Biologia animale

TECNICHE DI STUDIO DELLA MEMBRANA

FREEZE-FRACTURE

 Il materiale in esame viene congelato rapidamente, a

oltre – 150C e, con una lama fredda, viene fatturato,

dopodiché viene vaporizzato con carbone e platino la

superficie di frattura in modo da ottenere uno stampo

che, tramite microscopio elettronico, ne rivela la struttura

tridimensionale.

FREEZE-ETCHING

 Il materiale viene rapidamente congelato in presenza di

un criopreservante in modo che non si formino cristalli di

20 ghiaccio. Quando viene colpito da una lama anch’essa

congelata avviene una frattura su piani preferenziali, di

solito dovuti a regioni di legami particolari. Per le

membrane il taglio avviene tra il foglietto interno ed

esterno. La superficie fratturata vieni a questo punto

sublimata per eliminare l’acqua e poi stratificata con

platino e carbonio in modo che si abbia eccesso di

deposizione da una parte e assenza dall’altra. Si crea così

una replica della superficie che può essere analizzata al

microscopio elettronico.

MOVIMENTO DI SOSTANZE ATTRAVERSO LA MEMBRANA

La membrana plasmatica è detta SELETTIVAMENTE

PERMEABILE, dato che quasi tutti i passaggi di molecole

attraverso di essa è mediata da specifiche proteine di

membrana. Gas e sostanze apolari passano facilmente

attraverso di essa, mentre esistono sistemi diversi per far

passare sostanze idrofile e polari che altrimenti non

potrebbero. La membrana è, dunque, impermeabile a grandi

sostanze polari o con carica elettrica. Il passaggio di sostanze

attraverso la membrana viene distinto in TRASPORTO PASSIVO

e TRASPORTO ATTIVO. Nel trasporto passivo, ossia secondo

gradiente, è sufficiente che il carrier abbia una costante di

dissociazione per il ligando intermedia tra le concentrazioni

extracellulari e intracellulari del ligando. Il complesso carrier-

molecola si formano spontaneamente al lato in cui è maggiore

la concentrazione della molecola e si scinde al lato in cui la

concentrazione è minore.

Nel trasporto attivo, invece, è necessario che la costante di

dissociazione si modifichi durante il trasporto: il complesso

ligando-carrier si formerà sul lato dove la costante di

dissociazione è minore e si scinderà sul lato in cui la costante

di dissociazione è maggiore. Il trasporto attivo avviene contro

gradiente, per questo motivo richiede energia. L’energia

richiesta per il trasporto viene prelevata dall’ATP e dalla luce

da una particolare lunghezza d’onda. Sia nel trasporto passivo

sia in quello attivo il flusso netto del ligando non continua

indefinitivamente, ma cesserà non appena la molecola avrà la

stessa concentrazione ai due lati della membrana. Nel

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trasporto attivo, a differenza di quello passivo in cui il

gradiente della membrana viene dissipato, si crea un

gradiente. Le concentrazioni finali del ligando dentro e fuori la

cellula si manterranno costanti nel tempo.

TRASPORTO PASSIVO

DIFFUSIONE SEMPLICE

 E’ il passaggio di gas, ossigeno e anidride carbonica,

piccole molecole non carice, come urea ed etanolo, e

sostanze lipofiliche. Questo passaggio si effettua secondo

gradiente di concentrazione.

DIFFUSIONE FACILITATA

 E’ un processo di trasporto passivo cellulare, simile

alla diffusione semplice, in quanto non richiede consumo

di ATP. La differenza con la diffusione semplice consiste

nel fatto che nella diffusione facilitata le molecole, polari,

e gli ioni passano con estrema difficoltà perciò hanno

bisogno di un trasportatore: questo trasportatore è

individuato nelle proteine canale oppure nei carriers. Le

proteine canale formano dei canali idrofilici che

permettono il passaggio di ioni senza che si leghino al

soluto. Sono selettive per il tipo di ione, per la

dimensione e per la carica. Un CARRIER è una proteina

transmembrana che lega le molecole da un lato della

membrana e le trasporta all’altro grazie ad un cambio di

conformazione.

1. LA MOLECOLA ENTRA NEL SITO DI LEGAME DEL

CARRIER

2. IL CARRIER CAMBIA CONFORMAZIONE

3. IL SITO DI LEGAME VIENE ESPOSTO DALL’ALTRO

LATO DELLA MEMBRANA

4. LA MOLECOLA SI DISSOCIA E DIFFONDE NEL

LIQUIDO

5. IL SITO DI LEGAME RITORNA DISPONIBILE E IL

CARRIER PUO’ LEGARE UNA MOLECOLA DA

PORTARE FUORI

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Il flusso netto della diffusione facilitata avviene dal lato che ha

maggiore frequenza di legame verso quello con minore

frequenza. Il legame del soluto al carrier è influenzato da

alcuni fattori come:

AFFINITA’ DEL SITO DI LEGAME DEL CARRIER

 ALLA MOLECOLA DA TRASPORTARE

GRADIENTE DI CONCENTRAZIONE TRA I LATI

 DELLA MEMBRANA

La velocità della diffusione facilitata vieni influenzata da tre

fattori: VELOCITA’ DI TRASPORTO DEI SINGOLI CARRIER

 NUMERO DI CARRIER SULLA MEMBRANA

 ENTITA’ GRADIENTE DELLA SOSTANZA (più il

 gradiente è alto in sostanza è trasportata)

OSMOSI

 È simile alla diffusione semplici, con la differenza che è il

solvente a spostarsi da un compartimento all’altro a

seconda della concentrazione dei soluti presenti in essa.

