Bioingegneria chimica

DEFINIZIONI

BIOMATERIALE: sostanza non vivente utilizzata nella fabbricazione di un dispositivo

medico che ha in qualche punto un'interfaccia con un tessuto vivente.

BIOCOMPATIBILITA': capacità di un biomateriale di determinare da una parte di un

essere vivente una favorevole reazione alla sua presenza in una specifica applicazione.

BIOCOMPATIBILITA’ dei DISPOSITIVI a LUNGO TERMINE: abilità del dispositivo di

svolgere la sua specifica funzione, con il desiderato grado di incorporazione nel

tessuto ospite, senza provocare alcun effetto locale o sistemico indesiderato.

BIOSICUREZZA: esclusione di possibili danni seri causati dal materiale a carico

dell’ospite.

BIOFUNZIONALITA’: capacità del materiale di stimolare nell’ospite la risposta

desiderata per la sua specifica applicazione.

BIODEGRADAZIONE: progressiva disgregazione di un materiale mediata da attività

biologiche.

BIORIASSORBIMENTO: processo di dissoluzione o di rimozione dovuto ad attività

cellulare di un materiale inserito in ambiente biologico.

CITOTOSSICITA’: capacità di un materiale di provocare un effetto tossico a carico delle

cellule che comporta una variazione della loro normale morfologia e fisiologia.

TROMBOGENITA': proprietà di un materiale che induce la formazione di un trombo.

MUTAGENICITA’/CARCINOGENICITA’: capacità di una sostanza di causare anomalie

geniche.

DISPOSITIVO MEDICO: strumento, apparato, arnese, macchina, invenzione, reagente in

vitro o un altro oggetto similare compreso ciascun componente, parte o accessorio per

il quale è previsto l'uso in medicina.

ORGANO ARTIFICIALE: dispositivo medico che sostituisce in parte o completamente le

funzioni di uno degli organi.

PROTESI: dispositivo medico che sostituisce un arto, un organo o un tessuto.

BIOPROTESI: protesi impiantabile costituita totalmente o sostanzialmente da un

tessuto biologico trattato non vivente.

DISPOSITIVO PERCUTANEO: dispositivo medico che passa attraverso la cute rimanendo

in tale posizione per un significativo lasso di tempo.

IMPIANTO: dispositivo medico fabbricato con uno o più biomateriali posto

intenzionalmente all'interno del corpo e totalmente o parzialmente inglobato al di

sotto di una superficie epiteliale cutanea o mucosa.

GRAFT: pezzo di tessuto vivente trasferito da una zona di un donatore ad una zona di

un ricevente con lo scopo di ricostruire quest'ultima.

TRAPIANTO: struttura completa trasferita da una zona di un donatore ad una zona di

un ricevente con lo scopo di ricostruire quest'ultima.

Il problema è l’iterazione tra corpo umano e dispositivo medico, innanzitutto un

dispositivo può essere totalmente impiantato (protesi d’anca) oppure percutaneo

(protesi dentaria). Importante in questo ambito è quindi l’uso dei corretti biomateriali

Biomateriali artificiali sintetici:

o metalli + ottime prestazioni meccaniche

 + buone tecnologie

- reazioni con l’ambiente circostante (liberano ioni)

Polimeri + estremamente biocompatibili

 - perdita di massa molecolare

Ceramici + estremamente duri

 + inerti Rigetto: fenomeno che porta l’organismo

+ buona tecnologia ospite a chiudere i capillari che irrorano il

- molto fragili nuovo organo

Biomateriali naturali:

o viventi trapianti: organo proveniente da un donatore umano (possibile rigetto)

 trapianti ingegnerizzati: organi cresciuti artificialmente (possibile

rigetto) autocraft: cellule cutanee del paziente re-impiantate nello stesso

(cellule autologhe)

non viventi homograft: cellule prelevate da un donatore ma rese non viventi

 eterograft: cellule prelevate da un animale ma rese non viventi

Cellule trattate mediante tecniche

Sia homograft che eterograft presentano che permettono di eliminare la parte

reazioni compatibili con quelle dei materiali vivente delle stesse mantenendo

forma e struttura

polimerici

Biocompatibilità

Capacità di un materiale di generare una risposta appropriata in un sistema ospitante

data una particolare applicazione.

La ricerca del migliore dispositivo deve tener conto di alcuni fattori come:

- Destinazione e durata d’uso: se temporaneo (es. lenti a contatto giornaliere),

periodico (es. lente a contatto mensile) o permanente (es. protesi d’anca).

