Biochimica - Riassunti completi

Proteine

Separazione delle proteine mediante elettroforesi

Una molecola provvista di una carica netta si muove in un campo elettrico: tale fenomeno è detto elettroforesi. È possibile separare le proteine mediante elettroforesi su un supporto costituito da acetato di cellulosa o da una soluzione di poliacrilamide. Esempio: l’emoglobina viene separata in laboratorio mediante elettroforesi. Per isolare l’emoglobina si "lava" il sangue mettendo della soluzione fisiologica isotonica per le cellule; si mette in centrifuga e si isolano così i globuli rossi. Ciò che rimane si mette in una lastrina di acetato di cellulosa e si mette a fare l’elettroforesi. Nella lastrina di acetato di cellulosa si mettono pochi millilitri di sangue di tre soggetti diversi, uno di questi è noto e perfettamente sano. Alla fine la lastrina si "colora" per vedere le proteine: non si hanno più le bande. Le piastrine si leggono in corsie verticali.

Supponiamo che il soggetto C abbia l’HbA2 al 2,5% e l’HbA1 al 97,5% e abbia tracce di HbF. Il soggetto 2 mostra un profilo elettroforetico diverso perché ha una percentuale maggiore di HbA2 rispetto al normale, perciò si arriva alla conclusione che il soggetto 2 sia portatore di B-talassemia.

Classificazione delle proteine

Le proteine sono molecole codificate geneticamente. Esse presentano almeno 40 residui amminoacidici: gli amminoacidi sono legati tra loro da legami peptidici. Le proteine si classificano in base a:

• Funzione:
  • Catalizzatori (enzimi)
  • Trasportatori (esempio: l’emoglobina trasporta O2 e CO2)
  • Strutturali (nella cellula fanno parte della membrana)
  • Contrattili (esempio: actina)
  • Di riserva
  • Regolatrici (ormoni)
  • Difesa (anticorpi)
• Composizione:
  • Semplici (esempio: albumina)
  • Coniugate: si legano a un gruppo molecolare estraneo alla proteina detto gruppo prostetico (esempio: emoglobina che si lega al gruppo eme, oppure la mioglobina)
• Numero di subunità:
  • Monomeriche: presentano solo una catena polipeptidica (esempio: mioglobina)
  • Oligomeriche: presentano più di una catena polipeptidica (esempio: emoglobina)
• Morfologia:
  • Globulari: sono mobili, solubili in acqua, le catene peptidiche sono strettamente ripiegate (interno idrofobico ed esterno idrofilico = molecole anfipatiche); all'interno di tale ripiegamento si formano "fessure" o "tasche" che servono per selezionare i composti con cui la proteina può interagire (esempio: tubulina)
  • Fibrose: sono stabili ed insolubili in acqua, la struttura peptidica risulta ripetitiva ed assemblata a formare filamenti (esempio: collagene)

Aminoacidi

Tutte le proteine sono polimeri costituiti da α-amminoacidi, chiamati così perché al carbonio "α" sono legati il gruppo amminico e il gruppo carbossilico. Gran parte delle reazioni metaboliche avviene a un pH fisiologico vicino alla neutralità: poiché a pH vicini alla neutralità il gruppo carbossilico sarà deprotonato mentre il gruppo amminico acquisterà un protone; il risultato è la forma Zwitterionica.

I geni di tutti gli organismi codificano per venti diversi amminoacidi, che vengono poi incorporati nelle proteine. Tutti gli amminoacidi incorporati dagli organismi nelle proteine sono nella forma L. I D-amminoacidi esistono in natura, ma, sebbene svolgano importanti ruoli biochimici, essi non sono presenti nelle proteine.

Proprietà delle catene laterali degli α-amminoacidi

I venti amminoacidi presentano, nelle proprie venti diverse catene laterali, un insieme di gruppi chimici diversi. È la diversità dei monomeri che permette alle proteine di esibire una varietà di strutture e proprietà e permette ad esse di avere una carica netta. Tali proprietà includono il carattere idrofobico o idrofilico, la natura polare o apolare e la presenza o meno di gruppi ionizzabili. La catena laterale di un amminoacido può essere alifatica (glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina), contenente zolfo o gruppi ossidrilici (cisteina), aromatica (tirosina, triptofano), basica (istidina, lisina, arginina), acida (acido aspartico).

