Biochimica Matabolica e funzionale

Glicolisi

La glicolisi è un processo metabolico che serve a produrre energia, ovvero ATP, attraverso la trasformazione del glucosio. Innanzitutto i carboidrati, come li conosciamo, vengono lavorati a livello delle alfa amilasi salivari e pancreatiche. L'amido viene idrolizzato in amilosio e amilopectina. Dall'amilosio si ottengono di etri saccaridi di maltosio e maltotrioso, e dall'amilopectina si ottengono piccoli di e tri saccaridi come il maltotrioso, il maltosio, l'isomaltosio e le destrine.

A livello della lamina apicale dell'enterocita, infine, vi sono saccaridasi come l'isomaltasi, maltasi, galattasi e saccaridasi che scindono i vari disaccaridi in semplici glucidi. Il glucosio e il galattosio entrano dalla lamina apicale dell'enterocita attraverso un trasportatore SLGT specifico per il glucosio e il galattosio con un meccanismo di antiprotamento con il sodio, mentre i pentosi entrano per diffusione.

Il fruttosio, il glucosio e il galattosio escono attraverso un trasportatore GLUT 5 con meccanismo secondo gradiente. Ancora sulla lamina basale, il trasportatore GLUT 2 è specifico per il fruttosio e ha una bassa affinità per il glucosio. Sulla membrana baso laterale, i trasportatori GLUT 3 e GLUT 5 sono specifici per glucosio, galattosio e fruttosio.

Il glucosio ematico entra nella maggior parte delle cellule attraverso i trasportatori Glut 1 e Glut 3, entra nel fegato e nel pancreas attraverso i trasportatori Glut 2, entra nei muscoli e nel tessuto adiposo attraverso i trasportatori Glut 4 insulino dipendenti. Il glucosio, all'interno della cellula, viene fosforillato in glucosio-6-fosfato da un enzima della classe delle transferasi chiamato esochinasi. Esistono diverse isoforme di esochinasi.

Tappe della glicolisi

La seconda tappa della glicolisi è l'isomerizzazione del glucosio-6-fosfato in fruttosio-6-fosfato ad opera di un enzima facente parte della classe delle isomerasi detto fosfofruttochinasi esomerasi. La terza tappa avviene con l'aggiunta di un gruppo fosfato in posizione 1 al fruttosio-6-fosfato. Tale reazione è possibile grazie ad un enzima della classe delle transferasi detto fosfofruttochinasi. Esistono diverse isoforme della fosfofruttochinasi.

La tappa successiva è la formazione di gliceraldeide-3-fosfato e diidrossiacetonfosfato grazie all'intervento dell'enzima aldolasi che scinde il fruttosio-1,6-bifosfato. Il diidrossiacetonfosfato viene isomerizzato a gliceraldeide-3-fosfato da un enzima chiamato fosfofruttomutasi, appartenente alla classe delle isomerasi.

A questo punto vi è la formazione di 2 molecole di 1,3-difosfoglicerato grazie all'intervento di una deidrogenasi che promuove, oltre all'ossidazione, la fosforilazione della 3-fosfoglicerato in 1,3-bifosfoglicerato. Tale enzima appartiene alla classe delle ossidoriduttasi.

Successivamente, alla formazione delle 2 molecole di 1,3-bifosfoglicerato avviene la fosforilazione a livello del substrato con formazione di 2 molecole di ATP ad opera di una chinasi. Otteniamo dunque il 3-fosfoglicerato. Il 3-fosfoglicerato diviene 2-fosfoglicerato per opera di una mutasi appartenente alla classe delle isomerasi. A questo punto un enolasi appartenente alla classe delle liasi converte il 2-fosfoglicerato in fosfoenolpiruvato.

Ad opera di una piruvato chinasi, un enzima appartenente alla classe delle transferasi, vi è la fosforilazione a livello del substrato con la trasformazione di 2 molecole di fosfoenol piruvato in piruvato e la formazione di 2 molecole di ATP. Infine, il piruvato in presenza di ossigeno può essere trasferito nel mitocondrio e procedere verso il ciclo di krebs, oppure in assenza di ossigeno può essere convertito in lattato.

Tappe di regolazione della glicolisi

Le tappe di regolazione della glicolisi sono principalmente 3. Gli enzimi che regolano la glicolisi sono l'esochinasi, la fosfofruttochinasi e la piruvato chinasi. L'esochinasi è un enzima costitutivo di tutte le cellule ed è inibito da prodotto. A livello epatico, l'esochinasi si trova inattiva a livello nucleare ancorata ad una proteina che impedisce l'attività dell'enzima.

