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Appunti di Biofisica di membrana ed elettrofisiologia

Appunti di Biofisica di membrana e elettrofisiologia basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni del prof. Tonelli dell’università degli Studi di Scienze matematiche fisiche e naturali. Scarica il file in formato PDF! Con questi appunti ho preso 30 e lode.

Esame di Biofisica di membrana e elettrofisiologia docente Prof. M. Toselli

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ESTRATTO DOCUMENTO

τ è indice del tempo necessario alla membrana per caricarsi, visto che è un

condensatore anche sull’assone.

τ C

=R m m

λ ρ

Dove ρ è il raggio assonico.

La velocità aumenta con l’aumentare del raggio della fibra.

Questo è importante perché non tutte le fibre hanno lo stesso diametro e

quindi non tutte conducono allo stesso modo.

È un metodo di regolazione a lunghissimo termine!

Nei vertebrati molte fibre sono rivestite da mielina, sostanza dovuta alla

presenza degli oligodendrociti, i quali emettono estroflessioni che si

avvolgono intorno alla fibra nervosa generando dei veri e propri manicotti di

mielina. La fibra nervosa è avvolta a tratti e i tratti scoperti sono detti nodi di

Ranvier: sono le zone amieliniche della fibra e in essi si concentrano i canali

voltaggio dipendenti.

Nelle zone mielinizzate non si può generare il segnale e quindi c’è una

 conduzione saltatoria, da un nodo di Ranvier all’altro.

Quando arriva uno stimolo su un nodo si Ranvier si genera un PA che si

propaga alla zona mielinizzata, dove avverrà un certo decadimento... Però

non è un decadimento poi così drastico, quindi quando il segnale arriva al

nodo di Ranvier successivo, mediamente arriva ancora sopra soglia ed evoca

un nuovo PA.

A parità di diametro il PA si propaga più velocemente nella fibra mielinica che

in una mielinica. Perché? Basta pensare a come cambia λ. Infatti:

√ r m

λ= r a

Dove r è la resistenza di membrana e r la resistenza assonale. Ebbene, r

m a a

rimane invariata in entrambi i tipi cellulari, mentre r aumenta moltissimo nelle

m

fibre mieliniche perché la mielina è un isolante!

Nelle fibre mieliniche λ è più alta e dunque anche v!

Inoltre nelle fibre mielinizzate abbiamo un indice di metabolismo cellulare più

basso perché ci sarà una minore produzione di canali voltaggio dipendenti.

Cosa succede se si verifica una perdita di mielina?

Se la demielinizzazione è intensa, il trasferimento del PA ci sarà ma con

molto ritardo.

Rallentamento della velocità di propagazione.

Se la demielinizzazione è molto intensa, invece, la propagazione mancherà

proprio: non ci sarà trasferimento del PA lungo la fibra assonica.

Nessuna propagazione del segnale.

Un esempio di malattia in cui si ha demielinizzazione è la sclerosi multipla,

una malattia che investe il sistema nervoso centrale e porta alla perdita di

oligodendrociti (N.B.: nell’SNP i neuroni sono mielinizzati dalle cellule si

Schwann). Se la demielinizzazione è vistosa, i neuroni saranno K.O. e non

potranno propagare il segnale che gli compete.

Modello di gating dei canali ionici

Particella di gating = porzione del canale che modifica la sua conformazione

e la fa modificare a tutto il canale, facendolo passare dallo stato chiuso allo

stato aperto.

Le particelle di gating agiscono con una distribuzione di Boltzmann.

Immaginiamo un sistema con due stati (-> due conformazioni) dovuti al

movimento di una particella di gating: una variazione del campo elettrico di

membrana può causare un movimento della particella di gating che fa

passare il canale da uno stato 1 ad uno stato 2 reversibilmente. Questo

significa che tra i due stati c’è una sola barriera energetica:

Le posizioni 1 e 2 sono i minimi del profilo

energetico e sono separati da una barriera che

va superata per passare da una

conformazione all’altra. La conformazione più

probabile è la 2 perché il livello energetico è

più basso.

Se c’è una popolazione di N canali, se abbiamo n canali nello stato

 1

1 ed n canali nello stato 2, n +n =N.

2 1 2

L’equazione di Boltzmann mette in relazione le probabilità di trovarsi nello

stato 1 o 2 con la differenza di energia trai due stati, ΔU:

( )

−u −u

P particelle nello stato 2] 2 1

[

2 kT

= =e

P particelle nello stato1]

[

1

Bisogna notare che il rapporto tra le probabilità è il rapporto tra le

concentrazioni di prodotti e reagenti, quindi è la costante di equilibrio della

reazione. Il ΔU è la variazione di energia libera relativa al cambiamento

conformazionale, che si esplica in variazioni nei legami H, nei ponti salini e in

altri tipi di legami deboli.

Proviamo ad applicare tutto questo a un canale ionico voltaggio dipendente

nel caso in cui la ddp transmembranaria è zero, cioè quando non c’è un

potenziale elettrico ad influenzare le particelle di gating:

( )

−u −u w

( )

n 2 1

2 kT kT

=e =e

n 1

Dove w è il lavoro chimico che deve essere eseguito per muovere la

particella di gating dalla conformazione 1 alla conformazione 2 ed è espresso

come una variazione di energia libera o di potenziale chimico (-> energia

libera molare).

Ma cosa succede quando il campo elettrico è diverso da zero? Il

cambiamento conformazionale è provocato dal fatto che c’è un’altra forza in

gioco, il campo elettrico zeV, dove z è la valenza della particella di gating, V il

potenziale di membrana ed e la carica elementare dell’elettrone.

w+ zeV

( )

n

2 kT

=e

n

1

Visto che parliamo di canali voltaggio dipendenti ci interessa sapere la

probabilità di trovarli aperti a diversi potenziali, quindi:

n 1

2

P = =

o zeV

n −w+

+n

1 2 kT

1+e

Notare che w+zeV è il potenziale o lavoro elettrochimico e che il termine

zeV

−w + ci dice come alla variazione di V varierà la probabilità di trovare il

kT

canale aperto. w

V =

Ora poniamo , cioè: il punto in cui il canale ha la stessa probabilità di

1 ze

2 V 1

essere nello stato chiuso o nello stato aperto ( ) è dato dal rapporto tra il

2

lavoro chimico e il lavoro elettrico che servono per compiere la transizione da

uno stato all’altro. Ponendo questo si ha che:

1

P =

o ( )

V

−ze −V

( )

1

2

kT

1+ e

Infatti se poniamo P =1/2 abbiamo

o

1 1

P = =

o 2

zeV

( )

−w+

kT

1+e

Quindi: zeV

( )

−w+

kT

1+e =2

zeV

( )

−w+

kT

e =1

E dato che il ln1=0

zeV

−w + =0

kT

w+ zeV =0

Quindi infine:

−w

V = ze 1

P =

o ( )

V

−ze −V

( )

1 è l’equazione di una sigmoide, la cui curvatura si modifica

2

kT

1+ e

a seconda del numero di particelle di gating/cariche elettriche presenti nel

canale: più ce n’è, più la pendenza sarà ripida:

Maggiore è il numero delle particelle di gating,

quindi, maggiore è la voltaggio dipendenza. Se il

numero è zero, il canale non è voltaggio

dipendente e la curva si trasforma in una retta

parallela all’asse delle ascisse. Il range di

potenziali a cui un canale si apre si restringe a con

l’aumentare del numero di particelle presenti.

Se invece di mettere in ordinata P ci metto lnP

o o

ottengo un grafico di questo tipo. La pendenza

della parte rettilinea è z, cioè la valenza della

particella di gating.

Hodgkin e Huxley avevano fatto un grafico di questo tipo,

interpolando i grafici delle conduttanze ottenute

sperimentalmente coi logaritmi della P e così hanno ricavato z,

o

cioè la quantità di carica presente nella particella di gating

dell’intera popolazione di canali che stavano studiando,

per sodio e potassio:

A 0mV l’attività del canale è caratterizzata dalla relativa stabilità dello stato

attivato (aperto) rispetto a quello disattivato (chiuso).

In assenza di un campo elettrico è favorito lo stato aperto.

Infatti, prendendo nuovamente in considerazione il profilo energetico, si ha

che il potenziale elettrochimico dello stato chiuso μ è maggiore rispetto a

(c)

quello dello stato aperto μ :

(a) Dove μ è il lavoro chimico necessario per

0

passare da una conformazione all’altra in

assenza di un campo elettrico, ed è uguale al

potenziale di quel determinato stato perché

non influisce il potenziale elettrico. In queste

condizioni si ha che

μ F ×0mV=0

=z G

(GATE )

Il potenziale elettrochimico si identifica coi soli potenziali chimici, .

Δμ

 0

μ =μ +μ

Infatti, normalmente si ha che , ma qui è

μ

o chiuso) 0

(statoaperto (GATE) (GATE)

zero. Questo è importante, perché la distribuzione di Boltzmann si basa

solo sul potenziale chimico .

μ

0

Questo a 0mV... Ma cosa succede a -70mV, cioè quando l’interno è più

negativo dell’esterno di -70mV? L’attività del canale è caratterizzata dalla

stabilità dello stato chiuso in dipendenza dalla posizione delle cariche rispetto

al campo elettrico. A questo punto ci sono due possibilità:

• Se la

particella di gating si trova sul lato extracellulare (stato aperto), dove il

μ F 0mV

( )=0

=z

potenziale di membrana sarà zero, si avrà che .

G

(GATE )

• Se la

particella di gating si trova sul lato intracellulare (stato chiuso), invece, si

μ F × 0

(−70mV )<

=z

avrà che G

(GATE )

N.B.: F è la costante di Faraday, che corrisponde alla carica elettrica di una

mole di elettroni, per questo sostituisce e.

Ora, μ è corrisponde alla variazione di energia libera...

• ΔG<0

• Questo stato è termodinamicamente favorito e stabilizzato, mentre lo

stato aperto è destabilizzato.

Come si dimostra matematicamente che è favorito proprio lo stato chiuso?

1 1

=

n 1

zeV

( )

−w+

2

P = =¿ 1+

kT

1+ e

o n +n w+zeV

( )

1 2 kT

e

Cioè: w+ zeV

( )

kT

Se diminuisce w+zeV diminuisce e

 1

w+ zeV

( )

Aumenta

 kT

e

Aumenta il denominatore

 Diminuisce P

 o

Più probabile la chiusura.

 (questa dimostrazione l’ho fatta io, chiedere conferma)

Quindi a -70 si ha: μ F 0mV

( )=0

=z

E a +40mV? All’esterno (stato aperto) si avrà , mentre

G

(GATE )

μ F 0

(−40mV )>

=z

all’interno (stato chiuso) .

G

(GATE ) 

ΔG>0

Un potenziale positivo è destabilizzante

per lo stato chiuso e stabilizzante per lo

Come fa il voltaggio ad aprire i canali?

I canali ionici voltaggio dipendenti sono costituiti da quattro subunità, ognuna

con 6 domini transmembrana:

Il tratto H5 di ogni subunità non

attraversa completamente la

membrana e quando le quattro

subunità sono assemblate forma

il canale. Il segmento S4 è il sensore del voltaggio e presenta una serie di

amminoacidi carichi.

+

I canali per K sono costituiti da quattro subunità separate, mentre per Na+ e

2+

Ca si tratta di pseudosubunità legate da loop intracellulari.

Tuttavia, se è vera la storia della particella di gating, oltre alla corrente ionica

transmembranaria dovremmo registrare anche una corrente di gating data

dallo spostamento delle cariche (->degli amminoacidi) da un lato all’altro della

membrana... però è una corrente così piccola (≈10pA, forse) che viene

mascherata dalla corrente transmembranaria (≈1000pA). Come fare a

+

vederla? Bisogna usare soluzioni prive di K , così si registra solo la corrente

di gating: dq g

I = , cioè la corrente di gating

g dt

A questo punto si può calcolare corrisponde alla variazione della quantità

l’area sottesa dalla curva e trovare di carica della particella di gating nel

la carica totale di gating, dalla quale si può risalire alle cariche elementari per

canale:

q I dt

=

g g

caricatotale di gating elementari per canale

=cariche

numero dei canali

Studi fatti da Besauilla, Armstrong, Keyns e Rhodias riportano le misurazioni

di I .

g

Ma cosa succede al segmento S4? Contiene sette residui basici distribuiti in

modo regolare sull’α-elica del segmento stesso, principalmente arginine

(positive a pH cellulare). Quando il canale è chiuso la II arginina è sepolta

nel bilayer, ma quando il canale si apre questa subisce un’attrazione

elettrostatica da parte dell’eccesso di cariche negative sul lato extracellulare

+

(infatti i canali K si aprono in depolarizzazione).