- Risposta dell’organismo: se si verifica infiammazione (se il corpo cerca di rigettare

il dispositivo), infezione (può verificarsi per i dispositivi percutanei), coagulazione

(sangue coagula a contatto con qualsiasi materiale che non sia endotelio) o emolisi

(rottura dei globuli rossi a causa di urti e variazioni di temperatura).

- Dispositivo: se la geometria è identica a quella della parte da sostituire

L’iterazione tra biomateriale e ambiente vivente avviene all’interfaccia tra i due,

questo ci permette anche di avere una parte interna non biocompatibile, l’importante

che tutto sia rivestito da un materiale biocompatibile

Biocompatibilità

Funzionale: Biologica: interfaccia

Anatomica: adeguatezza alle tra dispositivo e

forma, peso e specifiche di tessuto

ingombro progetto

Importante è quindi interazione tra il biomateriale e il corpo umano ed in particolare

possiamo notare:

- Effetti impianto sull’ospite abbiamo effetti locali come la carcinogenesi, le



infezioni, le infiammazioni, la citotossicità, l’emotossicità e l’interazione con il

sangue. Abbiamo però anche effetti sistematici come la formazione di emboli, le

reazioni immunitarie, la sensibilizzazione allergica e la tossicità sistematica.

- Effetti ospite sull’impianto abbiamo effetti fisico-meccanici come l’usura del



materiale più morbido, la fatica, la corrosione e l’ossidazione. Abbiamo anche

effetti biologici come l’adsorbimento di sostanze dai tessuti, la degradazione

enzimatica e la calcificazione.

- Fenomeni alla superfice adsorbimento superficiale di proteine (dispositivo



coperto da uno strato proteico, il tipo di proteine adsorbite. È determinato dalle

proprietà delle proteine presenti nei fluidi circostanti), adesione e attivazione

cellulare (dipendono dal tipo di proteine adsorbite, dalla loro conformazione e dal

riarrangiamento).

Per valutare la biocompatibilità si possono seguire due differenti procedimenti detti in

vitro (test cellulari) e in vivo (impianti in modello animale). Generalmente quando si

sviluppa un materiale i primi test vengono fatti in vitro e conseguentemente si passa

ai test in vivo sugli animali anche se ancora non si avrà una corretta simulazione della

reazione del corpo umano.

In vitro posso fare esperimenti senza cellule, cioè prendo il materiale, lo pongo in

ambiente simile a quello biologico e controllo gli effetti (verifico la corrosione o la

degradazione). Per capire però la biocompatibilità del materiale effettuo i test cellulari

che sono regolati sia in vivo che in vitro dalla normativa ISO 10993.

Quando studio la risposta del materiale in vitro faccio test di:

- Citotossicità: il materiale non deve essere tossico per le cellule e il contatto cellule

materiale non deve essere tossico.

- Mutagenicità o carcinogenicità: se il materiale fa mutare le cellule facendole

diventare carcinomi.

- Emocompatibilità: sangue è il tessuto più critico, quindi effettuo test per verificare

la citocompatibilità con il sangue. (devo evitare la morte cellulare, emolisi e

coaguli).

- Biofunzionalità: valuto l’attacco cellulare, l’adesione cellulare, la proliferazione e le

funzioni biosintetiche. Questo lavoro avviene grazie a tecniche di microscopia come

la microscopia elettronica (studio la morfologia e l’adesione cellulare) o quella a

fluorescenza (formazione di miotubi).

Quindi se le cellule reagiscono bene il materiale è biocompatibile se invece muoiono il

materiale è tossico. Inoltre, se le cellule mantengono stessa forma e funzione vuol dire

che il materiale non è citotossico. Le cellule che vengono utilizzate per questi test

possono essere di due tipologie:

- Cellule primarie cellule isolate da un materiale vivo tramite prelievo o biopsia.



Hanno come vantaggio il fornire dei parametri biologici realistici mentre gli

svantaggi sono la bassa riproducibilità e reperibilità

- Cellule di linea o immortalizzate derivate da culture primarie o manipolazioni



genetiche come vantaggio hanno la riproducibilità, la reperibilità e la

standardizzazione mentre come svantaggio hanno la risposta fornita che non è

fisiologica.

