Appunti di Biofisica di membrana ed elettrofisiologia

Biofisica di membrana

La diffusione

Perché parlare di diffusione? Perché è una proprietà fisica fondamentale di tutti i sistemi biologici ed è un motore attraverso cui le cellule generano segnali.

Esempi

• I flussi diffusionali permettono all'ossigeno e ai nutrienti di arrivare alle cellule dei vari tessuti.
• La genesi del potenziale d'azione è prodotta dalla diffusione di ioni Na nel neurone.
• La trasmissione sinaptica avviene per diffusione di neurotrasmettitori dalla pre- alla postsinapsi.
• La velocità di diffusione di un farmaco nell'organismo è importante per la determinazione del giusto dosaggio.

Cosa spinge le particelle a diffondere?

"La diffusione è il movimento molecolare generato dall'energia termica: moti browniani" (A. Einstein).

Energia termica = kT, dove:

• k = 1,38 × 10^-23 J/K, cioè è la costante di Boltzmann.
• T è la temperatura assoluta.

N.B.: PV = NkT, dove N è il numero di Avogadro e R è la costante dei gas perfetti.

Se c'è diffusione c'è un flusso

Flusso molare monodirezionale = quantità in moli di soluto che attraversa un'area unitaria nell'unità di tempo: f = (n mol)/(A × T), dove n = numero di molecole del soluto, N = numero di Avogadro, A = area, T = tempo.

Flusso netto

F = f_{1 → 2} - f_{2 → 1}

Relazione tra particelle, spazio e tempo

Facciamo l'esempio di una goccia di colore in acqua: consideriamo un'area e misuriamo quante molecole ci sono (→ la concentrazione!), poi facciamo lo stesso con un'area più esterna e così via. Possiamo fare una curva della concentrazione in base allo spazio, che è una curva decrescente la cui pendenza in ogni punto è l'intensità del flusso in quel punto, che è proporzionale al gradiente di concentrazione:

Il flusso è proporzionale alla variazione della concentrazione nello spazio:

F ∝ -d[C]/dx

Prima legge di Fick

La costante di proporzionalità che trasforma questa proporzione in un'equazione è D, il coefficiente di diffusione:

F = -D d[C]/dx

Dove il segno negativo indica che la curva è decrescente. Questa è la prima Legge di Fick e ci dice come varia il flusso in base a concentrazione e distanza. L'unità di misura di D è cm²/sec.

Tuttavia, la diffusione non è solo spazio-dipendente, ma anche tempo-dipendente, e in un certo tempo le particelle si distribuiscono in modo omogeneo. La diffusione è un processo dinamico, nello spazio e nel tempo.

Seconda legge di Fick

Sappiamo che la variazione della concentrazione nel tempo è data dalla variazione del flusso nello spazio, cioè:

d[C]/dt = -dF/dx

E mettendola in relazione con la prima legge di Fick si ottiene una differenziale che è la seconda legge di Fick o l'equazione della diffusione:

∂[C]/∂t = D ∂²[C]/∂x²

Il tempo necessario perché ad una certa distanza dalla sorgente della diffusione la concentrazione del soluto raggiunga un certo livello cresce col quadrato della distanza.

Condizioni di risoluzione dell'equazione

• Una condizione iniziale: a t=0 le N₀ particelle sono concentrate nell'area A.
• Due condizioni al contorno: la concentrazione è finita ovunque e il numero di particelle è costante.

Sotto queste condizioni la soluzione è:

N₀/√(4πDt) e^-x2/4Dt

Data la distribuzione normale, forma una curva gaussiana che mostra il profilo spaziale della concentrazione a un tempo fisso. A tempi diversi si possono creare curve diverse che mostrano profili spaziali molto diversi. Sono tutte curve discendenti, ma mano a mano sempre più simili ad una retta parallela all'asse delle ascisse, e questo perché le particelle sono diffuse e la concentrazione si avvicina all'uniformità in tutta la soluzione. [C] non varia più in dx.