L’intera porzione della proteina di muove e, dato che il canale è una

 proteina allosterica, questo si ripercuote sul nostro canale, che si apre.

Questo è un modello che prevede un movimento a cavatappi, con il

segmento S4 che subisce una rotazione con uno spostamento verso l’alto.

Tuttavia il modello è stato in seguito modificato. Infatti McKinnon ha valutato

l’influenza di singoli amminoacidi sul cambiamento conformazionale del

canale tramite mutazioni puntiformi ed ha visto che alcune di queste

mutazioni portavano a variazioni catastrofiche sulla funzionalità del canale. In

seguito a queste osservazioni, ha concluso che gli S4 non si muovono in

modo rotatorio, bensì come le palette di un remo. In aggiunta al movimento

della “paletta sensore del voltaggio", nello stato aperto si nota la formazione

di un ponte salino (legame ionico) tra l’Asp 80 e l’Arg 133.

N.B.: Per ogni canale ci sono 4 S4: l’apertura comincia col movimento

di uno, che poi influenza gli altri tre.

La permeabilità agli ioni

I canali sono selettivi: un La conduttanza di singolo canale, γ, è il

canale cationico non farà rapporto tra la corrente e la driving force:

passare un anione ed uno I

γ = . La relazione tra γ e la

anionico non farà passare un V −E

catione. Alcuni sono anche concentrazione dello ione è un’iperbole (-

selettivi per un solo tipo ionico. >saturabile). γ è la conduttanza massima, k

max i

è la concentrazione ionica a cui si ha la metà

dell’effetto massimo (come v per gli enzimi)

max

ed è inversamente proporzionale all’affinità per

Perché? Perché i cationi formano dei legami di coordinazione coi residui

-

COO delle cosiddette regioni P, che formano il filtro di selettività. Questo

naturalmente è impossibile agli anioni, che naturalmente vengono respinti.

Questo spiega anche perché il flusso di ioni attraverso i canali è saturante.

E’ una relazione di tipo Michaelis-Menten.

 Lo ione non può semplicemente attraversare il canale, deve creare dei

 legami al suo interno.

Modello della barriera attraente/saturante con un unico sito di

 legame:

k k

1 2

X Xi X

+i +i

→ →

o i

← ←

k k

−1 −2

Dove i è lo ione all’esterno e all’interno, X è il canale col suo sito di legame ed

ogni reazione ha la sua costante di velocità. E’ una reazione chimica a tre

stati con quattro costanti di velocità ed una cinetica di II ordine.

Tra la corrente ionica, la concentrazione intracellulare ed extracellulare

 e le costanti di velocità c’è questa relazione:

k k k

[i ] −k [i ]

i 1 2 o

−1 −2

I =zF k k k

+k + [i ] + [i]

2 1 o i

−1 −2

(In pratica è il rapporto tra i flussi totali tra esterno e interno e viceversa e i

flussi che portano verso l’intermedio)

Se all’inizio la concentrazione intracellulare [i] =0 si ha:

i

k 2

I =−zF 1+ k k

( )

+ 2

−1

[ ]

k i o

1

L’equazione qui sopra è identica all’equazione corrispondente a Michaelis-

Menten:

I max

I = k i

1+ [i]

o

In cui I è la corrente saturante. Infatti, se la corrente è particolarmente alta

max [ ]

k i

significa che è molto grande e quindi il denominatore tende a zero.

o

1 I k

=zF

Conseguentemente k rimane tale e posso considerare . Infatti:

max 2

2

lim I k ≡ I

⇔−zF 2 max

→ ∞

[i ]

o La corrente I è funzione della corrente saturante e della concentrazione

 dello ione.

A questo punto, dato che la legge di Ohm dice che G=I/V, io posso

calcolare la conduttanza di singolo canale dividendo la corrente massima

per la driving force:

γ max

γ = k i

1+ [i ] o N.B.: I valori di concentrazione a cui si saturano i canali sono

molto lontani da quelli fisiologici, ma saperli è importante

perché ci danno delle informazioni su come lo ione

attraversa il canale: deve formare dei legami, non passa

come in soluzione.

La selettività per uno ione è data da una combinazione di diversi fattori:

• Presenz

a di cariche fisse di intensità e densità specifiche sulla parete interna

- + +

del canale (i COO per Na e K ).

• Raggio

anidro: in soluzione uno ione ha un cappotto di solvatazione perché

l’H O ha delle cariche parziali.

2 E’

importante capire che raggio ha lo ione quando è senza

molecole d’acqua.

• Grado di idratazione dello ione. Raggio

quando è idratato.

Gli ioni per attraversare il canale devono essere disidratati dal filtro di

selettività: i quattro legami di coordinazione si possono formare solo se lo

ione si spoglia delle

molecole d’acqua che lo Quello che è davvero importante è la stericità: le

circondano: dimensioni dello ione devono combaciare

perfettamente con il poro del filtro di selettività.

N.B.: Sono cariche parziali negative!

I legami sono attrazioni elettrostatiche.

 +

C’è un problema! I canali per il K hanno pori più ampi rispetto a quelli per gli

+ + +

Na , tuttavia favoriscono il passaggio di K e non di Na . Perché? Perché il

+

K , avendo un diametro simile a quello del poro, riesce a formare i quattro

+

legami di coordinazione, mentre il Na , che è troppo piccoli, non riesce. Si ha

la seguente situazione:

↔ COONa+ H O

−¿ 2

¿

O+COO

+¿−H 2 ¿

Na

Tuttavia la reazione non è all’equilibrio: per uno ione delle giuste dimensioni

si sposta verso Le molecole per poter reagire devono essere nell’optimum.

destra: Se sono più distanti non reagiscono, se sono più vicine i

+

nuclei si respingono. Ma come fa uno ione come il K a

formare questi legami e a diffondere attraverso il canale

quasi altrettanto rapidamente di come farebbe nel

+

distacco del K dal canale? I legami di coordinazione possono formarsi a vari

livelli del canale, quindi c’è più di uno ione legato all’interno del poro.

+

I K si respingono elettrostaticamente tra di loro e se la repulsione è

 superiore alla forza dei legami di coordinazione avviene il distacco.

+

Ma perché il K entra nel citoplasma invece di uscirne? Cioè... Dopo il

distacco qual è la direzione che prevale? Quella del gradiente elettrochimico:

nel citoplasma la concentrazione è inferiore rispetto a quella nel poro e in più

nel poro c’è la repulsione elettrica. Ovviamente se il gradiente non c’è il flusso

netto è zero.

Tutto questo fitta molto bene con certi canali, ma ce ne sono altri, soprattutto

cationici, che, sì, ok, non fanno passare gli anioni, ma non sono poi molto

selettivi con i cationi. Ad esempio il canale nicotinico per l’acetilcolina è così:

ha 5 subunità ed un poro più grande del normale; inoltre a livello del filtro di

selettività c’è una diversa disposizione delle cariche, con tre anelli di

glutammato e aspartato, carichi negativamente, formanti un poro che

respinge gli anioni... Ma il passaggio attraverso questo poro non richiede

+ +

legami di coordinazione, perciò possono passare anche K e Na , solvatati.

Tuttavia quando questo canale si apre c’è una depolarizzazione per la

+ +

prevalenza di entrata di Na sull’uscita di K .

+

Canali per il K +

Quella dei canali per il K è la famiglia più numerosa tra quelle dei canali. La

spiegazione è da ricercare a livello molecolare:

• Hanno 4 subunità transmembranarie distinte e possono quindi essere

omo- o etero tetrameri, anche se non tutte le combinazioni sono

possibili.

• Ogni organismo ha numerosi geni che codificano per le varie subunità.

• Splicing alternativo.

Es. Il gene shaker, in Drosophyla, ha ben 23 esoni, di cui 5 possibili N-

terminali e 2 possibili C-terminali.

Minimo 10 varianti.

• Oltre alla subunità centrale (α), che forma il poro, ci possono essere

altre proteine che possono associarsi ad essa e modificarne il

comportamento (es. SUR, mink, subunità β).

+

Classificando i canali K su basi molecolari ci sono tre categorie:

1. A 6 domini transmembrana (per subunità): il canale è formato da

quattro subunità. Quella dei sei domini transmembrana è una struttura

comune a tutti i canali voltage-dependent, tuttavia nei canali per gli altri

cationi non ci sono vere subunità, ma pseudosubunità. Si suddividono

in: a) K (voltage dependent, come il delayed rectifier e il canale

V

K )

A

b) K/QT (canali cardiaci. Una mutazione causa la sindrome del

long QT)

c) erg 2+

d) SK (Ca dependent)

2+

e) Slo (Ca dependent)

2+

N.B.: i canali Ca dipendenti di queste famiglie sono 2+

indirettamente voltaggio dipendenti se l’aumento di Ca è

dovuto a un VDCC.

2. A 4 domini transmembrana : il canale è un dimero di queste subunità.

Sono canali di leakage e sono responsabili del potenziale di risposo

della cellula.

3. A 2 domini transmembrana : il canale è formato da quattro subunità

così. Sono detti K , inward rectifier, e si dividono in:

IR

a. IRK

b. GIRK: regolati da G-protein.

c. K : lo stato di apertura o chiusura dipende dalla [ATP]

ATP

Inattivazione dei canali

Dopo il delayed rectifier si sono trovati altri canali, alcuni dei quali

inattivavano. Ad esempio il canale K , che tende a inattivare rapidamente. In

A

realtà ci sono diversi tipi e velocità di inattivazione.

Ma come funzionano le gates di inattivazione? Ci sono due modalità:

1) Meccanismo a ball-and-chain: l’estremità NTD di ogni subunità presenta

un loop e poi una sequenza che forma una sorta di sfera. Quando il canale

è chiuso, questa struttura non interagisce col poro. Quando invece viene

aperto, per attrazione elettrostatica la palla, che presenta delle cariche

opposte rispetto a quelle del poro, tende ad entrarvi.

Il canale deve aprirsi prima che avvenga l’inattivazione: C⇔O⇔I.

2) Una subunità accessoria (β) ha un’estremità NTD che presenta una

struttura a ball and chain e chiude il canale con un meccanismo che

ricalca quello appena descritto. Anche qui l’inattivazione avviene solo dopo

l’apertura.

Entrambe sono dette “inattivazione di tipo N” perché avvengono grazie

all’NTD. 2+ +

N.B.: Per i canali per Ca e Na c’è un meccanismo d’inattivazione

simile, ma ciò che determina l’inattivazione è un loop intracellulare

2+

compreso tra due pseudosubunità: per i canali Ca tra le subunità

+

I e II, per i canali al Na tra la III e la IV.

Questa è un’inattivazione veloce (tipica del canale K ) , ma esiste anche

A

un’inattivazione di tipo lento o di tipo C (non in tutti; si pensava fosse

dovuta al CTD, ma non è così). Si è riusciti a scovarla in due modi:

• Accorciando la catena: l’inattivazione diventa più rapida perché la ball

impiega meno tempo a trovare il canale.

• Rimuovendo la “ball”: l’inattivazione scompare e può essere ripristinata

aggiungendo la ball nel citosol. Però a volte rimaneva una forma di

inattivazione almeno 10 volte più lenta: dopo che il canale si apre,

tende comunque a chiudersi per un movimento voltaggio dipendente

del segmento S6, che costituisce il canale. Però è solo un’ipotesi.

Caratteristiche elettrofisiologiche dei canali K A

Confrontiamo il canale K con un canale simile al delayed rectifier ma con

A

una leggera inattivazione:

Quello simile al delayed rectifier si attiva a 0mV ed ha un’inattivazione molto

lenta, mentre K si attiva già a -20mV ed ha già una lievissima ma presente

A

inattivazione. +

Entrambi sono selettivi per K e voltaggio dipendenti, ma K inattiva più

 A

velocemente di un K e inattiva tanto più rapidamente quanto maggiore

V

è la depolarizzazione.

Canali K e PA

A

Se lo stimolo è duraturo nel tempo, anziché un singolo potenziale d’azione se

ne può generare una serie in sequenza: una scarica o un treno di

potenziali d’azione. I PA sono eventi tutto o nulla, pertanto si può associare

ad essi un codice binario:

• 1 -> c’è PA.

• 0 -> Non c’è PA.

