Appunti Bioingegneria chimica 2

I polimeri naturali

I tessuti naturali contengono acqua (70%), macromolecole, ioni e piccole molecole. Le principali macromolecole sono, in ordine di percentuale di presenza: proteine, acidi nucleici, polisaccaridi, lipidi. I polimeri naturali di interesse per le applicazioni biomedicali sono polisaccaridi, proteine, acidi nucleici.

Polisaccaridi

I polisaccaridi, o carboidrati, sono molecole/macromolecole essenziali per i processi metabolici e per la vita. Possono essere lineari o ramificati. Possono avere carica netta positiva, negativa o neutra. I polisaccaridi sono composti principalmente da Carbonio (C), Ossigeno (O), Idrogeno (H). Altri gruppi funzionali: -NH₂, -SO₃; -COO. Formula bruta [CH₂O]_n.

Rappresentazione delle strutture

Come li rappresento? Struttura di Fisher (lineare -1), proiezione di Haworth (ciclica-2), rappresentazione conformazionale (sedia o barca-3); configurazione assoluta (4); rappresentazione spaziale (stecca-sfera).

Classificazione

• Semplici/Complessi
• Gruppo aldeidico/chetonico
• Numero di atomi di carbonio (esosi/pentosi)

Esosi: gruppo di monosaccaridi con sei atomi di carbonio. Pentosi: gruppo di monosaccaridi con cinque atomi di carbonio.

Attenzione: gli esosi hanno più centri chirali rispetto ai pentosi; il numero di possibili stereoisomeri degli esosi è superiore a quello dei pentosi.

Isomeria

Isomeri: sono composti diversi che hanno la stessa formula molecolare; gli isomeri strutturali sono caratterizzati da una diversa concatenazione degli atomi; gli stereoisomeri hanno stessa concatenazione degli atomi, ma diversa orientazione degli stessi nello spazio.

Stereoisomeri: si suddividono in enantiomeri e diastereoisomeri; gli enantiomeri sono stereoisomeri le cui molecole sono l’una l’immagine speculare e non sovrapponibile dell’altra; i diastereoisomeri sono coppie di stereoisomeri che non sono immagini speculari; gli epimeri sono diastereoisomeri che differiscono per la configurazione presso un solo stereocentro.

Configurazione assoluta (R, S): R – RECTUS, diritto; l’ordine di priorità dei gruppi su un centro chirale è in senso orario. S – SINISTER, sinistro; l’ordine di priorità dei gruppi su un centro chirale è in senso antiorario. Direzione in cui ruota la luce polarizzata (L, D): negli zuccheri prevale la configurazione D.

Anomero: epimero incorporato all'interno di una struttura ad anello. Configurazione alfa o beta a seconda della posizione dell’ossidrile al di sotto (alfa) o al di sopra (beta) del piano della molecola.

I gruppi ossidrilici e carbonilici dei monosaccaridi possono subire una reazione di ciclizzazione intramolecolare per formare emiacetali (C legato a un gruppo R, OH e un gruppo OR') o emichetali (C legato a un gruppo R, OR e un gruppo OR') che hanno cinque o sei atomi di C nell’anello. La chiusura dell’anello converte il C aldeidico in un carbonio emiacetalico asimmetrico per cui si avranno due strutture (isomeri alfa e beta) che differiscono solo per la configurazione al C-1. La differenza nella configurazione al C-1 ha impatto sulla conformazione e funzioni del monosaccaride così come del polisaccaride risultante.

Legame glicosidico

Reazione di condensazione fra il gruppo ossidrile del carbonio anomerico del primo monosaccaride ed un gruppo ossidrile del secondo (più comuni sono C1-C4 e C1-C6). Possono essere di tipo alfa (es amido) o beta (es cellulosa). Amido (legame glicosidico 1-4 tipo alfa) e cellulosa (legame glicosidico 1-4 tipo beta) sono entrambi polimeri lineari formati da glucosio ma assumono strutture e proprietà diverse: gli enzimi umani non possono degradare il legame beta della cellulosa che è anche insolubile in acqua.

Polisaccaridi come biomateriali

Chitina e chitosano

Chitosano: polimero naturale cationico ottenuto dalla chitina. Forma prevalente: alfa-chitosano. È un polisaccaride lineare costituito da unità di D-glucosammina e N-acetil-D-glucosammina legate fra loro da legami beta (1-4) glucosidici. Il grado di deacetilazione può variare fra 70 e 90%. Il peso molecolare varia tra 10 e 1000kDa. Le proprietà chimico-fisiche del chitosano dipendono dalle proporzioni relative delle unità di D-glucosammina e N-acetil-D-glucosammina.