L'ingresso del glucosio nell'epatocita attraverso il trasportatore Glut 2 permette alla proteina regolatrice nucleare di distaccarsi dall'esochinasi epatica, anche detta glucochinasi. La glucochinasi dal nucleo si sposta a livello citoplasmatico e fosforilla il glucosio in posizione 6. La glucochinasi 4 è inibita dal fruttosio-6-fosfato.

La fosfofruttochinasi 1 (PFK1) è la seconda tappa di regolazione della glicolisi. È un enzima tetramerico, simile all'emoglobina, e può trovarsi in uno stato R e T. L'aumento della concentrazione di ADP, AMP e a livello epatico del fruttosio 2,6-bifosfato opera un controllo positivo. L'aumento delle concentrazioni di ATP, citrato e ioni H+ opera un controllo negativo sull'enzima inibendo l'attività. Tali molecole operano un controllo positivo o negativo attraverso siti allosterici. L'ATP, oltre ad avere un sito allosterico, possiede anche un sito come cosubstrato.

A livello epatico, il controllo positivo della fosfofruttochinasi 1 è regolato dalla concentrazione di fruttosio-1,2-bifosfato. A livello epatico esiste un'altra fosfofruttochinasi detta fosfofruttochinasi 2, un enzima dimerico avente capacità chinasica e fosforilasica. L'enzima defosforilato agisce come chinasi e come fosfatasi quando è fosforillato. L'insulina promuove la defosforilazione dell'enzima PFK2 il quale opera come chinasi producendo fruttosio-1,2-bifosfato. Le concentrazioni di fruttosio-1,2-bifosfato aumentano e attivano la PFK1. Il glucagone, attraverso la fosforilazione della PFK2, promuove la defosforilazione del fruttosio-1,2-bifosfato in fruttosio-1-fosfato. Le basse concentrazioni di fruttosio-1,2-bifosfato inibiscono la fosfofruttochinasi 1.

La piruvato chinasi (PK) è anch'esso un enzima che regola la tappa della glicolisi in modo irreversibile. È un enzima costituito da 4 subunità dimeriche che si assemblano mediante controllo allosterico con alte concentrazioni di fruttosio-1,6-bifosfato. L'ATP e l'alanina operano un controllo enzimatico negativo. A livello epatico, la piruvato chinasi è regolata da fosforilazione e defosforilazione ad opera di insulina e glucagone. L'insulina promuove la defosforilazione dell'enzima attivandolo. Il glucagone promuove la fosforilazione dell'enzima disattivandolo.

Piruvato deidrogenasi

La glicolisi aerobica produce 2 molecole di piruvato per ogni molecola di glucosio. Il piruvato è una molecola potenzialmente energetica. Attraverso un trasportatore detto traslocasi, il piruvato attraversa la membrana mitocondriale interna. All'interno del mitocondrio, il piruvato viene convertito in acetato, il quale entrerà nella via metabolica del ciclo di krebs per essere ossidato a CO₂.

L'enzima o il complesso multienzimatico che converte il piruvato in acetato all'interno del mitocondrio è la Piruvato deidrogenasi.

La piruvato deidrogenasi è un complesso multienzimatico formato da 3 enzimi:

• La piruvato deidrogenasi detta E1
• Diidrolipoiltransacetilasi detta E2
• Diidrolipoil deidrogenasi detta E3

Tali enzimi utilizzano coenzimi specifici:

• La piruvato deidrogenasi detta E1 utilizza Tiamina pirofosfato
• Diidrolipoiltransacetilasi detta E2 utilizza acido diidrolipoico e CoA
• Diidrolipoil deidrogenasi detta E3 utilizza FAD+ e NAD+

Nella piruvato deidrogenasi dei mammiferi sono presenti chinasi e fosfatasi. La molecola di piruvato viene catturata dalla tiamina pirofosfato presente nell'enzima E1 della piruvato deidrogenasi. Avviene la decarbossilazione del piruvato con la formazione di una molecola di acetato. L'acetato viene trasferito all'enzima E2 e si lega all'acido diidrolipoico connesso all'enzima attraverso un legame ammidico con la lisina. La catena carboniosa della lisina forma un braccio oscillante con l'acido diidrolipoico permettendo così lo spostamento del coenzima lungo le varie tappe metaboliche. Una molecola di AcetilCoA si lega al secondo zolfo dell'acido lipoico. Avviene la transacilazione del coenzima A con l'acetile, si ottiene acetil CoA. L'acido lipoico ossidatosi durante la transacilazione viene ridotto dall'enzima E3 con un meccanismo NADH+H⁺, FADH₂ dipendente.