Ma come fa un neurone a discriminare tra uno stimolo più intenso ed uno

meno intenso? La discriminazione non è in base all’ampiezza proprio perché i

PA sono eventi tutto o nulla: se un PA c’è, c’è in tutta la sua ampiezza,

indipendentemente dall’ampiezza dello stimolo che l’ha generato.

All’aumentare dell’intensità dello stimolo è la frequenza dei

PA che aumenta!

Nei neuroni il processo di codificazione si realizza

variando la frequenza di scarica al variare dell’intensità dello

stimolo!

Ma cosa determina questa modulazione in frequenza della scarica di PA? In

questo fenomeno sono fondamentali i canali K . Infatti, ogni volta che si apre

A

+

un canale per il K , la membrana tende a iperpolarizzarsi e ci si allontana

dalla soglia per il PA.

I canali K operano da freno voltaggio-dipendente sulla

 A

frequenza di scarica dei PA.

Infatti i canali K hanno una soglia d’attivazione a potenziali piuttosto negativi.

A

Contrastano l’azione depolarizzante dello stimolo.

 come se lo stimolo fosse meno intenso di quanto non sia in

E’ + +

realtà perché gli ioni Na in ingresso e K in uscita si sommano

algebricamente.

Frenano l’insorgere di uno spike.

Però i K inattivano rapidamente, e sempre più velocemente con l’intensità

A

della depolarizzazione: anche se dapprima frenano lo spike, se lo stimolo

perdura lo spike parte.

L’azione frenante è tanto meno intensa quanto più lo stimolo è

 depolarizzante.

Inoltre la loro cinetica di attivazione è molto rapida.

Aumentando la resistenza o la capacità si rende la carica del condensatore

più lenta, riducendole invece si velocizza il processo, mentre la corrente è

ininfluente sulla velocità di carica della membrana. (nel senso che è inutile

aggiungerla perché la velocità non aumenta? Ma se sottraggo ioni utili a

caricare il condensatore con una corrente uscente, non ci si mette di più a

caricarlo?)

Questi canali supplementari, come il K , devono stare nell’emergenza

A

assonica, che non è mielinizzata (-> poca resistenza all’uscita della corrente

dalla cellula) e dove ha inizio il processo di codificazione.

Canali K Ca 2+

Sono canali attivati da Ca intracellulare. Se la membrana viene

2+ 2+

depolarizzata i canali per il Ca si aprono, il Ca esce dagli stores e si lega

2+

ad un sito di binding sul canale K , che si apre. Ovviamente più Ca c’è, più

Ca

canali vengono aperti: infatti i canali K rispecchiano il comportamento dei

Ca

2+

canali Ca da cui dipendono.

relazione I/V dei K rispecchia quella dei K !

La Ca V

In quale fenomeno sono implicati? Nell’adattamento. Nei neuroni

possono esserci due diverse modalità di scarica:

•Scarica tonica : la sua frequenza si mantiene costantemente

proporzionale all’intensità dello stimolo e fintanto che c’è lo stimolo il

neurone continua a scaricare. Agiscono così i neuroni collegati a

nocicettori, nelle vie della sensibilità somatica. Finché c’è il dolore, il

neurone scarica.

•Scarica fasica: la frequenza non è proporzionale all’intensità dello

stimolo: all’inizio c’è una variazione e parte il primo PA, poi l’intensità è

costante e la frequenza dei PA diminuisce fino ad arrivare a zero. Un

esempio sono i neuroni dei recettori termici, a meno che la sensazione di

caldo/freddo non sia dolorifica. Un altro esempio sono i fotocettori,

oppure quelli per la

percezione della

pressione (es. la

percezione dei

vestiti).

Ma come viene generata

una scarica fasica? Oltre

+ +

ai soliti canali per Na e K

devono essere presenti

anche:

• K

A

• K V

• K Ca

C’è un primo stimolo depolarizzante.

2+

Apertura dei canali Ca voltaggio dipendenti.

 Apertura di K .

 Ca

+

K

Esce Si abbassa V .

 m

2+

Il Ca si accumula nel citosol.

Aumenta il numero dei K attivati

 Ca +

Aumenta l’uscita di K dalla cellula. Quando questa corrente

eguaglia quella entrante o comunque la porta a generare un valore

di V sotto soglia non si generano più PA.

m

Quindi, in sostanza:

• +

K e canali Na hanno il compito di generare il PA

v

• I K sono implicati nella codificazione.

A

• I VDCC e i K sono implicati nell’adattamento.

Ca

+

Canali del K K/QT e aritmie cardiache

Sono voltage dependent e sono presenti nei miociti ventricolari. Una loro

disfunzione causa una malattia detta sindrome del long QT in cui

l’elettrocardiogramma viene prolungato.

Nell’onda P c’è la depolarizzazione della muscolatura atriale (100ms) con la

sistole atriale che spinge il sangue nei ventricoli.

Nel segmento PQ c’è l’espressione di una parte della ripolarizzazione degli

atri (100ms).

Nel complesso QRS c’è la fase di invasione (da parte del sangue?)

ventricolare (60-100ms) con conseguente contrazione ventricolare.

L’onda Q corrisponde all’attivazione del setto interventricolare.

L’onda R al completamento dell’attivazione del setto con invasione dell’apice

del cuore.

L’onda S corrisponde all’attivazione delle pareti libere dei ventricoli e della

base del cuore.

L’onda T è espressione del completamento della ripolarizzazione ventricolare

con annessa diastole ventricolare.

Infatti, il PA cardiaco ha una lunga fase di plateaux che permette ai miociti

ventricolari di rimanere depolarizzati a lungo e quindi permette la fase di

sistole ventricolare.

Nella long QT l’intervallo tra inizio di Q e fine di T aumenta. Gli imputati sono

+

due tipi di canali per il K :

• K (slow), con una cinetica di attivazione lenta

s

• K (rapid), con una cinetica di attivazione rapida

r

Entrano in gioco in momenti diversi dell’elettrocardiogramma, ma comunque

+

nella fase di plateaux del PA. Normalmente loro si aprono e fanno uscire K ,

permettendo alla membrana di ripolarizzarsi. Nel long QT c’è un

prolungamento del plateaux perché i canali hanno mutazioni nel poro del

canale. +

Minore uscita di K

 Prolungamento del plateaux.

 contratto più a lungo.

Cuore

Pompaggio rallentato.

Secondo gruppo: 4 subunità di 2STM

Tre famiglie:

• IRK: Inward rectifier

• GIRK: G-protein activated inward rectifier

• K : bloccati dall’ATP

ATP

IRK

I K sono equivalenti al “nocciolo” interno dei K : mancano del sensore di

IR V

voltaggio S4 e di S1, S2 e S3. E’ come se ci fossero solo S5 ed S6.

Sembrano voltaggio-indipendenti, anche perché non hanno il sensore

 S4... Ma l’I/V è così:

 Se fossero voltaggio indipendenti puri l’andamento

+

sarebbe lineare, ma quando la corrente di K diventa

Questo outward tende a zero e quindi non è più lineare.

comportamento è 2+

invece dovuto al Mg C’è un comportamento voltaggio-dipendente che

e alle poliamine, che non dipende dal gating!

agiscono

intracellularmente e fanno da tappo in maniera voltaggio-dipendente. A

potenziali meno positivi invece si staccano e il canale funziona con un

andamento che inizialmente è lineare.

Gli IRK sono presenti anche in cellule non eccitabili. La loro funzione è

mantenere il potenziale di riposo delle cellule:

1) Se la membrana viene iperpolarizzata, il K lascia passare una

IR

+

corrente entrante di K che si oppone all’iperpolarizzazione .

2) Se la membrana viene depolarizzata lascia passare una corrente

uscente che si oppone alla depolarizzazione, via via sempre più

debolmente. Potenziale di riposo o inversione =

potenziale a cui la corrente da inward

diventa outward o viceversa.

GIRK

Alcuni K sono attivati da G-protein trimeriche e senza di esse hanno una

IR

bassa probabilità d’apertura. Nei neuroni vengono attivate dalle proteine della

famiglia GO, che inibiscono l’adenilato ciclasi e sanno legare le proprie

subunità β-γ al GIRK, attivandolo.

La corrente macroscopica del GIRK aumenta.

GO viene attivata se vengono a loro volta attivati dei recettori muscarinici m 2

o i GABA-B, dei recettori per gli oppiacei o dei recettori α-adrenergici. L’effetto

sull’I/V dipende dalla concentrazione di GO e quindi dello stimolatore dei

recettori che l’attivano: +

Dato che questi recettori aprono i canali K ,

possono provocare una diminuzione dell’attività

cardiaca qualora venga rilasciata acetilcolina, che

in effetti è rilasciata dal sistema nervoso

parasimpatico. Questo fenomeno è detto “effetto

cronotropo negativo”.

K ATP

Sono chiusi dall’aumento di [ATP] ed aperti dall’aumento di [ADP]. Una

concentrazione basale di ATP comunque li mantiene aperti, anche perché

l’ATP viene consumata velocemente. Somigliano ai canali attivati da

nucleotidi ciclici. Facciamo l’esempio di un sinergismo vedendo come avviene

la regolazione della glicemia a livello delle cellule del pancreas, in cui sono

2+

presenti canali di tipo K e canali VDCC. Se si aprono i canali Ca ,

ATP

2+

l’ingresso di Ca causa il rilascio di insulina per esocitosi. Si tratta di canali

2+

Ca di tipo L, diidrossipiridina sensibili.

2+

A valori basali di glicemia i canali Ca sono chiusi e non viene liberata

insulina. Se la glicemia aumenta, aumenta anche il glucosio cellulare.

Aumenta [ATP]!

 lega il K e lo chiude.

ATP ATP

V non è più mantenuto al potenziale di riposo e la

 m

membrana depolarizza.

2+

I canali Ca si aprono.

 Rilascio di insulina.

Se invece la glicemia scende, l’ADP apre i K e viene bloccato il rilascio

ATP

d’insulina. Infatti, alcune forme di diabete sono curabili con farmaci che

bloccano K .

ATP

Terzo gruppo: subunità 4STM e due regioni P

(K2P)

Sono voltaggio indipendenti, non hanno gating e sono sempre aperti. La loro

funzione è di contribuire a portare il potenziale verso valori vicini al potenziale

+

di riposo del K . Sono detti “canali di leakage”.

+

Canali Na voltaggio-dipendenti

+

Ci sono diversi tipi di canali per Na voltaggio dipendenti. Sono composti tutti

da 4 pseudosubunità disposte a cerchio, ognuna delle quali di 6STM. Il filtro

di selettività è formato dai segmenti S5 ed S6. Possiedono delle gates di

attivazione ed inattivazione col meccanismo a ball and chain. Il sensore di

+

voltaggio è il segmento S4. Si pensa che il Na possa passare attraverso il

poro anche se legato ad una molecola d’acqua, ma di più di certo no.

Il canale (subunità α) è legato ad una subunità β1 che forse è responsabile

della sua regolazione. La subunità α è una glicoproteina (infatti presenta dei

siti di glicosilazione) con siti di fosforilazione dal lato intracellulare. I canali per

+

il Na sono bloccati da TTX, che si lega al loop P (detto anche regione H5),

cioè sul poro del canale stesso. +

Inattivazione rapida dei canali Na

L’inattivazione rapida di questi canali avviene con un meccanismo a ball and

chain dovuto ad un loop tra le pseudosubunità 3 e 4, una sequenza di

4amminoacidi che interagiscono con altre parti del canale:

• Un piccolo loop tra i segmenti S4 ed S5 del dominio 3.

• Il loop intracellulare che costituisce il CTD della subunità α1 (-> il loop

dopo il dominio S6 della IV pseudosubunità)

+

Inattivazione lenta dei canali Na

L’inattivazione lenta è assente nel modello H&H perché richiede una scala

temporale più lunga rispetto a quella dei loro esperimenti. Essenzialmente, si

esplica in un riarrangiamento dei segmenti S5 ed S6, che fanno parte del

poro, con una conseguente ostruzione del canale.

Che interesse fisiologico ha? Se un neurone ha un’attività intensa si assiste

+

ad un accumulo di K fuori dalla cellula perché questo non viene smaltito

abbastanza velocemente. Questo accumulo contribuisce all’inattivazione

lenta e il canale smetterà di aprirsi, con un conseguente stop nelle scariche di

PA. Ovviamente questo potrebbe essere anche un lento adattamento ad un

eccesso di scariche di PA, una sorta di meccanismo fasico. Oppure potrebbe

esserci un motivo precauzionale: l’eccesso di attività in alcuni neuroni

potrebbe essere deleterio (es. nell’epilessia) e così li si blocca.