Aminoacidi Alifatici

Man mano che la catena laterale di questi amminoacidi diventa più ingombrante, gli aminoacidi diventano sempre più idrofobici. Ad esempio l’isoleucina possiede una tendenza maggiore a trasferirsi dall’acqua a un solvente idrocarburico rispetto alla glicina.

Aminoacidi con catene laterali contenenti zolfo o gruppi ossidrilici

A causa delle loro catene laterali debolmente polari, questi aminoacidi sono più idrofilici degli alifatici (sebbene la metionina sia abbastanza idrofobica). La cisteina si distingue perché si dissocia a pH elevato e tra due catene laterali di cisteina si può avere un’ossidazione e la formazione di ponti solfuro.

Aminoacidi Aromatici

Gli amminoacidi aromatici sono fortemente idrofobici. Essi assorbono fortemente la luce nella regione dello spettro che corrisponde all’ultravioletto vicino: tale assorbimento viene spesso utilizzato per la determinazione analitica delle proteine.

Aminoacidi basici

Essi sono fortemente polari perciò si trovano sulla superficie esterna delle proteine, dove possono essere idrolizzati dall’ambiente acquoso circostante.

Aminoacidi acidi e ammidi corrispondenti

Acido aspartico e acido glutammico sono gli unici amminoacidi ad avere una carica negativa a pH = 7: i valori di pKa sono talmente bassi che, anche quando sono incorporati nelle proteine, la carica negativa della catena laterale viene conservata anche in condizioni fisiologiche.

Aminoacidi modificati

Solo i 20 amminoacidi precedentemente elencati sono codificati dal DNA (riconosciuti dal tRNA). Però, dopo il processo di traduzione, le proteine possono essere modificate con l’aggiunta di alcuni gruppi funzionali ai residui amminoacidici (sintesi post-traduzione). La sintesi post-traduzione può essere dovuta ad attacchi di altre molecole o di amminoacidi modificati. Le conseguenze di una sintesi post-traduzione si riscontrano nella funzionalità biologica della proteina rispetto a quella sintetizzata inizialmente (cambia: la solubilità, la stabilità, l’interazione con altre molecole, la localizzazione intracellulare).

I peptidi e il legame peptidico

Gli amminoacidi possono essere legati covalentemente per mezzo della formazione di un legame ammidico tra il gruppo α-carbossilico di un amminoacido e il gruppo α-aminico di un altro. Tale legame è definito legame peptidico e i prodotti di questo legame sono detti peptidi. Le catene peptidiche possono contenere pochi residui amminoacidici, e in tal caso sono dette oligopeptidi, oppure possono contenere tantissimi residui e in tal caso sono dette polipeptidi (tutte le proteine sono polipeptidi).

La maggior parte dei peptidi (fatta eccezione per i peptidi ciclici) mantengono un gruppo aminico terminale libero a un’estremità detta N-terminale o amino-terminale e un carbossile libero all’altra estremità della C-terminale o carbossi-terminale. La convenzione prevede che si scriva sempre l’N-terminale a sinistra e il C-terminale a destra.

Struttura del legame peptidico

Questo legame contiene alcune importanti proprietà per la struttura proteica. I legami C=O e N-H sono pressoché paralleli e gli atomi O, C, N e H sono complanari: è possibile solo una piccola torsione attorno al legame C-N poiché il legame peptidico possiede un sostanziale carattere di doppio legame. Esso può essere considerato un ibrido di risonanza. Sebbene sia complanare, il gruppo di atomi attorno al legame peptidico può esistere in una conformazione cis e una trans. La conformazione trans è di solito favorita poiché nella conformazione cis gli ingombranti gruppi R legati a carboni "α" adiacenti possono interferire.

Le proteine e le loro strutture

Le proteine sono polipeptidi a sequenza definita (dal gene!)