• Biocompatibilità
• Proprietà antibatteriche
• Emostatico
• Degradabile
• Possibilità di modifiche chimiche
• Diversi pesi molecolari e diversi gradi di acetilazione
• Ottenibile in diverse forme

Alginato

Alginato: polimero naturale anionico. Forma sali con cationi bivalenti. E’ un polisaccaride lineare costituito da unità blocchi alternati di acido beta-D-mannuronico e alfa-L-glucuronico tra i quali si formano legami beta 1-4 glicosidici. L’interazione di cationi bivalenti (Calcio, Bario, Sodio) con i blocchi di alfa-L-glucuronico di catene adiacenti permette la creazione di ponti ionici con conseguente gelificazione di soluzioni acquose di alginato. Le proprietà chimico-fisiche dell’alginato gelificato in soluzione acquosa dipendono dal grado di reticolazione legata alla concentrazione degli ioni bivalenti presenti in soluzione.

• Biocompatibilità
• Approvazione FDA
• Bendaggi per ferite e ustioni
• Utilizzabile per rilascio controllato di farmaci
• Utilizzabile come cell carrier

Acido ialuronico

Acido ialuronico: polimero naturale lineare anionico, famiglia dei glucosamminoglicani. Nel corpo è responsabile di varie funzioni tra cui: bilanciamento del contenuto acquoso della matrice extracellulare; conferimento di proprietà lubrificanti (cartilagine); molecola segnale. Si produce per estrazione da tessuti di origine animale e vegetale o attraverso biofermentazione. E’ un polisaccaride lineare costituito da ripetizione di unità disaccaridica composta da acido beta 1-3 D-glucuronico e beta 1-4 N-acetilglucosammina. Può essere esterificato sfruttando i gruppi carbossilici liberi dell’acido glucuronico (riduzione idrofilicità ed aumento idrofobicità). Le proprietà dell’acido ialuronico sono modificate (reticolazione, esterificazione, …) per diminuire solubilità in acqua, aumentare tempo di degradazione, modificare funzionalità. Le proprietà dell’acido ialuronico esterificato dipendono dall’estere ottenuto (membrane, fibre, microsfere, spugne).

• Biocompatibilità
• Eccellenti proprietà assorbenti e lubrificanti
• Proprietà reologiche delle soluzioni dipendenti da pH, peso molecolare, concentrazione
• Possibilità di ottenerlo per via fermentativa a diverso peso molecolare

Eparina

Eparina: è un polisaccaride appartenente alla famiglia dei glucosamminoglicani. È una catena lineare eterogenea formata da diversi monosaccaridi legati con legame glicosidico ed è presente in natura in catene di varia lunghezza. I monosaccaridi principali sono: (a) 2-deossi-2-sulfamino-alfa-(D)-glucosio-6-solfato; (b) alfa-(L)-acido iduronico-2-solfato; (c) 2-acetamido-2-deossi-alfa-(D)-glucosio; (d) beta- (D)-acido glucuronico; (e) alfa-(L)- acido iduronico. Ha proprietà anticoagulanti e può essere come rivestimento di biomateriali per prevenire la formazione di trombi.

Cellulosa

Cellulosa: è un polisaccaride con catena lineare neutra omogenea composta da unità monosaccaridiche di glucosio ripetute, legati da legami beta-1-4 glicosidici. Il legame beta 1-4 glicosidico, a differenza dell’alfa 1-4 glicosidico, è molto rigido e stabile consentendo la formazione di catene molto lunghe. La cellulosa è altamente resistente alla trazione ed è poco solubile in acqua. E’ possibile estrarla dalle piante. L’essere umano non ha enzimi per rompere i legami beta per cui non possono, a differenza di alcuni ruminanti, digerire la cellulosa.

Amido

Amido: è un polisaccaride con catena lineare neutra omogenea composta da unità monosaccaridiche di glucosio ripetute, legati da legami alfa-1-4 glicosidici. In natura viene prodotto dalle piante come riserva di energia. Il 20% della sua massa è composto da amilosio, un polimero lineare di glucosio legato con legami alfa 1-4 glicosidici, e l’80% da amilopectina, un polisaccaride altamente ramificato formato da glucosio legato con legami alfa 1-4 glicosidici. Tali legami rendono l’amido altamente solubile in acqua e digeribile dagli enzimi umani.