+

Canali Na che non inattivano: I NaP

+

C’è una classe di canali Na che non inattiva. Le loro correnti ioniche sono

+

dette “correnti Na persistenti” (I ). Secondo alcune ipotesi ci sono dei

NaP

canali che possono passare dall’essere inattivabili al non esserlo, tuttavia si è

visto che i canali I non sono sensibili alla TTX (al contrario dei Fast-TTX-S,

NaP

+

correnti di Na con inattivazione rapida sensibili a TTX), quindi probabilmente

si tratta di una teoria sbagliata... In realtà non è proprio detto, questo switch

potrebbe anche esserci, però in canali a sé stanti.

Caratteristiche dell’I :

NaP

• Hanno la soglia di attivazione a -65mV, cioè sotto il

+

livello soglia necessario per i normali canali Na (-

>55mV). Forse la funzione è aumentare o favorire la risposta di un

neurone a uno stimolo depolarizzante anche se questo è sotto-

soglia.

• Vengono inattivati da uno stimolo iperpolarizzante e questo determina

un’iperpolarizzazione più marcata.

genera un effetto di amplificazione del segnale e

I NaP

rende la cellula più eccitabile! Infatti normalmente ad una

certa quantità di neurotrasmettitore corrisponde una scarica di

PA ad una precisa frequenza, ma se c’è I il potenziale

NaP

postsinaptico sarà più alto e quindi la frequenza della scarica

sarà maggiore.

2+

Canali Ca voltaggio dipendenti

I canali possono essere classificati da diversi punti di vista. Un tipo di

classificazione è in base alla sensibilità ai farmaci e c’è una classe di canali

2+

Ca molto importante, detta di tipo L, che è sensibile alle diidropiridine

(DHP). Sono i canali responsabili dei PA nel cuore, quindi le DHP sono molto

importanti in cardiologia.

2+

I canali Ca presentano una subunità α , che è il core del canale, più serie di

1

subunità ancillari, tra cui:

• β: influenza l’inattivazione voltaggio dipendente.

• α e δ, legate tra loro da ponti S-S. Danno maggiore stabilità in

2

membrana al canale. α è una proteina extracellulare, mentre δ è

2

transmembrana.

• γ, che è presente solo in una classe presente a livello della muscolatura

scheletrica.

2+

I canali Ca possono essere bloccati selettivamente da dei metalli pesanti

2+ 2+ 3+

come Ni , Co e La .

Classificazione dal punto di vista elettrofisiologico

Classi:

• Low voltage activated, LVA:

si attivano intorno ai -70mV.

o Detti anche canali T, transient , perché presentano una spiccata

o +

inattivazione, anche se è più lenta di quella dei canali Na .

2+

Sono in grado di generare degli spike al Ca .

o Localizzati soprattutto nei dendriti e nelle cellule pacemaker del

o cuore.

Non ci sono farmaci che li blocchino selettivamente, ma sono

o bloccabili dall’amiloride (che non è selettivo), anche se ha l’effetto

collaterale di essere un antidiuretico (-> problematico per i

cardiopatici).

Se in condizioni sperimentali si depolarizza da -90mV a -40mV si

o ha una corrente maggiore che partendo da -70mV, perché a

-70mV molti canali sono già inattivati. Quindi vengono inattivati

dalla depolarizzazione.

• High voltage activated, HVA :

Si attivano attorno ai -30/-20mV.

o Inattivazione molto più lenta .

o Anche la cinetica inattivazione è diversa: cambiando il potenziale

o di partenza non si vedono grosse differenze.

Classificazione dal punto di vista farmacologico

2+

Da un punto di vista farmacologico i canali Ca voltaggio dipendenti sono

distinguibili in:

• Canali L (long lasting) :

Sensibili alle DHP.

o Inattivano lentamente e non completamente .

o Sono nei muscoli, sia scheletrici, sia cardiaci, sia nelle fibrocellule

o muscolari lisce; sono anche nelle neurocellule secernenti del

pancreas e dell’ipofisi. Anche in coni e bastoncelli li hanno, ma

non sono sensibili alle DHP, anche se hanno omologia di

sequenza.

• Canali P/Q e N :

I P/Q sono stati scoperti nei neuroni di Purkinje (per questo P),

o ma poi si è visto che si ritrovano insieme ai canali N nelle sinapsi

di molti neuroni.

Sono responsabili dell’ultima parte del rilascio del

o neurotrasmettitore.

I P/Q sono bloccati dall’ω-agatossina IV A e gli N dall’ω-

o citotossina G VI A.

• Canali R:

Inattivano relativamente rapidamente e completamente .

o Solo neuronali.

o Bloccabili (non selettivamente) dall’SNX 482.

o

• Canali T :

Si trovano sia a livello neuronale sia nelle cellule pacemaker

o cardiache.

Inattivazione abbastanza rapida .

o

In tutti, la subunità più importante è la α, che presenta delle differenze tra le

varie famiglie di canali e li si può classificare anche in base alle differenze tra

queste subunità o al gene che codifica il canale.

Possibile modello d’inattivazione voltaggio dipendente dei

2+

canali Ca

Il meccanismo è relativamente simile qualitativamente a quello a ball and

+

chain dei canali per Na , però qui la ball and chain è tra i domini I e II ed

interagisce con zone nei segmenti S6 dei domini II e III.

2+

Però il canale del Ca ha una particolarità: la maggior parte (non i T) hanno

2+

un’inattivazione Ca -dipendente . Infatti, la subunità α è in contatto con

1

2+

una calmodulina, che lega il Ca .

Quando lo lega si attiva ed inattiva il canale.

In più la CTD dell’α ha una sequenza, detta IQ, che in determinate

1

circostanze può interagire con la calmodulina, cosa che porta

all’inattivazione. Infatti, i riarrangiamenti dell’α per l’apertura del canale

1 2+

portano IQ ad avvicinarsi alla calmodulina; quando poi il Ca si accumula in

cellula si lega alla calmodulina, che si attiva ed interagisce con l’IQ. Questo

determina il cambiamento conformazionale che porta allo stato inattivato.

2+

Tipologie di canali Ca voltaggio dipendenti (CaVD)

Canali L

Sono presenti anche nella muscolatura liscia, dove sono fondamentali. Infatti,

lì non c’è il reticolo sarcoplasmatico come nei muscoli scheletrici: la cellula è

2+

disorganizzata, quindi l’ingresso di Ca ha un ruolo fondamentale e deve

essere finemente regolato.

Prima di tutto, però, che relazioni ci sono tra i canali del sarcolemma e il

reticolo sarcoplasmatico? Il sarcolemma ha della invaginazioni dette tubuli T

+ +

o trasversi ed al suo interno vi sono canali per K e Na voltage-dependent,

2+

ma anche canali Ca di tipo L voltaggio dipendenti che sono in contatto con

le cisterne laterali del reticolo sarcoplasmatico.

Quest’ultimo ha anch’esso dei canali

2+

Ca , che però non sono voltaggio

dipendenti e sono canali sensibili alla

rianodina. Quando arriva uno stimolo

2+

questi si aprono ed esce Ca , così vi è

la contrazione del muscolo. Si suppone

che tra questi canali e i canali L sul

sarcolemma vi sia un accoppiamento

meccanico, che si tocchino!

Quando la fibrocellula è a riposo e

il canale L è chiuso e l’accoppiamento

2+

fa sì che i canali Ca del reticolo

sarcoplasmatico siano ostruiti. Se arriva

lo stimolo il canale L si apre e quello sul reticolo si disostruisce.

2+

Ca dagli L (ma in quantità quasi ininfluenti per la contrazione) ed

Entra 2+

esce Ca dal reticolo. 2+

N.B.: se io elimino dal bagnetto il Ca e depolarizzo la cellula la

contrazione avviene lo stesso perché basta che il canale L si apra

2+

per innescarla, il Ca che entra è ininfluente.

Invece nelle fibrocellule muscolari cardiache è un po’ diverso perché il

2+ 2+

meccanismo è Ca dipendente: se si apre il canale L entra il Ca , che è

2+

fondamentale per aprire i canali Ca del reticolo sarcoplasmatico.

2+ 2+

C’è un rilascio di Ca indotto dal Ca stesso! Questo perché c’è

un accoppiamento, ma è chimico, non meccanico.

2+

Questo non è l’unico ruolo del Ca nella contrazione del cuore: ha un ruolo

nel generare un potenziale d’azione più prolungato di quelli normali, con un

plateaux più lungo: +

1) c’è un picco dovuto ai canali del Na , che poi inattivano.

+

2) Si aprono i canali per il K , quindi ci dovrebbe essere una

ripolarizzazione.

2+

3) Entra Ca e V si stabilizza intorno a 0mV.

m +

4) Contribuiscono anche dei canali K detti anomalous rectifier: si aprono

a questo potenziale e c’è una piccola corrente uscente dalla cellula.

Sono un po’ i corrispondenti cardiaci degli inward rectifier.

2+ +

Bilanciamento tra corrente entrante di Ca e uscente di K

 potenziale di membrana si stabilizza a 0mV.

Il

2+

Il Ca determina:

 L’innesco della contrazione muscolare.

o Le caratteristiche del PA.

o

N.B.: Il PA lungo impedisce l’insorgenza del tetano muscolare, che

invece per la muscolatura scheletrica è fondamentale. Il tetano

muscolare è la sommazione delle scosse semplici quando ci

sono stimoli molto ravvicinati nel tempo: la durata della

sommazione è più lunga dei singoli PA .

Aumento della forza contraente.

Invece nei miociti il plateaux lungo rende la contrazione muscolare di gran

lunga più duratura del singolo PA, quindi non c’è modo di fare una

sommazione.

Non ci può essere una sovrapposizione delle scosse muscolari

semplici, col tetano i ventricoli rimarrebbero contratti molto tempo.

Nessun afflusso di sangue all’aorta.

2+

PA al Ca nelle cellule pacemaker cardiache Prima del PA c’è un prepotenziale, cioè

una lenta depolarizzazione della

membrana fino alla soglia. Da notare

che il valore minimo è sempre sopra i

-70mV, quindi non si raggiunge mai il

potenziale di riposo!

Questi PA non necessitano di

 stimoli esterni, sono spontanei!

2+

Questi PA sono al Ca e sono dovuti ai canali di tipo T, che inattivano

abbastanza precocemente. Il prepotenziale è dovuto all’apertura di canali con

una voltaggio-dipendenza particolare: infatti, si aprono in iperpolarizzazione.

Perciò sono detti canali F, funny. Sono canali cationici non molto selettivi,

+

tuttavia entra un’intensa corrente Na rispetto alla possibile I uscente. Fanno

k+

entrare cationi in cellula e depolarizzano la membrana.

Quando il potenziale raggiunge un livello critico, i canali T si aprono.

2+

Entra moltissimo Ca .

 Depolarizzazione fino all’overshooting.

 2+

Spike al Ca .

Però i canali T inattivano rapidamente.

Intorno ai -30/-20mV si aprono i canali L, che però si

attivano a potenziali alti.

La ripolarizzazione non è rapida come nei PA normali.

 2+

Gli spike al Ca durano ≈100ms!

 Si mantiene abbastanza perché lo stimolo si

propaghi dalle cellule pacemaker primarie alle

cellule pacemaker secondarie, poi alle fibre del

Purkinje e infine a quelle ventricolari, inducendo la

sistole ventricolare.

N.B.: Quando si aprono i T si chiudono gli F! Ma

quando c’è ripolarizzazione si riaprono e si

ricomincia.

Questi canali F appartengono alla famiglia HCN di canali attivati

dall’iperpolarizzazione, presenti anche nel SNC.

Il sensore di voltaggio fa sì che il poro si apra

in iperpolarizzazione. In più la loro

coda CTD ha un sito di binding

per la cAMP, che modula il cuore

e quindi l’attività cardiaca, con un

effetto cronotropo positivo o

negativo.

Modulazione dei canali F

Tanto più rapido è il prepotenziale, tanto più ravvicinati saranno i PA.

Modulando i canali F si regola il battito cardiaco.

Se interviene l’ortosimpatico con la liberazione di noradrenalina (che si

lega a recettori β-noradrenergici), questa attiva una G-protein detta GS:

Na→ G ↑

S

GS è una stimolante dell’adenilato ciclasi.

Produzione di cAMP, che si lega al canale F .

 L’ortosimpatico crea una traslazione della curva P /V

 O

verso potenziali più positivi.

probabilità di apertura allo stesso potenziale.