Il compartimento in cui le concentrazioni dei soluti è più

alta viene detto IPERTONICO, mentre il compartimento

dove è più bassa viene detto IPOTONICO. Le soluzioni

ISOTONICHE quelle con la stessa concentrazione di soluti

in entrambi i compartimenti.

TRASPORTO ATTIVO PRIMARIO

Molte proteine transmembranali sono capaci di accoppiare il

trasporto contro gradiente di diversi substrati con la catalisi

della defosforilazione dell’ATP. Suddette proteine hanno

solitamente strutture complesse, ma raggruppate in due

componenti: componente intrinseca alla membrana

  componente affacciato al lato

 

citoplasmatico

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La prima componente ha il compito di incanalare le molecole

per il passaggio transmembranario, la seconda compie la

FOSFORILAZIONE o DEFOSFORILAZIONE IDROLITICA DELL’ATP

(innescata dal legame del substrato a particolari siti di ).

Gli ioni trasportati contro gradiente, possono riattraversare la

membrana attraverso il trasporto passivo.

+ +

POMPA Na /K La pompa

+ +

Na /K

trasporta il

sodio e

potassio in

direzioni

opposte

attraverso la

membrana. Il

trasporto è

attivo in

entrambi i casi poiché gli ioni si muovono contro gradiente. Ad

ogni ciclo viene realizzata una molecola di ATP.

1. I siti di legame sono rivolti all’interno della cellula e sono

+

disponibili per legare 3Na

+

2. Legati 3Na si verifica l’idrolisi dell’ATP

3. Avviene la fosforilazione della pompa che provoca un

cambiamento conformazionale della

proteina: questa rivolge i siti di legame verso

l’esterno

4. I siti di legame cambiano forma e riducono l’affinità per il

sodio che a questo punto viene liberato al di fuori della

cellula. +

5. Ai siti di legame, ora, si legano 2K

6. I siti di legame vengono rivolti verso l’interno

+

7. I 2K vengono rilasciati all’interno

8. La pompa perde il fosfato e ritorna alla sua forma

normale

9. Il ciclo è concluso e si può iniziarne un altro

24 + +

La pompa Na /K si comporta come una proteina

trasportatrice per due aspetti:

È dotata di siti di legame per il sodio e per il potassio

 Trasporta gli ioni attraverso la membrana grazie a

 cambiamenti conformazionale

Nonostante ciò tra pompa e proteina trasportatrice esistono

differenze importanti:

I siti di legami della pompa sono rivolti solo verso un lato

 alla volta

Nella pompa l’affinità dei siti di legame si modifica

 durante il ciclo e non all’inizio.

+ +

La pompa Na /K è molto importante per la vita: se dovesse

fermarsi si avrebbe la lisi cellulare poiché avverrebbe una

diminuzione della tonicità. Si è stimato che il 40% dell’energia

spesa complessivamente da un intero organismo va a far

funzionare la pompa.

+ +

POMPA H /K

La pompa protonica è molto simile alla pompa sodio/potassio,

ma a differenza di quest’ultima, È elettricamente neutra

poiché ad ogni ciclo, idrolizzando una molecola di ATP, porta

+ +

all’esterno due ioni H e all’interno due ioni K . La funzione

principale della pompa protonica è mantenere alta la

+

concentrazione intracellulare del K senza alterare il

potenziale di membrana. La pompa protonica è importante dal

punto di vista farmaceutico poiché sono stati scoperti

INIBITORI SPECIFICI che vanno ad arrestare il flusso degli ioni

+ +

H e K . Questa scoperta ha subito trovato applicazione nella

cura di diverse disfunzioni gastriche: L’Omeoprazolo è un

farmaco in grado di arrestare questo flusso e quindi di

diminuire l’acidità di stomaco.

2+ +

POMPA Ca /H

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La pompa del calcio spinge attivamente il calcio dal citosol

verso l’esterno della cellula a spese dell’idrolisi dell’ATP. La

concentrazione del calcio nello spazio extracellulare è di

quattro ordini grande di quella del citosol. Un aumento della

concentrazione del calcio innesca numerose risposte cellulare

come d’esempio la contrazione muscolare oppure il rilascio di

neurotrasmettitori. Tale pompa è controllata dal calcio stesso

con la mediazione della CALMODULINA (CaM). La pompa del

calcio è molto simile a quella del sodio/potassio, infatti, si

pensi derivino da una stessa proteina ancestrale. Il legame nel

calcio ad un sito della CaM provoca un cambiamento

conformazionale che porta in superficie un sito non polare.

Questo complesso passi che si attivi la pompa del calcio sulla

membrana plasmatica. Se la concentrazione del calcio È al di

*

sotto della costante di dissociazione dalla calmodulina allora

la pompa è inattiva mentre, se la concentrazione del calcio è

al di sopra della costante di dissociazione della calmodulina

allora lo ione si lega a questa e attiva la pompa del calcio.

La costante di dissociazione K è un indice di affinità tra

* m

l’enzima e il substrato: più basso sarà il valore della costante

di dissociazione e più bassa sarà la concentrazione del

substrato che permette di raggiungere una velocità di

reazione pari alla metà della velocità massima.

TRASPORTO ATTIVO SECONDARIO

Il trasporto attivo secondario è diverso da quello primario in

quanto nel secondario una proteina trasportatrice accoppia il

flusso di una sostanza a quello