Proteine

Le proteine sono molecole/macromolecole essenziali per i processi metabolici e per la vita. Sono polimeri lineari. Possono avere carica netta positiva, negativa o neutra. Le proteine sono composte da 20 alfa-amminoacidi, molecole in cui allo stesso atomo di carbonio in posizione alfa sono legati: un gruppo carbossilico (-COOH); un gruppo amminico (-NH₂); un idrogeno (-H); una catena laterale (-R). Essendo i 4 sostituenti del Carbonio alfa diversi (tranne glicina in cui R=H), gli amminoacidi sono chirali. In natura sono tutti in forma L.

Allo stato libero, gli amminoacidi hanno un gruppo carbossilico, debolmente acido, ed un gruppo amminico, debolmente basico, per cui sono anfoteri, cioè esistono in forme dipolari. Il pH cui la concentrazione dell’amminoacido in forma di ione positivo è uguale alla concentrazione dell’amminoacido in forma di ione negativo è detto punto isoelettrico (PI) ed è proprio di ogni amminoacido. Il gruppo R determina le diverse proprietà degli L-alfa-amminoacidi e influisce sulla struttura molecolare della proteina. Una classificazione degli amminoacidi si basa sul gruppo R poiché condiziona la funzionalità degli amminoacidi nel peptide e nella proteina.

Classificazione degli amminoacidi

• Gruppo R contenente zolfo: cisteina e metionina
• Gruppo R neutro: serina, glutammina, prolina, asparagina, treonina
• Gruppo R acido: asparagina, acido glutammico
• Gruppo R basico: arginina, istidina, lisina
• Gruppo R alifatico: leucina, isoleucina, glicina, valina, alanina
• Gruppo R aromatico: triptofano, tirosina, fenilalanina

Il legame peptidico è un legame ammidico che avviene in condizioni fisiologiche. Tutti gli atomi costituenti (-NHCO-) giacciono tutti sullo stesso piano senza possibilità di libera rotazione. Le proteine hanno una composizione elementare molto simile. In particolare, il contenuto di azoto è circa il 16-18%.

Diverse strutture

Struttura primaria

Sequenza degli amminoacidi

Struttura secondaria

Conformazione assunta dalla sequenza proteinca (alfa-elica; foglietto-beta, random coil). La struttura supersecondaria si riferisce alla presenza eventuale di domini, regioni spaziali di alfa-eliche o foglietto-beta che possono fungere da siti di legame per gli enzimi (proteine con funzioni specifiche).

Struttura terziaria

Conformazione dell’intera proteina; in ambiente biologico, i gruppi funzionali idrofili tendono ad esporsi all’esterno, quelli idrofobi all’interno influenzando la conformazione e la solubilità in acqua delle proteine.

Struttura quaternaria

Intero complesso derivante dall’associazione di subunità proteiche (protomeri); s.q. omogenea se subunità uguali, s.q. eterogenea se subunità diverse.

Solubilità

Fattori: pH, temperatura, polarità del solvente, carica, idrofobicità/idrofilicità; presenza di elettroliti, forza ionica. A basse concentrazioni di sali, la solubilità aumenta (mascherati gruppi carichi della proteina con riduzione dell’attrazione fra le molecole proteiche). Ad alte concentrazioni di sali, la solubilità diminuisce (sottrazione delle molecole di acqua di idratazione, conseguente precipitazione delle molecole proteiche). Le proteine precipitano a concentrazioni di sale differente e mantengono di solito la loro conformazione (risolubilizzazione).

Denaturazione

Alterazione della conformazione della proteina nativa che comporta una perdita di funzionalità biologica. Non coinvolge solitamente rottura di legami peptidici.

Denaturazione irreversibile

Ripristinate le condizioni ottimali, la proteina NON riassume la sua conformazione nativa (esposizione a calore, forti variazioni di pH, contatto con solventi organici e detergenti).

Denaturazione reversibile

Ripristinate le condizioni ottimali, la proteina riassume la sua conformazione nativa.

Semplici/coniugate

Proteine semplici: costituite unicamente da amminoacidi. Si dividono in proteine globulari, funzionali, generalmente solubili in acqua e proteine fibrose, strutturali, generalmente insolubili in acqua.

Proteine coniugate: costituite da amminoacidi ed altre componenti organiche o inorganiche. Sono glicoproteine (zuccheri); lipoproteine (lipidi), fosfoproteine (fosfati), cromoproteine (gruppo protesico pigmentato). Emoglobina: è una cromoproteina che trasporta l’ossigeno e contiene un cofattore eme contenente ferro che fa apparire rosso il sangue ossigenato.

Enzimi

Proteina capace di catalizzare una reazione biochimica. Sono catalizzatori biologici. Vengono denominati di solito con il nome della sostanza su cui agiscono, con l'aggiunta del suffisso -asi. Il substrato si lega al sito attivo dell’enzima dove avviene la reazione (meccanismo chiave-serratura). L’inibizione competitiva (legame altra molecola al sito attivo) e non competitiva (legame al sito allosterico) regola l’attività enzimatica.