Maggiore

Effetto cronotropo positivo .

E se interviene il parasimpatico?

Ach m G → AC ↓ →[cAMP] ↓

2 i

L’acetilcolina attiva i recettori muscarinici m , che attivano una G-protein Gi,

2

che abbassa i livelli di adenilato ciclasi (AC).

Diminuisce cAMP e i canali F shiftano la curva di attivazione

verso sinistra. +

Meno canali F sono attivati ed entra meno Na .

 più lento.

Prepotenziale

Effetto cronotropo negativo .

2+

Canali Ca di tipo N e P/Q nell’esocitosi presinaptica

Zona attiva = dove ci sono le proteine del pool di rilascio delle vescicole.

2+

Nella zona attiva sono presenti i canali che fanno entrare Ca , che innesca il

processo di fusione della membrana della vescicola di neurotrasmettitore con

la membrana sinaptica.

Però prima ancora intervengono i canali L, che non sono sulla zona attiva ma

in corrispondenza dello slargamento dell’assone a bottone sinaptico. Il loro

compito è permettere alle vescicole di trasferirsi dal pool di deposito al pool di

rilascio. 2+

La loro apertura fa entrare Ca .

 2+

Ca attiva delle calmoduline.

Il Le calmoduline inattivano i canali L e attivano delle

calmodulin-chinasi.

Le calmodulin-chinasi fosforilano l’actina.

 L’actina rilascia la vescicola, che può raggiungere il

pool di rilascio. 2+

A questo punto intervengono i canali P/Q ed N, che fanno entrare il Ca che

serve per il rilascio del NT. 2+

Correnti neuronali e spike al Ca

2+ +

Sullo spike al Ca si possono instaurare degli spike al Na .

In certi neuroni la presenza dei canali T coi canali H (corrispondenti degli F)

genera un’attività elettrica spontanea. Vediamo una registrazione dei nuclei di

2+ +

Relay del talamo. Inizialmente allo spike al Ca si sovrappone quello al Na ;

poi si attua un trattamento al TTX e a quel punto si vedono unicamente gli

2+

spike al Ca . Ma quale meccanismo innesca

quest’attività autoritmica?

interneuroni GABAergici (inibitori) del Consideriamo le afferenze talamiche,

nucleo reticolare del talamo. che arrivano al IV strato della corteccia.

Nei nuclei di Relay ci sono dei neuroni

Quando il neurone GABAergico (NRT) glutamatergici (eccitatori) che inviano

viene attivato dall’assone proveniente assoni al IV strato della corteccia e agli

dai nuclei di Relay genera un

potenziale postsinaptico inibitorio in

seguito alla liberazione di GABA.

C’è un’iperpolarizzazione della postsinapsi che attiva i canali H.

 Innesco dell’attività autoritmica nei neuroni dei nuclei di

Relay. +

Agli spikes (che possono essere anche al Na ) del neurone NRT

corrisponde l’iperpolarizzazione che innesca il prepotenziale nel neurone

di Relay.

La questione però non è così semplice: solo alcune frequenze di spiking

nell’interneurone GABAergico possobno realizzare tutto questo nel neurone

di Relay. L’ampiezza dei PA dei nuclei di Relay dipende dalla frequenza dei

PA nei neuroni NRT.

Perché? Perché per generare questi burst autoritmici c’è bisogno della

sommazione di più PA: se c’è una scarica ad alta frequenza ci sono

sicuramente dei PA inibitori che si possono sommare, mentre se la frequenza

è bassa può essere che la sommazione non raggiunga un’ampiezza del PA

tale da innescare l’I e quindi l’attività autoritmica.

h 2+

In generale si osserva prima una scarica ritmica (spikes al Ca ), poi con la

+

depolarizzazione si vede una scarica tonica (spikes al Na ) e infine di nuovo

2+

una scarica ritmica (spikes al Ca ).

In realtà i neuroni talamocorticali dei nuclei di Relay possono avere sia

scariche di tipo autoritmico (burst) che scariche di tipo tonico. In pratica la

depolarizzazione abolisce le scariche di tipo burst e instaura scariche di tipo

tonico, perché la depolarizzazione inibisce i canali H.

Questo switch si può verificare fisiologicamente: applicando sul neurone

noradrenalina o acetilcolina si attiva lo switch, e questi sono tipi di

terminazioni che effettivamente questi neuroni ricevono. Perché? Perché NE

ed Ach attivano recettori metabotropici. +

Le proteine G inibiscono delle correnti leakage di K preesistenti.

 Depolarizzazione.

Inibizione dei canali H.

 Switch.

Fisiologicamente, quale tipo di scarica prevale sull’altro? Bisogna vedere

l’elettroencefalogramma. La sostituzione della scarica ritmica a quella tonica

è simile alla modificazione dell’attività elettrica della corteccia nella

transizione da sonno a veglia o al sonno REM. Infatti, nel sonno REM c’è un

tracciato simile alla veglia ad occhi aperti, mentre il sonno non REM (sonno

profondo) è detto SWS (slow wave sleep).

I due tipi di scariche dei neuroni di Relay possono corrispondere a

questi due tipi di tracce, ed infatti si corrispondono.

In tutti i tre tipi di neurone nel sonno profondo c’è

un’attività di burst, mentre nella veglia e nel sonno REM

c’è un’attività di tipo tonico: le tre tipologie di neuroni

esibiscono i due diversi stati riscontrabili nell’EEG.

Cosa attiva e cosa spegne le cellule pacemaker talamiche?

• Anzitutto c’è il sincronismo tra i tipi di scariche dei nuclei di Relay e i

neuroni corticali, che si influenzano a vicenda.

• Durante lo stato di veglia sono attive le terminazioni di Ach, NE o 5-

HT, quindi le cellule pacemaker talamiche vengono inibite.

• Durante il sonno SWS, l’attività delle terminazioni di Ach, NE e 5-HT

diminuisce, quindi le cellule pacemaker talamiche sono attive.

Canali P e spike complessi nelle cellule del Purkinje

Le cellule del Purkinje hanno un grosso soma, un neurite che scende verso i

nuclei profondi del cervelletto e dei dendriti che la collegano alle fibre

parallele delle cellule granulari, il cui soma è in uno strato più profondo della

corteccia cerebellare. La cellula granulare è glutamatergica e genera un

potenziale postsinaptico eccitatorio che dà origine ad una scarica tonica nel

neurone di Purkinje. In realtà il neurone di Purkinje

genera comunque delle scariche anche senza lo

stimolo dalla fibra parallela, però sono a frequenza più bassa. Comunque

l’azione delle fibre parallele si somma ad un’attività basale dei neuroni di

Purkinje a creare degli spike semplici.

Però il neurone di Purkinje riceve afferenze anche dalle fibre corticali (le fibre

rampicanti), che derivano dall’oliva bulbare.

Anch’essa libera uno stimolo eccitatorio, ma

genera un tipo di scarica diverso: gli spike 2+

complessi generati dall’apertura dei canali Ca di tipo

P, un’azione fasica rapida.

Un neurone di Purkinje contatta più fibre parallele, ma un'unica fibra

rampicante contatta un neurone di Purkinje formando con esso più sinapsi.

Nello spike complesso c’è un’iniziale depolarizzazione dovuta ai canali P, poi

+

si sovrappongono dei PA al Na .

Spike semplici = prodotti da una combinazione di attività basale e di input

dalle fibre parallele. A bassa frequenza sono il risultato di un’attività basale,

ad alta della combinazione di questi input.

Spike complesso = sequenza stereotipata di potenziali d’azione con

intervalli molto brevi tra uno spike e l’altro e ampiezze decrescenti. Sono

costantemente associati all’attivazione delle fibre rampicanti. sono spesso

seguiti da una pausa di alcune centinaia di msec durante la quale l’attività

degli spikes semplici è soppressa.

L’attività è simile qualitativamente a quella delle cellule pacemaker, ma qui,

invece che coi canali di tipo T, si ha a che fare coi canali di tipo P. I canali P,

rispetto ai T, inattivano molto meno.

Generano un plateaux, sui quali si può instaurare una serie

di PA di tipo fasico che tendono a scemare nel tempo. Comunque è

un’attività molto rapida e non così tanto depolarizzante.

Ogniqualvolta in questi neuroni si generino gli spike complessi poi il neurone

va incontro ad un silenziamento di centinaia di millisecondi, in cui sono

assenti anche gli spike semplici.

Lo spike complesso inibisce gli spike semplici .

Non si sa perché, ci sono varie teorie. Forse le scariche di PA semplici e

complessi, essendo in direzione opposta, si scontrano generando una

refrattarietà della membrana che causa l’inibizione. Ovviamente, quando il

Purkinje viene inibito smette di liberare GABA finché l’inibizione non cessa.

Il patch clamp

Col patch clamp si possono registrare correnti in singolo canale usando un

solo elettrodo, il che è sicuramente un vantaggio per i neuroni più piccoli.

Il set up per il patch clamp:

• Microscopio

• Preparato

• Elettrodo che fa il seal con la cellula

• Micromanipolatori

• Apparecchio da patch collegato all’elettrodo e con l’oscilloscopio o un

computer.

• Se uso il computer (digitale) che deve interfacciarsi con l’amplificatore

(analogico) ci vuole un convertitore analogico/digitale.

• Gabbia di Faraday. -6

Gli elettrodi non devono avere una punta troppo fine (≈10 m).

La configurazione in cell attached

In questa configurazione l’operatore aspira dentro l’elettrodo un tassello di

membrana, che forma un sigillo con l’elettrodo. Il sigillo deve avere una

resistenza superiore a 1GΩ. In questo modo si possono fare esperimenti in

singolo canale.

R = resistenza che offre la membrana, col suo corredo di canali ionici,

in all’ingresso della corrente.

Ma perché ci vuole questa

forte saldatura tra la +

Dove R è la resistenza del canale K aperto ed R

k S

pipetta e la membrana? è la resistenza del sigillo:

R S

V =E K R R

+

S K

Più è grande R , più insignificante è R , quindi E si avvicina a V.

 S K K

Il cell attached ha alcuni inconvenienti. Noi non conosciamo l’effettivo

potenziale della cellula perché io faccio la differenza tra l’elettrodo nel bagno

e l’elettrodo nella pipetta, che è in effettivo contatto con l’interno della

cellula... Ma quando imponiamo un potenziale, l’unico punto della cellula che

ne è influenzato è quel tassellino di membrana che fa il sigillo, mentre

sarebbe utile sapere il potenziale di tutta la membrana.

+

A volte mettendo nel bagno un’alta [K ] il V si alza fino ad

 m

arrivare a zero.

Il V è noto, così posso imporre alla membrana un

 m

potenziale.

Un altro inconveniente sta nel fatto che in cell attached io non posso

modificare la composizione intracellulare. Però altre configurazioni lo

permettono. +

Ora, diciamo di isolare in cell attached un canale Na : vediamo un’unica

apertura per traccia perché poi il canale inattiva. Se si trovano due aperture

sovrapposte, significa che ci sono almeno due canali.

Ripetendo l’esperimento un centinaio di volte possiamo ottenere la

corrente macroscopica: La somma delle correnti di singolo canale

corrisponde alla corrente macroscopica di tutta la

popolazione di canale che posso misurare in

voltage clamp.

Invece per il delayed rectifier non si vede un’inattivazione e sta più aperto del

+

canale del Na . Il corrispondente della corrente macroscopica è questo:

L’apertura del canale non avviene sempre nello stesso

istante e comunque quasi mai subito dopo lo step

depolarizzante: infatti, la proteina ad un certo

potenziale ha una certa probabilità di aprirsi, ma non è

una certezza!

A seconda dello stato energetico in cui si trova la proteina, questa

potrà passare più o meno facilmente da uno stato all’atro.

Questo si vede anche dalla corrente macroscopica, che non aumenta

linearmente perché le proteine non sono distribuite a seconda del livello

energetico, cioè secondo una distribuzione di Boltzmann.

Configurazione whole cell

Per avere la conformazione di whole cell bisogna prima creare quella di cell

attached e poi rompere il tassello di membrana che è dentro l’elettrodo. In

questo modo l’interno della pipetta e l’interno della cellula entrano diventano

tutt’uno e noi possiamo registrare l’attività dell’intera popolazione di canali

presente sulla membrana plasmatica.

Questa configurazione è il corrispondente del voltage clamp a due

elettrodi: misuro la corrente macroscopica.

