alle popolazioni G1/G0 e G2/M) integrando le aree sottese al

grafico prodotto dall’apparecchio.

Otre a queste informazioni, è possibile ottenere informazioni

citogenetiche come il grado di ploidia, che può essere alterata dai tumori.

Per tale indagine si effettua il rapporto fra le cellule G0/G1 in esame e

cellule sicuramente sane e diploidi, sempre in fase G0/G1, confrontando il

rapporto su un apposito DNA-Index.

Se non si hanno cellule aneupluiodi (con numero di cromosomi variato), il

rapporto sarà pari a 1; se si hanno cellule tumorali, il rapporto del DNA

Index (DI) sarà diverso da 1.

METODI PER VALUTARE LA DURATA DEL CICLO CELLULARE

Le analisi considerate fino ad ora non danno informazioni sulla durata delle singole fasi del ciclo cellulare.

Con un approccio simile quello di Howard e Pelc (che usarono il Fosforo 32), è possibile impiegare precursori

marcati del DNA (come la timidina triziata), che vengono integrati nel DNA neosintetizzato nella fase S.

Si suppone di avere una popolazione cellulare teorica, in cui le cellule sono tutte uguali, non muoiono, non si

differenziano, tutte proliferano e sono asincrone (percorrono il ciclo cellulare tutte ad ugual velocità).

Si definisce così il tempo del ciclo cellulare T come la somma della durata delle fasi del ciclo cellulare, per

C


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in scienze biologiche
SSD:
Università: Firenze - Unifi
A.A.: 2017-2018

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher ciemme. di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biologia cellulare con laboratorio e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Firenze - Unifi o del prof Donati Chiara.

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