I fenomeni diffusivi attraverso una membrana

Consideriamo la prima legge di Fick nella diffusione attraverso una membrana: c'è un flusso netto dalla zona di maggior concentrazione a quella di minor concentrazione.

d[C]/dx ∝ ΔC/d

Il flusso è proporzionale al gradiente di concentrazione che dipende anche dalla mobilità del soluto, cioè dalla costante di diffusione (K_d).

Considerando questa versione della legge di Fick, che relazione c'è tra flusso e concentrazione?

F = K_d ΔC/d

È una retta il cui coefficiente angolare è K_d, e in base a quest’equazione posso costruire un grafico F/ΔC che consiste in una retta passante per l'origine ed è la rappresentazione di un esperimento in cui si mettono in atto delle modifiche delle condizioni sperimentali, variando ΔC e conseguentemente F. La retta passa per l'origine perché a ΔC=0 non c'è flusso netto.

Modello di flusso temporale

La concentrazione da una parte della membrana diminuisce e dall'altra aumenta, fino ad arrivare all'equilibrio; da questo punto in poi ci saranno solo fluttuazioni minime.

Se ne può costruire un modello facendo le seguenti assunzioni:

• V_i e V_o sono costanti.
• I bagni sono ben mescolati (→ quando le particelle migrano, in maniera quasi istantanea si distribuiscono in maniera uniforme nel volume in cui migrano).
• La membrana è allo stato stazionario: F = P(c_i - c_o), in cui P è la permeabilità della membrana.
• Vale il principio di conservazione della materia e la membrana è sottile: c_iV_i + c_oV_o = N.

Con queste assunzioni si può creare il seguente modello:

F(t) = P[c_i(t) - c_o(t)]

Le due concentrazioni diventano funzione del tempo!

Con una serie di passaggi algebrici e sostituzioni si può passare da:

F(t) = P[c_i(t) - c_o(t)]

a:

c_i(t) = c_i∞ + (c_i0 - c_i∞)e^-t/τ

Dove:

• c_i∞ = concentrazione allo stato stazionario.
• c_i0 = concentrazione al tempo iniziale.
• τ = tempo in corrispondenza del quale la concentrazione c_i del soluto è scesa al 63% del suo valore iniziale e c_o è al 37% del suo valore finale.

Soluti che attraversano il bilayer lipidico

• Gas disciolti nell'atmosfera.
• Piccole molecole polari non cariche come metanolo e glicerolo.
• Non possono: acqua, glucosio, ioni, molecole polari cariche. Ci vogliono proteine di trasporto.

Caratteristiche del trasporto mediato

• Specificità del carrier per il substrato.
• I carriers sono soggetti a saturazione.
• Possono venir bloccati da inibitori competitivi.
• Hanno un'elevata dipendenza termica (per le variazioni dell'energia cinetica delle molecole: più è alta e più probabilità ha il substrato di incontrare il sito attivo del carrier) e dal pH (cambiando la carica degli amminoacidi costituenti il carrier posso comprometterne la capacità di legare il substrato o causarne il misfolding).

I carrier hanno le caratteristiche degli enzimi:

• Catalizzano il passaggio del substrato da un lato all'altro della membrana.
• Legano il substrato selettivamente.
• Cambiano conformazione per rilasciare il substrato.
• Ritornano alla conformazione iniziale per legare un altro substrato.
• Seguono una cinetica di tipo Michaelis-Menten.

Il trasporto attivo

Il trasporto attivo è un processo saturante e non segue la prima legge di Fick! Invece segue la seguente equazione del tipo Michaelis-Menten:

F = v_max[S]/(K_a + [S])

Perché è un processo saturante?

• Perché c'è un numero finito di carrier.
• Perché ogni carrier opera ad una velocità finita.