Quando mi trovo davanti ad un nuovo materiale ho quindi una procedura da seguire

che è la seguente:

1. Lo pongo in ambienti con diverse t e diversi pH

2. Faccio test funzionali come i cicli di fatica e verifico se e cosa rilascia

3. Lo metto a contatto con cellule immortalizzate e valuto cosa succede

4. Testo il materiale in un piccolo animale con i test in vivo analizzando i tessuti

biologici per comprenderne la biocompatibilità

Una volta ottenuto il materiale devo crearne un oggetto e quindi assicurarmi che le

tecnologie di lavorazione non alterino le proprietà del materiale. Se il materiale non

viene modificato chimicamente passo a studiare la biocompatibilità funzionale e

anatomica impiantando ad esempio la protesi nell’animale e controllando se

riprendono le funzionalità. Se avviene questo si fa domanda all’FDA per l’utilizzo del

materiale ed infine sperimento sull’uomo. Superata la sperimentazione che dura circa

10 anni per protesi e di più per i farmaci si può commercializzare il prodotto.

I test cellulari possono essere chiamati di citotossicità diretta o indiretta.

- La citocompatibilità indiretta: è il primo test che viene effettuato, si prendono un

po' di campioni del materiale e si mettono in una piastra di petri (un vassoietto di

plastica con vaschettine con coperchio). Si lascia il medium a contatto con il

materiale per un certo tempo nell'incubatore a 37 gradi (questa temperatura è un

vincolo). Controllo gli effetti dopo una settimana prendo il medium che è stato a

contatto con il materiale e ci coltivo le cellule. Semino le cellule di linea e le coltivo

su una vaschetta nuova, le faccio crescere e se il materiale ha rilasciato sostanze

citotossiche queste cellule muoiono. Invece, se questo materiale non ha rilasciato

sostanze citotossiche non vedo la differenza con l'inizio. Questo è il test di

citotossicità indiretta perché non metto a contatto il materiale con le cellule ma uso

il medium comune e viene fatto su n cellule.

- La citocompatibilità diretta: è un esperimento in cui il materiale che vogliamo

valutare viene messo nella piastrina di Petri ma insieme a lui vengono coltivate

sopra anche le cellule. Si usa il materiale, un medium nuovo e le cellule cosi da

andare a valutare il contatto tra le cellule e il materiale.

Il materiale che rilascia di più è il polimero, in generale i materiali rilasciano ioni

metallici (i metalli) che se sono pochi non creano danni, sono pericolosi se sono tanti.

Monomeri, contaminanti, lubrificanti, stabilizzanti, plastificanti, antiossidanti sono

sostanze che possono essere tossiche o non tossiche. Questi residui vengono

fagocitati dai macrofagi che le inglobano all'interno della cellula. Quindi in generale

materiali che rilasciano non vanno bene. D'altra parte, non esistono materiali che non

rilasciano, quindi per minimizzare il rilascio devo pensare alla chimica.

Per capire poi se una cellula è viva o morta faccio le analisi colorimetriche in

particolare tramite MTT che si lega alle cellule vive. Permette di visualizzare

qualitativamente la distribuzione delle cellule. In particolare, si usano due metodi

quello spettroscopico (misuro l’assorbenza del sale, cioè l’MTT ridotto, che aumenta

con il numero di cellule vive) e quello alamar blue (i nuclei vivi sono blu quelli morti

viola, guardo solo quale colore prevale).

La vera biocompatibilità però è quella in vivo che viene valutata impiantando il

dispositivo in materiale vivo. Appena impiantata la protesi ho la necessità di un

periodo di guarigione detto processo infiammatorio al termine del quale non dovrei

avere nessuna differenza nel materiale vivo rispetto a com’era prima dell’intervento. Il

processo infiammatorio è una risposta fisiologica dell’organismo mediato da proteine e

cellule. Ad esempio, nel caso di protesi d’anca se dopo circa 3 mesi ho ancora questo

processo significa che la protesi non ha funzionato correttamente. Inoltre, può

succedere che ci siano micromovimenti tra protesi e tessuto che lo accoglie che

portano a far fallire la protesi a causa di una microdistruzione biologica oppure posso

trovare l’osso non ben formato ma con un callo o una parte infiammata. Invece nel

caso di protesi vascolare devo garantire che questa si deformi e inoltre un altro

aspetto che può portare problemi è che questa è immersa in tessuto connettivo molle

e quindi non sarà ferma rispetto al tessuto in cui è immersa.

COLTURE CELLULARI

Consiste nel mantenimento o di cellule in laboratorio, i primi tentativi furono svolti nel

‘900 ma si ebbe un grande sviluppo negli anni ’50.