Quando di un canale non conosco niente, conviene partire dalla

configurazione di whole cell e misurarne la corrente macroscopica, poi lo si

può esaminare in cell attached per ricavare le caratteristiche biofisiche.

La soluzione all’interno dell’elettrodo deve essere studiata per perturbare il

meno possibile la composizione ionica intracellulare, ma non sempre questo

è utile: per esempio, se io volessi misurare un solo tipo di canale, isolandolo

rispetto a quelli che si attivano allo stesso potenziale e/o nella stessa zona,

può convenire cambiare le condizioni. Facciamo qualche esempio:

• 2+

Se voglio eliminare dei canali Ca senza bloccanti selettivi conviene

2+

ridurre la [Ca ] extracellulare.

• +

Se voglio bloccare i canali K , che sono di moltissimi tipi, do’ un

bloccante direttamente dentro la pipetta (darlo in soluzione esterna non

sarebbe altrettanto efficace).

• 2+ 2+

Il bario può sostituire il Ca per studiare i canali Ca senza attivare i

+

canali K . + 2+

Posso eliminare le contaminazioni da correnti K -Ca

attivate.

• +

Si può eliminare il K e sostituirlo con il cesio, che è monovalente (->

+

non viene perturbato l’equilibrio osmotico) ma non permea i canali K .

Un inconveniente che si può verificare nel whole cell con la diluizione della

soluzione salina intracellulare nell’elettrodo è che si diluiscano anche fattori

utili per lo studio che stiamo facendo. Dopo un po’ che si registra le correnti di

2+

Ca tendono a diminuire (“rundown della corrente”) e probabilmente questo

è dovuto alla diluizione.

Es. Supponiamo che per funzionare il canale debba essere fosforilato...

Per compensare si può provare ad aggiungere ATP e chinasi.

Un sistema per ovviare a questo problema è di usare il perforated patch: si

usa qualche molecola (come la uistatina) che si inserisce nel bilayer e vi fa

dei buchi. e molecole passano, le molecole organiche (come ATP e

Ioni

proteine) no.

Il problema è che bisogna stare attenti alla concentrazione di uistatina perché

nel tempo continua ad operare e alla fine la membrana si rompe e si arriva al

whole cell.

Un altro vantaggio del whole cell è che possiamo introdurre in cellula le

molecole che vogliamo studiare, oppure perfondere extracellularmente

diverse soluzioni saline.

Es. Prima faccio il controllo e poi perfondo un bloccante.

Inside out e outside out

Per ottenere l’outside out, prima vado in cell attached, poi in whole cell e a

questo punto agisco sulla cellula (che aderisce al fondo della Petri) di modo

da allontanarmi dalla cellula col micromanipolatore: così, prima si crea una

strozzatura sulla cellula, e poi la cellula si rompe ed all’elettrodo rimane

attaccato un brandello di membrana, che si ricongiunge formando una sorta

di piccola cellula: la porzione esterna continua ad essere esterna e quella

interna continua ad essere interna. Se c’è un canale, lo si può studiare.

Questo è utile quando si vuole studiare in singolo canale un canale

ionotropico (es. nicotinico), perché se noi abbiamo una seconda pipetta

piena di neurotrasmettitore possiamo perfonderlo localmente nella

soluzione Posso studiare quel canale a diverse concentrazioni di

extracellulare. neurotrasmettitore usando pipette con concentrazioni

diverse.

Per avere un inside out, invece, devo ottenere la configurazione in cell

attached e poi ritrarre l’elettrodo. Come prima si forma una vescicola, poi si

tira questa vescicola fuori dal bagno ed essa si rompe. A questo punto la si

immerge di nuovo nel bagno e così la parte interna della membrana, che si

trova all’esterno, si richiude ed io mi trovo con una minicellula rivoltata:

all’esterno c’è la parte interna della membrana e all’interno la parte esterna.

In questo modo la soluzione nella pipetta mi simula la soluzione extracellulare

e quella nella Petri la soluzione intracellulare, con cui posso giocare a

piacimento.

Come faccio ad essere sicuro di aver raggiunto la configurazione? Perché

l’ampiezza della corrente capacitiva rispecchia l’area della membrana che

patchiamo! Vedo un cambiamento nelle capacità.

Anche la corrente di leakage cambia perché cambia la resistenza di

membrana.

Infatti, andando in whole cell aumentano sia la I sia la corrente di leakage,

c

mentre in inside out la membrana torna ad essere piccola e si riducono

entrambe.

L’applicazione dell’inside out è soprattutto per studiare il comportamento di

canali attivati da componenti intracellulari, come i canali GIRK o quelli attivati

2+

dal Ca .

La refrattarietà dei neuroni di Purkinje dopo gli

spike complessi

(immagine da integrare con spiegazioni)

Sulle sinapsi tra la fibra rampicante e il neurone di Purkinje e quella tra la

fibra parallela e il neurone di Purkinje, nella postinapsi, ci sono dei canali

AMPA: canali glutamatergici (ionotropici) che generano uno stimolo

eccitatorio. Però ci sono anche dei mGluR, recettori metabotropici del

glutammato accoppiati a proteine G, sulla sinapsi tra la fibra parallela e il

neurone di Purkinje. Consideriamo l’azione dei mGluR nella sinapsi con le

fibre parallele. Questi attivano una proteina G , che attiva la fosfolipasi C.

Q

La fosfolipasi C produce:

 2+

IP : attiva dei canali Ca del REL.

o 3 2+

DAG: insieme al Ca proveniente dal REL attiva una

o

chinasi, la pkC.

I recettori AMPA causano una scarica tonica e ci possono essere dei

potenziali d’azione.

Però ci può essere anche un input da parte delle fibre rampicanti: anche qui

2+

ci sono i recettori AMPA e ci sono anche dei canali per il Ca di tipo P.

La depolarizzazione fa aprire i canali P-type.

 2+

Entra Ca .

 della membrana e, dato che ci sono anche

Depolarizzazione

+ 2+ +

canali Na , si genera uno spike complesso a Ca e Na .

Ora, diciamo che lo spike semplice dalla fibra parallela vada in direzione ↓, lo

spike complesso va in direzione ↑↓.

I due treni di PA si scontrano e il neurone di Purkinje si blocca.

 + 2+

Tra le due sinapsi ci sono canali K -Ca -activated. L’IP aveva attivato l’uscita

3

2+

di Ca dal REL e in più ne è anche entrato dai P-type...

+ 2+ +

I canali K -Ca -activated si aprono ed esce K dalla cellula.

 La membrana iperpolarizza. L’iperpolarizzazione può durare

anche 100-200ms.

cellula non riesce a raggiungere la soglia.

La Niente PA.

In realtà però a volte il periodo di silenzio si prolunga anche per secondi o

decine di secondi... Si pensa che sia a causa dei recettori AMPA sulla sinapsi

2+

con la fibra parallela. I mGluR producono DAG, che, se c’è moltissimo Ca ,

attiva la pkC.

Devono essere contemporaneamente attive le fibre rampicanti e

parallele per attivare pkC. ⃗

AMPA pkC AMPA−P

pkC si lega ai recettori AMPA, fosforilandoli:

La fosforilazione di un recettore ne favorisce l’internalizzazione (con un

intervento di un pool di molecole, tra cui la clatrina) e il recettore finisce in una

vescicola. [AMPA] in membrana diminuisce!

 Anche se la fibra parallela continua a liberare glutammato, ci

sono troppo pochi AMPA per generare un PA. Poi gli AMPA

verranno sostituiti da nuovi AMPA.

Questo fenomeno è stato dimostrato in vitro. E’ detto long term depression.

C’è anche un fenomeno opposto, detto long term potentiation, in cui

[AMPA] a livello dendritico aumenta. (chiedere il disegno a CRI)

Si ritiene che questo silenziamento influisca sulla capacità del cervelletto di

rispondere in maniera plastica ad alcuni eventi. Facciamo l’esempio del

riflesso vestibolo-oculare. Quando io muovo la testa da destra verso sinistra,

il bulbo oculare si muove in senso opposto per non far sfocare l’immagine.

Questo è permesso dal riflesso vestibolo-oculare, un’azione riflessa

controllata dal cervello. Diciamo che con l’età si crei una lesione nei muscoli

extraoculari che comprometta questo movimento: si formerebbe un’immagine

sfocata. L’informazione che qualcosa non funziona arriva alla fibra

rampicante, che porta quella cellula di Purkinje al silenziamento. Sembra che

questo sia determinante nel porre rimedio al difetto nel movimento del bulbo

oculare.

Ampiezza media della corrente di singolo canale

Consideriamo un canale che abbia solo due stati: chiuso (->corrente ≈0) e

aperto.

Tuttavia, nella traccia noi in ogni momento vediamo il thermal noise. Ora,

l’ampiezza della corrente di singolo canale può variare da canale a canale

(es. i canali F sono nell’ordine dei phantoampere!) ed è importante che il

rapporto col noise sia elevato.

Per determinare l’ampiezza della corrente bisogna stabilirne un valore medio

e per farlo bisogna costruire un istogramma d’ampiezza, per il quale occorre

una lunga registrazione di singolo canale. Si misura l’ampiezza di tutte le

aperture (e già qua si prende il valore medio), poi le ampiezza vengono

riportate in un istogramma di ampiezza.

Il dominio delle ampiezze viene suddiviso in

intervalli costanti. Da notare che questo

istogramma ha una distribuzione normale: il

grafico si interpola con una curva di Gauss

rappresentabile dall’equazione:

2

( )

( )

x− μ

A 2σ

N= e

√ 2

2π σ

Dove μ è l’ampiezza media della corrente (che corrisponde al picco della

2

curva), A l’area che sottende la curva ed σ la varianza la deviazione

standard. Se μ=2pA, diciamo che l’ampiezza media di singolo canale è di

≈2pA±σ.

Anche allo stato chiuso la corrente ha delle fluttuazioni dovute al noise, quindi

in pratica è una corrente fittizia e dobbiamo capire che valore ha...

Ci vuole un istogramma che rappresenti anche questo e

bisognerebbe ricavare un’ampiezza molto vicina allo zero allo stato

chiuso. Maggiore è l’overlapping tra i due istogrammi, più grande è il

rumore. sono sovrapponibili e più è difficile distinguere tra lo

Più

stato chiuso e lo stato aperto. Se il rapporto segnale/noise è

scarso l’istogramma avrà delle code più ampie, se è alto

l’istogramma sarà più ripido e quindi il dato più attendibile.

Sommando tutte le tracce posso ottenere la corrente totale, che ci dice la

cinetica del canale. Misurando le correnti di singolo canale a canale

aperto si può costruire un I/V: misuro le correnti che passano attraverso il

canale nello stesso patch a N.B.: La relazione è lineare anche per i

diversi potenziali. canali voltaggio dipendenti!

Questo perché γ, la conduttanza

di singolo canale, non dà le stesse

informazioni della conduttanza

macroscopica g, che è voltaggio

dipendente e nel grafico non dà

mai una retta.

g=P G

Infatti , dove G è il valore massimo di g, che è costante ed è quando

O

tutti i canali sono aperti, e la dipendenza da P fa variare g col variare del

o

voltaggio. Invece γ si misura solo quando il canale è aperto, quindi è un

valore costante, non varia col voltaggio. Comunque G e g danno informazioni

su P , mentre γ no: sono informazioni che si ottengono analizzando la

O

cinetica del canale.

Però γ può aiutarci a stabilire con che tipo di canale abbiamo a che fare: può

servire per distinguere tra diverse famiglie (es. i canali di tipo T e di tipo L

hanno conduttanze molto diverse!).

Varia l’I/V perché varia la driving force E .

 K

Probabilità di apertura

Cos’è la probabilità di apertura?

tempo totale trascorso nello stato aperto

P =

O tempo tot. trascorso nello stato aperto+ tempo tot.trascorso nello stato chiuso

P = frazione del tempo trascorso

 O

nello stato aperto.

N.B.: Non vanno considerate la parte di traccia tra l’inizio della registrazione

e la prima apertura e tra l’ultima

apertura e la fine della registrazione

perché non sappiamo cosa succede

mentre noi registriamo.

Quando diciamo che un canale è voltaggio

dipendente? Quando P varia in base al voltaggio,

O

mentre nei canali voltaggio indipendenti la P rimane

O

costante.

Ma che relazione esiste tra i parametri a singolo

canale e quelli in whole cell, e quindi tra i parametri

di singolo canale e la corrente macroscopica?