Proteine strutturali

Nel mondo animale le funzioni di sostegno sono espletate da proteine strutturali che sono in prevalenza proteine fibrose.

Collagene

È una proteina fibrosa, la principale del tessuto connettivo negli animali. Nell’uomo costituisce circa il 6% del peso corporeo. La più stabile disposizione e riarrangiamento del collagene è quella della tripla elica. Ha funzioni strutturali, meccaniche, di regolazione della permeabilità dei vasi e dell’epitelio. Il collagene è sintetizzato dai fibroblasti in forma di protocollagene, triple eliche individuali con sequenze terminali (telopeptidi) che impediscano l’aggregazione delle triple eliche. Trasportato all’esterno della cellula, il protocollagene viene convertito in tropocollagene, unità base del collagene, formato da sequenze lunghe 260nm in tripla elica. Il tropocollagene è formata dalla successione di più di 300 triplette, gruppi di tre aminoacidi [glicina-X-Y]_n, con X e Y di solito prolina e idrossiprolina. Il tropocollagene si aggrega in fibrille di 20-40 nm di diametro che si aggregano in fasci di fibre di 0,2-0,4 micron. La tripla elica è stabilizzata da legami H, ponti di reticolazione (lisina), interazione fra gruppi carichi.

• Collagene tipo I: forma di collagene interstiziale, fibre strutturali di ossa, dentina, tendine
• Collagene tipo II: cartilagine
• Collagene tipo III: polmoni, vasi sanguigni
• Collagene tipo IV: membrana basale di cellule epiteliali ed endoteliali
• Altri tipi di collagene (V in poi) sono più rari e si trovano in quantità residuali in cartilagine, tessuto cardiovascolare e matrice extracellulare (ECM)

Le proprietà chimico-fisiche del collagene dipendono dal tessuto di origine (fonte), dalla tipologia e da eventuali modifiche chimiche (es reticolazione).

• Biocompatibilità
• Degradabilità
• Prodotti di degradazione ben tollerati
• Riconoscimento ed attivazione cellulare
• Possibilità di modifiche chimiche
• Diverse tipologie disponibili
• Ottenibili in diverse forme

Elastina

Elastina: è una proteina strutturale, dotata di notevole elasticità (bioelastomero), presente nei tessuti animali elastici quali pelle, legamenti, pareti dei vasi sanguigni. Contiene glicina, alanina, valina, prolina. Contiene circa il 5% di amminoacidi con gruppi R carichi per cui le interazioni fra le molecole proteiche sono deboli (elastomericità e resistenza alle alte temperature). In presenza di lisil ossidasi e ioni rame la lisina crea reticolazioni che ne aumentano l’elasticità. È formata da molte molecole di tropoelastina ad alfa-elica, idrosolubile e con massa molecolare di circa 60 kDa, legate da legame covalente formatosi in seguito a reazione catalizzata da lisil ossidasi. Utilizzata in fogli, gel, spugne, nanocompositi.

Fibroina

Fibroina: è una proteina fibrosa ottenuta dalla seta. È dotata di elevatissime proprietà meccaniche (filamento, film, polvere, gel, membrane). I filamenti di seta grezza si ottengono da ragni o bachi tra cui Bombyx mori. È formata da catene polipeptidiche di circa 1000 residui amminoacidici che variano a seconda dell’origine della seta. La fibroina prodotta da Bombyx mori è formata da catene polipeptidiche di glicina, serina, alanina, tirosina ed altri amminoacidi minori. La fibroina esiste in diverse forme cristalline, tra cui silk 1, instabile ed insolubile in acqua, e silk 2, stabile e solubile in acqua, che si interconvertono spontaneamente. Utilizzata per fili di sutura.

Cheratina

Cheratina: l’alfa-cheratina costituisce il peso secco di unghie, corna, capelli, lana. È il principale costituente dell’epidermide cui conferisce l’impermeabilizzazione. La differenza tra la rigidezza e la flessibilità assunta nei diversi distretti corporei dipende dal numero di ponti disolfuro che insieme ad altri tipi di interazioni, ne stabilizza la struttura.

Colla di fibrina

Si ottiene ricapitolando in vitro le ultime fasi della coagulazione ematica. Commercialmente si trova come sistema bicomponente composto rispettivamente da:

1. Fibrinogeno umano liofilizzato in concentrazione decine di volte superiore alla fisiologica con fattore XIII, fibronectina e aprotinina