Struttura primaria

L’ordine dei residui amminoacidici definisce quella che è la struttura primaria della proteina. Le proteine evolvono per cambiamenti nelle loro sequenze amminoacidiche: alcuni cambiamenti sono detti conservativi, poiché un amminoacido viene sostituito con un altro che ha le stesse caratteristiche; altri sono detti non-conservativi poiché un amminoacido viene sostituito con un altro con caratteristiche totalmente diverse. Perciò un cambiamento della struttura primaria determina un cambiamento nella struttura e nella funzione della proteina. Per determinare quali amminoacidi costituiscono una proteina, prima si purifica la proteina tenendola in forma pura; si idrolizza la proteina nei suoi amminoacidi costituenti mediante trattamento con HCl 6M a 105°C: la miscela amminoacidica può essere dunque separata mediante cromatografia a scambio ionico così si può conoscere la quantità degli amminoacidi. Per conoscere la sequenza si può usare la degradazione di Edman che prevede una serie sequenziale di reazioni che rimuovono uno alla volta i residui dalla catena polipeptidica, partendo dall’N-terminale.

Struttura secondaria

La struttura secondaria è l’insieme dei motivi strutturali che esistono in virtù della composizione amminoacidica. Tra gli anni '30 e gli anni '50, Linus Pauling iniziò studi di diffrazione a raggi X su amminoacidi e piccoli peptidi. Nei primi anni '50 questi dati vennero utilizzati con un’intuizione scientifica non comune per dare inizio a un’analisi sistematica delle possibili conformazioni regolari della catena polipeptidica. Secondo i loro postulati, qualsiasi struttura di questo tipo dovrebbe possedere i seguenti requisiti:

• Le lunghezze e gli angoli di legame dovrebbero essere distorti il meno possibile rispetto a quelli riscontrati mediante studi di diffrazione a raggi X su amminoacidi e piccoli peptidi;
• Due atomi non dovrebbero avvicinarsi tra loro più di quanto sia loro consentito dai rispettivi raggi di Van der Waals;
• Il gruppo ammidico dovrebbe rimanere planare e nella configurazione trans, perciò la rotazione sarebbe possibile solo attorno ai due legami adiacenti al carbonio "α" di ogni residuo amminoacidico;
• Dovrebbero essere presenti legami deboli (ponti H, interazioni elettrostatiche etc.) per stabilizzare i ripiegamenti regolari (la possibilità più ovvia è costituita da legami idrogeno tra i protoni ammidici e gli atomi di ossigeno carbonilici).

Lavorando con modelli molecolari, Pauling e i suoi collaboratori individuarono due tipi di strutture regolari: l’α-elica e il β-foglietto.

Struttura ad α-elica

• Generalmente destrorsa
• In media ha 12 residui amminoacidici
• In ogni passono sono presenti 3,6 residui
• Il passo è 0,54 nm
• C’è diretta corrispondenza tra C=O e N-H di quattro residui avanti
• Legami idrogeno paralleli al passo dell’elica
• Gruppi R perpendicolari al passo
• Spazio di 0,15 nm

Struttura a β-foglietto

• Composta da 2 a 12 catene polipeptidiche con circa 15 residui amminoacidici per tratto
• Ogni residuo occupa 0,32-0,34 nm
• Il legame idrogeno si forma tra catene affiancate
• Ogni O carbonilico è unito tramite ponte H all’idrogeno dell’N-α-aminico fra segmenti diversi della stessa catena.
• Il passo è 0,7 nm
• Legami idrogeno perpendicolari alla catena
• La struttura può essere parallela o anti-parallela

Le proteine fibrose

Le proteine fibrose sono proteine con forma allungata che rivestono principalmente funzione strutturale in cellule e tessuti animali.

Le cheratine

Le α-cheratine sono i principali costituenti proteici di capelli e unghie e costituiscono una frazione sostanziale della pelle animale. Le α-cheratine sono membri di un ampio gruppo di proteine a filamenti intermedi che rivestono ruoli strutturali nel nucleo, nel citoplasma e sulle superfici di molte cellule. La struttura tipica di una α-cheratina è l’α-elica. Coppie di queste eliche si attorcigliano l’una sull’altra nella struttura a doppio avvolgimento (coiled coil) in senso sinistroso con andamento destroso. L’α-cheratina è una proteina poco reattiva e poco solubile per la presenza di amminoacidi idrofobici. Ciò che è importante per la stabilità di tale fibra è la presenza di residui di cisteina che, nell’avvolgimento delle fibre formano ponti solfuro tra residui adiacenti. Le β-cheratine contengono molta più struttura a foglietto β. Le si ritrovano soprattutto in uccelli e rettili in strutture come piume e scaglie.