I =NPi

Dove I è la corrente macroscopica, N il numero di canali funzionali in cellula,

P la probabilità di apertura di ognuno dei canali e i la corrente di singolo

canale.

i=γ V

( )

−V R

Dove (V-V ) è la driving force.

R

I V

( )

=NPγ −V R

Ma I è anche

I =g(V −V )

R

Quindi: g(V V

( )

−V )=NPγ −V

R R

g=NPγ

 γ è costante, g è proporzionale a P.

Se La conduttanza massima si avrà quando P =1, quindi

 o

G =γN .

max

Ecco perché l’I/V macroscopica per un canale voltaggio dipendente non è

lineare: γ è costante, g no perché cambia P !

O

Quale tipo di informazioni può dare l’analisi delle correnti di singolo canale?

1) Il numero degli stati in cui il canale esiste: se oscilla tra uno stato chiuso

e uno stato aperto o ci sono più stati chiusi e uno aperto, o più stati

chiusi, uno aperto e uno inattivato, o uno chiuso, uno aperto e uno

bloccato da un bloccante, e così via...

2) Il tempo medio di permanenza in ciascuno stato.

N.B.: E’ un’analisi statistica! Infatti la proteina ha un

comportamento stocastico, casuale.

3) La velocità di transizione tra gli stati (-> α e β).

Una volta che si è capito come analizzare la cinetica dei canali, si è capito

anche che c’erano dei punti deboli nella teoria di H&H. Infatti, ci possono

essere canali con la stessa P ma con cinetiche diverse e quindi lo sono

O

anche le rispettive voltaggio dipendenze!

Non basta la P per conoscere bene la voltaggio dipendenza di un

 o

canale, bisogna analizzarne la cinetica!

Come abbiamo già detto, dall’I/V di singolo canale non si ottengono

informazioni circa la voltaggio dipendenza, ma le si può ottenere analizzando

la cinetica:

 1) La corrente passa frequentemente

dall’uno all’altro di due ben distinti livelli.

2) Allo stato stazionario può trovarsi in

almeno due stati: chiuso ed aperto.

3) C’è una notevole variabilità nella durata

di aperture e chiusure.

Non è possibile prevedere quanto

Siamo di fronte a variabili casuali.

 leggi che governano queste variabili vanno dedotte da

Le

un’analisi statistica: dalla distribuzione di probabilità su un alto

numero di eventi.

Ma come si ottengono questi grafici? Ci vuole una lunga registrazione con un

gran numero di eventi, così si possono misurare le durate di tutte le aperture

e chiusure, riportarle in un istogramma e suddividere il tempo in intervalli

costanti nell’istogramma stesso.

L’andamento della distribuzione è

( )

−t decrescente.

τ

N t e

( )=α Gli eventi di breve durata sono i più

 frequenti.

Le due distribuzioni (di aperture e chiusure)

sono descrivibili/interpolabili da un

Dove α e τ sono costanti tipiche del canale. Ovviamente, la larghezza

dell’istogramma è il dt.

τ è la costante di tempo ed è un indice di quanto rapidamente la curva declina

verso zero. E’ il tempo a cui la distribuzione è il 37% del suo valore iniziale. Ci

può essere una τ per ogni stato: τ , τ ...

open close

In questo caso (ma solo nel caso vi siano due stati -> cinetica di I ordine) τ è

l’inverso di α:

1

α = τ

Come sono correlati i tempi di permanenza nei vari stati e le costanti di

velocità di un modello a due stati?

β

C O

α ( )

−tτ

−1

N t e

( ) o

o o ( )

−tτ

−1

N t e

( ) =τ c

c c 1 1

τ τ

= =

Ora, visto che e , si ha che

o c

β α (−βt ) (−αt )

N t e N t e

( ) ( )

=β =α ¿

e

o c

Dove N è il numero di eventi (aperture/chiusure) con una certa durata e τ è il

tempo medio di apertura di singolo canale.

Il tempo medio che il canale trascorre in un determinato stato è il

 reciproco della costante di velocità della transizione (α o β) che porta

fuori da quello stato. 1

τ =

Tempo medio di apertura:

 o β

1

τ =

Tempo medio di chiusura: c α

-1

Es. Se τ =1ms, β=1/1=1ms

o -1

Se τ =4ms, α=1/4=0,25ms

c

Canali con più stati

di chiusura Con una traccia come questa, l’istogramma delle

aperture sarebbe grosso modo come il

distinguibili precedente e ci sarebbe un’unica costante di

tempo τ =8ms. Tuttavia, facendo l’istogramma

o

delle chiusure ci si può rendere conto che è

impossibile interpolarlo con un solo esponenziale

in modo soddisfacente!

Usiamo una funzione biesponenziale, cioè data da due curve

 esponenziali, ognuna con una sua τ: una per il decadimento rapido ed

una per quello lento:

es. τ =2,3ms

1

τ =25ms

2

Il canale ha almeno due stati chiusi, ma c’è un unico stato aperto.

 possibilità:

Due

C ↔C ↔ O

1 2

C ↔O ↔C

1 2 +

Notare che il secondo caso corrisponde al canale del Na , dove lo stato C 2

corrisponde allo stato inattivato.

Spesso si trovano dei burst con dei tempi di chiusura brevi intervallati da

tempi di chiusura lunghi.

Sommando le tracce si ottiene l’aspetto della corrente macroscopica, che ci

può suggerire quale dei due modelli scegliere:

• Se ci trovassimo nel primo caso ci aspetteremmo una corrente che

raggiunge lo stato stazionario:

• Se fossimo nel secondo caso, non ci aspetteremmo il raggiungimento di

+

uno stato stazionario, ma una corrente più simile a quella del Na , in cui

la corrente si attiva e poi diminuisce:

Esempi di modelli cinetici

Un modello cinetico a due stati è quello che presenta due stati, aperto e

chiuso: K C

C O

K O

d [C ] [ ]

C K

=−K + [O]

O C

dt

d [O] [ ]

C

=K −K [O]

O C

dt

C’è un altro parametro importante: Mean open time e Mean closed time:

1 1

MOT MCT

= =

e

K K

C O

d P o K K P

( )

=K − + =0

Allo stato stazionario si ha che O O C o

dt

K o

P =

 o K K

+

o C

Come si comporta un canale che ha una cinetica lenta? Quando si apre sta

aperto a lungo e quando si

chiude sta chiuso a lungo: Considerando una cinetica che preveda

k =0.5/ms k =0.5/ms.

o c

Significato di k : Per ogni ms che il canale è

o

nello stato chiuso, esso in media si aprirà 0.5

Ovviamente la cosa è volte (quindi si apre una volta in 2ms!).

invertita per una cinetica Significato di k :Per ogni ms che il canale è

Considerando una cinetica che preveda

c

rapida: nello stato aperto, esso in media si chiuderà

k =5/ms k =5/ms.

o c

0.5 volte.

Significato di k : Per ogni ms che il canale è

o

nello stato chiuso, esso in media si aprirà 5

Sommando le correnti di volte.

singolo canale, si può fare un

grafico della probabilità di Significato di k : Per ogni ms che il canale è

ATTENZIONE!

c

apertura nel tempo che metta nello stato aperto, esso in media si chiuderà

Notare che in entrambi gli

a confronto le due cinetiche: esempi P è 0.5 perché K =K ,

o C O

ma le cinetiche sono

radicalmente diverse!

Ma cosa succede quando K ≠K ?

O C

Es.1 K =5/ms e K =0,5/ms

O C

P = 0,9: il canale in media sta molto più aperto che chiuso.

 o

Es.2 K =0,5/ms e K =5/ms

O C

P =0,1 : il canale in media sta molto più chiuso che aperto.(sulla slide 5

 o

ci sono gli esercizi sul gating)

+

Ora consideriamo il canale K , iperpolarizzando la membrana a -100mV e poi

depolarizzando a -50mV: nell’immagine si può vedere che a -100 non c’è

neanche un’apertura, e questo perché lo stato chiuso è energeticamente

favorito rispetto allo stato aperto. Conseguentemente non c’è corrente. Dopo

la depolarizzazione, invece, lo stato chiuso risulta sfavorito rispetto allo stato

aperto e la barriera energetica da superare per passare dallo stato chiuso a

quello aperto è più bassa, conseguentemente ci sono delle aperture, e sono

anche molto durature. Conseguentemente, c’è una corrente che ha una

forma iperbolica.

Ma cosa succede quando ci sono tre stati?

E’ un modello che si applica a canali voltaggio dipendenti che possono

inattivarsi ed è una reazione di secondo ordine, che viene quindi descritta

dalle seguenti equazioni:

d [

O ] = ⋅ − ⋅ − ⋅ +

k [

C ] k [

O ] k [

O ] k [ I ]

+ −

o i c i

dt d [ I ] = ⋅ − ⋅

k [

O ] k [ I ]

+ −

i i

dt

Quindi essenzialmente la variazione della concentrazione di proteine in uno

stato è data dalla differenza tra la quantità di proteine che possono passarvi

(quindi concentrazione per velocità) e quelle che possono fare la strada

inversa.

Attenzione però! Sono tre equazioni, ma abbiamo quattro incognite, cioè le

quattro costanti di velocità.

L’andamento temporale della P presenta un abbattimento dovuto

o

all’inattivazione e rispecchia l’andamento della corrente macroscopica.

Che relazioni ci sono tra le costanti di velocità e le costanti di tempo in un

modello a tre stati? Consideriamo τ , τ e τ come MOT, MCT e MIT:

o c i

1

MOT = K K

+

C i

1

MCT = K O

1

MIT = K −i

K C

MOB= +1 Qualora il flikering sia tra C e O; altrimenti, se fosse tra O e I

K i K

( )

+i

MOB= +1

allora sarebbe: K C

Dove MOB è il tempo medio delle aperture per burst: infatti, di solito ci sono

dei burst con un certo numero di aperture.

Regola generale: il tempo medio che il canale trascorre in uno stato è

uguale all’inverso della somma delle costanti di velocità che si

allontanano da quello stato.

Ovviamente, all’aumentare di K diminuisce il grado di inattivazione:

-i +

Ripetendo l’esperimento di prima col canale del Na , si vede che in

iperpolarizzazione i canali sono chiusi perché è favorito lo stato chiuso.

Invece la depolarizzazione abbassa la barriera energetica per passare dallo

stato chiuso allo stato aperto e così aumenta la P del canale. Tuttavia, K e K

o i -

rimangono costanti, conseguentemente il canale prima si apre, ma poi

i

inattiva e la corrente cala.

Manca la parte su Aldrich, Corey, Stevens Nature

Secondo il modello di H&H anche K e K dovrebbero essere voltaggio

i -i

dipendenti, ma studi successivi suggeriscono che invece non è così. In

particolare, uno studio del 1983 di Aldrich e Corey (Nature) reinterpreta il

modello di H&H. +

Secondo il modello di H&H il canale del Na prevede un’attivazione rapida e

un’inattivazione lenta voltaggio dipendente (con riferimento alle correnti

macroscopiche). A livello di singolo canale questo significa che in media si

trova in fretta un’apertura e che il canale rimane aperto per un certo periodo.

Quindi sommando le correnti di singolo canale otteniamo la solita corrente

+

macroscopica del Na ...

Invece il modello di Aldrich e Corey prevede un’attivazione lenta e

un’inattivazione rapida e voltaggio indipendente. Questo significa che dal

momento in cui si dà un V alla prima apertura passa del tempo e che il

com

canale si inattiva in un tempo ragionevolmente breve. La traccia

macroscopica così viene simile, ma un po’ più frastagliata! Ecco il confronto

tra i due modelli:

Diciamo che in questo caso la sola analisi della corrente macroscopica è

fuorviante perché nei due casi si somigliano abbastanza. I due modelli

possono essere invece ben discriminati facendo un analisi dei tempi di

latenza (λ = tempo che intercorre tra la depolarizzazione e l’istante in cui il

canale passa da chiuso ad aperto). Nel modello H&H è 2ms, in quello nuovo

10ms. Questo risulta dall’istogramma: E verificando sperimentalmente i

tempi di latenza dei singoli canali si

vede che coincidono col modello

alternativo! Quindi il livello di singolo

canale può essere descritto da

modelli differenti rispetto a ciò che si

ottiene studiando le correnti

macroscopiche.

Il modello H&H è coerente con le osservazioni a livello macroscopico,

 ma non con quelle in singolo canale.