Esempio numerico

Consideriamo una membrana con un solo carrier e con una velocità di trasporto massima di 50 particelle/sec:

Se c'è una sola particella di soluto da trasportare, la velocità sarà di 1 part./sec, se ce ne sono 10, di 10 part./sec. Ma se si parla di numeri maggiori o uguali a 50 particelle, la velocità sarà sempre di 50 part./sec e si assisterà ad un accumulo di substrato.

N.B.: se in membrana ci fossero 100 carriers con questa velocità di trasporto, basterebbe moltiplicare la velocità per 100.

Domanda

Se distruggo o blocco irreversibilmente la metà dei carriers di membrana, F_max rimane inalterato, aumenta o diminuisce? Diminuisce: infatti è la velocità operativa di ogni carrier che viene moltiplicata per il numero di carrier sull'area che dà il flusso massimo (v × n_carrier = F_max). Infatti, F_max ci dà l'idea del numero di trasportatori e una membrana che ha un flusso massimo maggiore evidentemente avrà più trasportatori, e viceversa.

Sempre dimezzando il numero di trasportatori... Cosa succede alla K_a? Niente, perché i trasportatori rimanenti continuano a funzionare come prima, la loro affinità non cambia.

Ottenimento dei dati del grafico

Come vengono ottenuti i dati del grafico che mette in relazione flusso e concentrazione?

Prendiamo una provetta con una sospensione cellulare e vi introduciamo una quantità 1 di substrato marcato o radioattivo, ottenendo una concentrazione C₁. A questo punto a tempi diversi estraggo un campione di cellule e ne misuro la quantità di substrato, dopo averle accuratamente sciacquate. Eseguendo la procedura in tempi diversi si può ottenere un grafico della variazione della concentrazione di substrato interno nel tempo. Il risultato è una curva che nella prima fase è approssimabile ad una retta, e quindi ad un andamento esponenziale. La pendenza di questa retta è la velocità di trasporto v₁ relativa alla concentrazione C₁. v₁ è un parametro cinetico.

∆[S]_int/∆t = v₁

Tuttavia, a noi interessa conoscere il flusso, non la velocità! Ma bisogna notare una cosa:

F = n₁ × N/t × A

n₁ mol/ = v₁/t

Per ottenere il flusso basta normalizzare la velocità rispetto all'area di membrana che si prende in considerazione!

F = v₁/A

Quindi non ci rimane che misurare l'area media della cellula singola al microscopio e moltiplicarla per il numero di cellule che stiamo considerando, come fosse l'area di un'unica grande cellula, e mettere questo valore nell'equazione.

Otteniamo il valore di flusso per C₁ e possiamo metterlo come primo valore del grafico. Ripetendo l'esperimento per concentrazioni diverse si può ottenere:

Inibitori competitivi

I carriers possono essere soggetti a inibizione competitiva ed i competitori possono rallentarne la cinetica facendone variare la K_a (costante di affinità).

N.B.: gli inibitori competitivi NON variano F_max!

Come funziona un inibitore competitivo? Funziona competendo col substrato per il sito attivo del carrier. Tuttavia, se la concentrazione del substrato è alta, la curva tende comunque a raggiungere F_max:

Ovviamente, quando la [S]<<[I_c], la probabilità che il substrato incontri il sito attivo e che questo sia libero si abbassa notevolmente, ma man mano che [S] si alza questa probabilità si riavvicina a 1.

La formula è la seguente:

P_s = [S]/([S] + [I_c])

Dove P_s è la probabilità di legame del substrato in presenza di una quantità fissa di inibitore competitivo.

Esempio numerico

N.B.: questo è un grafico in scala semilogaritmica! Infatti, se il range di concentrazioni è molto ampio conviene metterlo in scala logaritmica e lasciare il flusso in scala lineare. La curva che si ottiene così è una sigmoide, ma questo è dovuto unicamente al fatto che la scala è semilogaritmica: se la scala fosse lineare sarebbe un'iperbole.

Che cos'è la K_a?