Prima cosa importante da fare è la classificazione delle cellule in base ad alcuni

parametri:

- Presenza di nucleo: quindi procariote piuttosto che eucariote

- Provenienza: quindi cellule primarie o cellule di linea continua

- Meccanismo di crescita: quindi cellule ancoraggio dipendenti (colture in

monostrato) o cellule in sospensione (colture in sospensione)

- Morfologia: abbiamo le cellule simil-epiteliali (aderiscono al substrato, appaiono

piatte e di forma poligonale), le cellule simil-linfoblasti (non aderiscono al

substrato, rimangono in sospensione e sono sferiche) e le cellule simil-fibroblasti

(aderiscono al substrato, bipolari ed appaiono allungate)

Le colture cellulare possono essere usate in diversi campi: possono essere usate come

sistemi modello (per lo studio di farmaci, processi d’invecchiamento, biocompatibilità

tumorigenicità e biologia molecolare), per la terapia cellulare o genica e

nell’ingegneria dei tessuti.

Come avviene la crescita cellulare?

Per prima cosa bisogna fornire periodicamente nuova superfice cosi che le cellule

possano proliferare, in particolare quando le cellule sono nella log phase. La maggior

parte delle cellule animali cresce in monostrato su un substrato solido, il processo può

essere visto nel grafico e viene suddiviso in più fasi:

lag phase: fase durante la quale le cellule non si

dividono, aderiscono al substrato.

log phase: fase di proliferazione in cui il numero

di cellule cresce esponenzialmente.

stationary phase: quando la superfice a

disposizione coperta la proliferazione rallenta

fino a cessare, il numero di cellule rimane quindi

costante.

death phase: se la coltura viene protratta

ulteriormente nel tempo si arriva alla morte

cellulare.

Un’altra importante fase è quella di espansione della popolazione cellulare, per prima

cosa vi è lo scongelamento e la formazione di una sospensione di cellule che poi con la

semina vengono trasferite in contenitori. Successivamente vi è una fase di

incubazione fino a che le cellule raggiungano la semi-confluenza. Le cellule vengono

distaccate e suddivise in piastre sulle quali vengono conservate per congelamento.

Importante è la conservazione cellulare che mantiene le cellule quiescenti e garantisce

la presenza di scorte. Avviene nel seguente modo la sospensione viene conservata in

criovals depositate in un contenitore per azoto liquido.

Importante come abbiamo visto prima è anche il medium per colture cellulari che ha il

compito di mantenere un ambiente biochimico simile a quello naturale, fornisce i

nutrienti essenziali, mantiene costante il pH e fornisce anche un’indicazione visiva

dello stato di salute delle cellule. Il medium base è composto da amminoacidi,

carboidrati, vitamine, sali e elementi in tracce. A questo vengono poi aggiunti additivi

come la glutammina, antibiotici, siero (fattori di crescita, ormoni) o amminoacidi non

essenziali.

Una volta che le cellule sono nel terreno di coltura il mantenimento delle condizioni

vitali viene garantito da un incubatore per colture cellulari che va a controllare

temperatura, umidità relativa e composizione atmosferica. Tramite questo si può

+

controllare anche il pH, le colture cellulare infatti liberano molti ioni H generando

acidificazione, per risolvere il problema si una un sistema tampone che mantiene il pH

nonostante il rilascio di ioni e quello più usato e a base di bicarbonato

Infine, un ultimo importante parametro da mantenere è la sterilità cioè la totale

assenza di batteri e altri microrganismi. Le principali fonti di contaminazione sono il

contatto con attrezzi non sterili, errori accidentali e l’ingresso di particelle per via aere.

Per preservarla si usano filtri, incubatori, strumenti sterilizzati in autoclave e la cappa

a flusso laminare. Quest’ultima è una cappa ventilata aperta frontalmente con vetro

protettivo, va a filtrare l’aria trattenendo il 99,97% delle particelle, però non sterilizza

semplicemente evita la contaminazione.

LE PROTEINE

Sono numerose e fondamentali nel corpo umano, sono utilizzate per creare

biomateriali, sono un materiale biologico (autograft, se sottoposte a sterilizzazione

possono essere usate come matrice) e sono lo strumento di comunicazione tra cellule.

L’unità funzionale ovvero il monomero sono gli

amminoacidi

Sono tra di loro differenziati dal gruppo laterale R

Possono essere: Positivi (lisina, arginina, istidina)

Negativi (acido aspartico, acido glutammico)

Neutri (serina, teorina)

Casi speciali (glicina)

Idrofobici o idrofilici

Il punto isoelettrico, pl, è il pH a cui la concentrazione