Gating dei canali ionici con un modello a tre stati

Consideriamo un modello in cui il terzo stato non sia uno stato inattivato,

bensì in uno stato bloccato: un bloccante entra nel canale e lo blocca. Dato

che il blocco non è permanente, ma oscilla nel sito di legame, ho un’attività a

burst o di flikering (burst di stati aperto/chiuso):

k

α [B ]

B

+

C O B

← ←

β k −B

In questo caso la cinetica è evidentemente legata alla [B], in quanto nel

k [B]

passaggio da O a B la costante di velocità effettiva è . Mantenendo

B

+

questo modello cinetico, qual è l’effetto del blocco sul singolo canale?

Possiamo simulare vari tipi di cinetiche variando [B]:

Si vede che mano a mano che diminuisce la concentrazione di bloccante

aumenta τ , che poi è la MOT, cioè il tempo medio che il canale trascorre

o

nello stato aperto. Questo è abbastanza ovvio, pensando che in fondo

diminuisce il denominatore della MOT. Quando si arriva a [B]=0 ovviamente

non c’è più attività di burst e τ =1.

o

A questo punto possiamo ricavare tutte le costanti di velocità:

Una volta ricavati tutti i dati numerici si può costruire un grafico ponendo [B]

in relazione ai vari parametri ottenuti. Questo ad esempio lo mette in

relazione con 1/τ , ossia β+K [B]: una volta ottenuta la retta possiamo

o B

estenderla fino a farle toccare l’asse delle ordinate, cioè il punto in cui [B]=0.

1 =β

Perché? Perché è il punto in cui vale , proprio perché [B]=0.

τ o

K . Moltiplicando poi questo valore per i valori imposti di [B], possiamo

+B

calcolare K [B] alle varie concentrazioni.

+B

Abbiamo calcolato due delle costanti di velocità semplicemente

 partendo da τ e si può fare la stessa cosa con le altre costanti di

o

tempo.

Modello a due stati chiusi distinti 2+

Lo si incontra frequentemente, soprattutto nei canali Ca voltaggio

dipendenti. In pratica avremo dei burst tra i quali vi saranno delle chiusure

molto lunghe k α

1 →

C C O

2 1 ←

← β

k −1 1

MOT = β

1

M C T =

1 α k

+ −1

1

M C T =

2 k 1

α

( )

MOB= +1

k

−1

Quest’ultima prevede k al denominatore perché si suppone che lo stato

-1

assorbente (cioè quello in cui il canale rimane per più tempo) sia il C .

2

Riguardo a questo modello facciamo due esempi:

+ 2+

1) I canali a Na e Ca nelle cellule cromaffini. Vengono fatti degli

esperimenti in cell attached e questi sono i risultati:

2) 2+

3) Canali Ca in cellule pituitarie:

Ma come si può comprendere un modello minimo per un canale con uno

studio fisiologico? In questi modelli, anche se si tratta di canali di tipo L, non è

contemplata l’inattivazione, però bisogna dire che in questo caso

un’inattivazione lenta e completa voltaggio dipendente non è visibile.

2+

Un’ulteriore inattivazione Ca dipendente, più veloce, è eliminata usando il

2+

Ba : l’eliminazione dell’inattivazione semplifica l’analisi.

+ +

Per i canali Na e K è prevista una cooperatività nell’attivazione?

+ +

Verifichiamo il modello H&H per l’attivazione dei canali Na e K : la sola fase

di attivazione presenta cinetiche simili tra i due canali. Entrambi hanno una

cinetica che prevede 3 (o 4) gates (-> stadi chiusi) prima di arrivare a uno

stato aperto.

Se partiamo dallo stato C considerando α come la costante di velocità con

1

cui avviene la transizione di una gate da uno stato all’altro, allora si ha che:

Cioè partendo da C1 si aprono 3gates e quindi

3α e così via. Visto che il canale ha tante

gates che si aprono random, più ce ne sono

più è facile che se ne aprano...

Stessa cosa per quelle di chiusura: più ce n’è,

più è facile che una si chiuda...

Se facciamo una simulazione, otteniamo una

curva sigmoide, indice della presenza di più

gates.

In quest’altro modello, invece, le gates hanno

un comportamento cooperativo! La prima

gates ha una certa difficoltà di apertura e una

velocità α, la seconda invece è facilitata

dall’apertura della prima e la velocità è 2α e la

terza è ancora più facilitata e la velocità è 3α.

Ovviamente per la chiusura è uguale ma in

senso opposto.

La corrente macroscopica non è diversa dalla

precedente!

I due modelli sono simili per la cinetica di singolo canale ma non a

 livello macroscopico!

Studi sperimentali a livello di singolo canale hanno dimostrato che questa

cooperatività esiste. Perché H&H non l’hanno scoperto? Perché non avevano

evidenze per scegliere il modello cooperativo, che è più complesso, in quanto

disponevano solo del voltage clamp! Col patch clamp si ottengono dati più

accurati...

Gating dei canali: schema di attivazione da

agonista

K A α

[ ]

+1 →

A AR AR∗¿

+R → ←

← β

K −1

Dove AR* rappresenta lo stato aperto del recettore. Sono canali di questo tipo

i canali GABA A, attivati dal GABA, e in generale tutti i canali ionotropici

attivati da un NT. Nel secondo stadio l’agonista è legato ma non ha ancora

provocato un cambiamento conformazionale, mentre nel terzo questo c’è

stato e il canale si è aperto. Anche qui c’è una costante di velocità regolata da

[A].

C’è anche un attività di burst.

MOT=1/β.

1 1

MCT = + , dove il primo termine rappresenta lo stato chiuso breve

α [ ]

k A

+k −1 +1

e il secondo lo stato chiuso lungo.

α

MOB= 1

+

k −1

I filtri

Per visualizzare meglio le correnti in singolo canale necessitiamo di un

filtraggio che elimini il rumore.

La teoria delle serie di Fourier dimostra che qualsiasi segnale (onda) può

essere scomposto nelle onde sinusoidali che la compongono.

Ma cos’è un segnale

sinusoidale? È la proiezione di

un vettore su un asse

immaginario.

T = periodo = tempo impiegato

o

dal vettore per compiere una

rotazione di 360°. È l’inverso della

frequenza:

1

T =

o f

Se vogliamo costruire un’onda quadra lo possiamo fare per sommazione di

onde sinusoidali.

Comunque non arriveremo mai ad ottenere un’onda quadra perfetta perché

bisognerebbe aggiungere un numero infinito di armoniche... Ma si può

approssimare efficacemente.

L’idea del filtraggio si basa su questa idea: si possono ottenere le singole

sinusoidali facendo il processo inverso.

Si definisce filtro un circuito che rimuove frequenze selezionate dal

 segnale di interesse. In teoria il filtro ideale non dovrebbe attenuare le

frequenze desiderate, mentre l’attenuazione dovrebbe essere infinita

per quelle indesiderate.

Questo grafico rappresenta quello che succede al segnale tramite il filtraggio,

perché ha in ascissa la frequenza e in ordinata il rapporto tra il segnale in

uscita prima del filtraggio e quello dopo il

filtraggio. Dal momento che i filtri coprono molti ordini

di grandezza di frequenze e ampiezze, è

comune descrivere le caratteristiche del filtro usando una scala logaritmica. I

decibel permettono di stabilire i rapporti tra due voltaggi:

V out

dB(decibel)=20log V ¿

E’ un’unità di misura adimensionale ed è rappresentabile da una serie di onde

sinusoidali. Se dB=0, non c’è stata filtrazione, se dB=-3 il segnale è diminuito

rispetto a quello in entrata e così via... E’ una diminuzione di 0,707

dell’ampiezza del segnale in ingresso

Questo è importante perché determina la frequenza di taglio (cut-off): infatti,

se io volessi filtrare il segnale senza che l’ampiezza del segnale stesso vada

sotto i dB=-3, bisognerebbe eliminare solo le onde (frequenze) che si trovano

a destra della frequenza di cut-off.

Eliminiamo il noise e preserviamo il segnale.

Quasi tutte le forme d’onda sono decomponibili in un certo numero di onde

sinusoidali.

Per filtrare un segnale a una certa lunghezza d’onda bisogna vedere

 che tipo di segnale si vuole ottenere.

Ad esempio, posso eliminare i segnali ad alta frequenza, cioè le sinusoidi con

periodo piccolo. Per farlo devo definire una sequenza di cut off: l’ampiezza

della sinusoide a questa frequenza viene ridotta al 70%. A questo punto

posso decidere di eliminare tutte le sinusoidi o armoniche con frequenza

superiore o inferiore alla frequenza di cut off.

In questi casi esistono due tipi di filtri:

• Low-pass (passa-basso): lascia passare tutti i segnali a frequenza più

bassa della frequenza di cut off ed elimina gli altri.

In ordinata c’è il rapporto tra il

segnale in uscita e quello in

ingresso. F sta per frequenza di

c

cut off. Più la frequenza è alta di

quella di cut off, maggiore è la sua

eliminazione.

• High-pass (passa-alto): lascia passare tutti i segnali a frequenza più

alta della frequenza di cut off ed elimina gli altri. Può tornare utile per

preservare i picchi. Esistono anche altri filtri, come il passa

banda, che elimina le armoniche inferiori

e superiori a un certo valore:

Quello a reiezione di banda (notch) fa il contrario: elimina tutti i segnali

all’interno di un certo range: Si usa, per esempio, per eliminare

il noise da corrente alternata.

Questi due sono filtri meno usati,

ma possono tornare utili. Esistono

poi altri filtri ancora, come il filtro di

Gauss, il filtro RC.

Attenzione però! Non bisogna filtrare troppo perché potremmo eliminare

anche delle informazioni utili e distorcere il segnale: certe aperture e chiusure

con una filtrazione eccessiva potrebbero non essere più ben risolte. In genere

in esperimenti in singolo canale si usa una frequenza di cut off compresa tra i

3 e i 5kHz.

Regolazione della funzione dei canali ionici

2+

Modulazione dei canali Ca L-type

Alcuni canali possono venire regolati da recettori accoppiati alle proteine G, e

sono canali

composti da Una parte della proteina G attivata può interagire col

subunità con sette canale ionico oppure attivare un enzima effettore, che

domini produce un secondo messaggero in grado di

transmembrana. interagire col canale. Oppure il secondo messaggero

può attivare un enzima intracellulare (-> una chinasi)

in grado di fosforilare il canale, modulandone la

funzione. Analizziamo questi tre casi.

Diciamo di avere un recettore β-adrenergico in un

miocita. Quando arriva l’agonista (adrenalina o

noradrenalina) rilasciato dall’ortosimpatico, questo

attiva il recettore.

i

Il recettore attiva la proteina G.

 Attivazione dell’enzima (adenilato ciclasi).

 Produzione di cAMP, che interagisce con una la pkA.

 2+

del canale Ca di tipo L, che si apre .

Fosforilazione

Nel nostro esempio la fosforilazione può risultare in un aumento della forza di

2+

contrazione dei miociti ventricolari, parlando dei canali L-type-Ca , che già di

per sé si aprirebbero per la voltaggio dipendenza. Ma cosa succede a questi

canali di tipo L quando vengono fosforilati?

I grafici si riferiscono ad un esperimento in

2+

whole cell. In pratica i canali L-type-Ca si

aprono in seguito a una depolarizzazione

seguendo questo andamento.

 Qui invece il canale viene trattato con

isoproterenolo, che fa le veci della

noradrenalina (ricordiamo che sono recettori β-

adrenergici). La corrente è quadruplicata:

nell’arco di alcuni minuti dalla perfusione si

vede un graduale aumento di corrente. Se poi

applico un lavaggio dell’isoproterenolo, la

corrente diminuisce tornando ai livelli iniziali.

L’effetto è reversibile.

L’andamento temporale è nell’ordine dei minuti, compatibile con una serie di

azioni complesse, come una cascata enzimatica.

Ma la semplice applicazione di cAMP ha lo stesso effetto? Sarebbe carino

testarlo, ma cAMP non può attraversare la membrana.

Uso un analogo: orto-Br-cAMP o dibutiril-cAMP . Sono liposolubili,

 quindi possono entrare in membrana.

La curva è la stessa ed ha anche le stesse tempistiche perché l’analogo ha

bisogno di tempo per entrare in cellula; anche qui è reversibile lavando.

Questi canali devono essere regolati da recettori β-adrenergici.

Ma che effetto ha la fosforilazione su un’attività di singolo canale? Infatti la

corrente macroscopica è data da


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in neurobiologia
SSD:
Università: Pavia - Unipv
A.A.: 2014-2015

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher helektron89 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biofisica di membrana e elettrofisiologia e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Pavia - Unipv o del prof Toselli Mauro.

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