È quel valore di concentrazione a cui il flusso è la metà del flusso massimo. La K_a è inversamente proporzionale all'affinità del carrier per il substrato. Infatti, se c’è tanto I_c la K_a aumenta: è come se aggiungendo I_c si abbassasse l'affinità del carrier per il substrato.

Un flusso di particelle cariche in un campo elettrico

Se mettiamo del KCl in acqua, questo si dissocia in K⁺ e Cl^- e questi si distribuiscono in modo uniforme nella soluzione... Ma se creiamo un campo elettrico il K⁺ si sposta verso il polo negativo e il Cl^- verso quello positivo. C'è un flusso di anioni e cationi che si sposta nello spazio proporzionalmente alla variazione della differenza di potenziale:

F ∝ -ΔV/dx

Dove dx rappresenta la pendenza del gradiente elettrico. Questa proporzionalità corrisponde a:

F = zeK_eΔV

Dove z è la valenza dello ione e K_e è una costante di proporzionalità che dipende dalla mobilità degli elettroni in acqua e dalla concentrazione del soluto.

Attenzione!

Questa è un'altra formulazione della Legge di Ohm:

ΔV = IR

Dove:

• I corrisponde al flusso di ioni.
• 1/R corrisponde a K_e: dato che K_e dipende dal grado di mobilità degli elettroni in acqua, si può dire che dipende dalla resistenza che incontra il soluto nella sua migrazione attraverso il solvente.

K_e è proporzionale alla conduttanza. Inoltre, maggiore è K_e, minore è la resistenza del mezzo acquoso al movimento. La differenza di cariche (Δq) ai lati della membrana, ovvero ΔV, influenza il movimento degli ioni. Ovviamente, il gradiente di concentrazione e il gradiente elettrico possono essere concordi o discordi.

Equazione di Nernst-Plank

Il flusso degli ioni dipende dal gradiente elettrochimico e le leggi di Fick e Ohm vanno combinate. Il risultato è l'equazione di Nernst-Plank:

F_i = k_idC/dx + k_edV/dx

Equazione di Nernst

L'equazione di Nernst permette di calcolare il potenziale di equilibrio a cavallo della membrana, ricavandola a partire dalla legge di distribuzione di Boltzmann.

Immaginiamo una popolazione omogenea di particelle (es. glucosio): generalmente si pensa che abbiano tutte la stessa energia, ma in realtà possono essere su livelli energetici differenti, e proprio in base a questa energia possiamo catalogarli e costruire il seguente grafico:

• u è l'energia.
• N_u/N è il rapporto tra le particelle ad un dato livello energetico ed il totale delle particelle considerate: è la probabilità di avere delle particelle di energia u.
• T₁ e T₂ sono temperature diverse, in cui T₁ < T₂.

L'equazione che mette in relazione il numero di particelle ad un dato livello energetico con quel livello energetico è:

N_u/N = e^-u/RT

E' una legge sperimentale che rappresenta il numero di particelle N_u che possiedono una certa energia, in funzione dell'energia stessa u: cioè ad ogni valore di energia (a una data T) corrisponde un numero definito di particelle con quella energia. A T₁ < T₂ la maggior parte delle molecole è distribuita in un intervallo più ridotto di u: poche molecole perciò potranno avere u sufficiente per superare una stabilita barriera energetica. All'aumentare della T₂ (curva T₂) aumenta il numero di molecole con u sufficiente, perciò aumenta la velocità della reazione. Le aree sottese dalle due curve sono eguali poiché rappresentano lo stesso numero totale di molecole N.

Relazione tra i due stati energetici

Ora mettiamo in relazione la probabilità di una particella di trovarsi in uno dei due stati energetici 1 e 2 con la differenza energetica tra i due stati:

P₁/P₂ = e^-Δu/kT

• P₂ è la probabilità di trovarsi al livello energetico 2 e P₁ all’1.
• K è la costante di Boltzmann.