La fibroina

Il più elegante utilizzo della struttura a β-foglietto è costituito dalle fibre filate dai bachi da seta e dai ragni. La fibroina della seta contiene lunghe sequenze a β-foglietto antiparallelo con le catene polipeptidiche che decorrono parallele all’asse della fibra. La composizione amminoacidica è periodica con un’elevata percentuale di glicina, serina e alanina. Il risultato di questa organizzazione è una fibra forte, relativamente inestensibile e molto flessibile. Non è costituita solo da β-foglietto: essa contiene altri residui amminoacidici, come valina e tirosina, che sono presenti nelle regioni ripiegate in modo compatto che interrompono periodicamente i foglietti β e probabilmente spiegano quel grado di estensibilità della seta. Anche la tela del ragno è resistentissima: i foglietti β sono antiparalleli e sono circondati da α-eliche e anse disordinate. Il β-foglietto conferisce resistenza mentre le α-eliche e le anse conferiscono elasticità.

Il collagene

Il collagene è alla base della solidità strutturale della maggior parte degli animali. È una componente resistente e non solubile dei tessuti connettivi (ossa, tendini, denti, cartilagine, matrice fibrosa e vasi). L’unità base della fibra di collagene è il tropocollagene, una tripla elica di tre catene polipeptidiche. Questa triplice struttura elicoidale si trova solo nel collagene. Le singole catene sono eliche sinistrose con circa 3,3 residui per giro. Tre di queste catene si avvolgono l’una sull’altra in senso destroso stabilendo legami idrogeno tra esse. Il tema ripetitivo nella sequenza è della forma Gly-X-Pro o Gly-X-HyPro: il collagene è atipico anche per la diffusa modificazione di prolina in idrossiprolina. La maggior parte dei legami idrogeno tra le catene nella tripla elica si formano tra i protoni ammidici e gli atomi di ossigeno carbonilici, ma anche i gruppi OH dell’idrossiprolina sembrano partecipare alla stabilizzazione della struttura. La presenza della prolina rende possibile l’andamento sinistroso. Nel collagene si riscontra anche l’idrossilazione dei residui di lisina: tale modificazione ha un ruolo differente in quanto serve per formare siti di legame per i polisaccaridi. Gli enzimi che catalizzano l’idrossilazione della prolina necessitano di vitamina C, una forte carenza di vitamina C porta allo scorbuto. Parte della solidità del collagene è dovuta al legame crociato delle molecole di tropocollagene le une alle altre in seguito a una reazione che riguarda le catene laterali di lisina.

Struttura terziaria

La struttura terziaria descrive come le proteine si posizionano nello spazio. La proteina è stabilizzata nella sua conformazione da legami ed interazioni deboli, tra cui ponti idrogeno, legami metallici, interazioni idrofobiche, saline ed elettrostatiche, e da ponti disolfuro che sono legami forti. In base alla struttura terziaria si distinguono proteine fibrose e proteine globulari.

Struttura quaternaria

È una struttura tipica delle proteine multimeriche, quindi costituite da due o più subunità. Tale organizzazione quaternaria può essere di due tipi: omotipica, se l’associazione avviene tra subunità identiche o quasi, ed eterotipica se l’associazione avviene tra subunità diverse tra loro.

Ripiegamenti diversi per funzioni diverse

Sebbene le proteine strutturali siano abbondanti nell’organismo, esse costituiscono solo una piccola frazione di tutte le specie proteiche di cui un organismo è dotato. La maggior parte del lavoro chimico di una cellula (trasporto, sintesi e metabolismo) avviene con l’aiuto di proteine globulari: esse sono definite così perché le loro catene polipeptidiche sono ripiegate in strutture compatte. Consideriamo ad esempio la mioglobina: è una proteina monomerica globulare costituita per il 70% da catene α-elica che si avvolgono a formare una molecola compatta all’interno della quale si forma una tasca che occupa il gruppo prostetico, l’eme. I gruppi prostetici, contenuti in molte proteine globulari, sono piccole molecole che si legano covalentemente o non covalentemente alle proteine rendendole capaci di adempiere a particolari funzioni. Esempio: il gruppo eme nell’emoglobina e nella mioglobina contiene il sito di legame per l’ossigeno. Molte proteine sono composte da più di un dominio, una regione di struttura terziaria compatta e ripiegata lateralmente. I domini sono interconnessi dalla catena polipeptidica che decorre lungo l’intera molecola.