La piruvato deidrogenasi viene finemente regolata sia in modo allosterico che in modo covalente. I rapporti di ATP/ADP, NADH/NAD⁺, AcetilCoA/CoA influenzano l'enzima in modo positivo o negativo. La piruvato deidrogenasi può essere regolato in modo covalente tramite fosforilazione (inattivazione) e defosforilazione (attivazione).

Ciclo di Krebs

Il piruvato derivante dalla glicolisi viene convertito in Acetil-CoA, il quale entra nel ciclo di krebs ed è ossidato a CO₂. L'ossidazione dell'acetil-CoA porta alla formazione di equivalenti riducenti FADH₂ e NADH + H⁺ che producono ATP attraverso la fosforilazione ossidativa, e alla produzione di GTP che viene convertito in ATP. Il ciclo di krebs è anche detto ciclo degli acidi tricarbossilici.

La via degli acidi tricarbossilici è una via sia catabolica che anabolica, per cui quando si parla di via metabolica si parla di via anfibolica. Il ciclo di krebs è la via comune per la degradazione ossidativa di tutti i nutrienti energetici come lipidi, proteine e carboidrati.

Gli enzimi del ciclo di krebs sono tutti solubili nella matrice mitocondriale, ad eccezione della succinato deidrogenasi. Le tappe del ciclo di krebs sono 8, l'acetil-CoA viene trasformato in citrato da un enzima appartenente alla classe delle sintasi detta appunto citrato sintasi. L'enzima utilizza una molecola di ossalacetato e l'acetil-CoA.

Nella prima tappa, la citrato sintasi appartenente alla classe delle liasi condensa una molecola di ossalacetato e una di acetilCoA, ottenendo una molecola di citrato. Un enzima della classe delle liasi, l'aconitasi, un enzima con centri ferro zolfo deidrata il citrato che diviene aconitato e poi reidrata la molecola che diviene isocitrato. L'enzima potrebbe riconoscere entrambi i bracci che sono simmetrici ma in realtà lega il braccio proveniente dall'ossalacetato. L'isocitrato viene convertito in alfachetoglutarato dall'enzima isocitrato deidrogenasi NADH dipendente. L'alfachetoglutarato deidrogenasi NADH dipendente, un enzima simile alla piruvato deidrogenasi, composto da un complesso multienzimatico E1, E2 ed E3. Converte l'alfa chetoglutarato in succinil-CoA.

Successivamente, la succinilCoA sintetasi (si riferisce alla reazione inversa) accoppia l'energia della rottura del legame tiostereo con la sintesi di GTP. Avviene la fosforilazione a livello del substrato. Una nucleotide difosfato chinasi converte in GTP in GDP e l'ADP in ATP trasferendo un gruppo fosfato dal GTP all'ADP.

La succinato deidrogenasi, unico enzima associato alla membrana mitocondriale interna, è una DH flavinica (4 subunità) FAD dipendente (flavoproteina II), possiede proteine eme citocromo b 560 e tre centri FeS. È detta anche complesso II o succinato deidrogenasi ubichinone-ossidoreduttasi. Trasferisce equivalenti riducenti dal FADH₂ al complesso Q. Ossida il succinato a fumarato.

La fumarasi (opera la reazione inversa), appartenente alla classe delle liasi, idrata il fumarato convertendolo in malato. La malato deidrogenasi NAD dipendente ossida il malato in ossalacetato. Resa energetica: 1 FADH, 3NADH e 1 GTP (ATP).

Trasporto degli elettroni

Il NADH non può attraversare la membrana mitocondriale interna. Esistono sistemi navetta per il trasporto degli elettroni. Il sistema glicerolo-3-fosfato/diidrossiacetonfosfato è unidirezionale. Il NADH riduce il diidrossiacetonfosfato in glicerolo-3-fosfato, il quale trasporta equivalenti riducenti all'interno della membrana mitocondriale interna. Qui viene ossidato a diidrossiacetonfosfato da una flavoproteina della catena respiratoria mitocondriale FADH dipendente.

Un altro sistema per il trasporto di equivalenti riducenti è il sistema navetta malato-aspartato. Il malato entra nella membrana mitocondriale interna attraverso un trasportatore per il malato. Qui viene ossidato ad ossalacetato grazie all'enzima malato deidrogenasi NADH dipendente. Una transamminasi detta GOT o AST mitocondriale trasferisce un gruppo amminico dal glutammato all'ossalacetato. L'ossalacetato diviene aspartato ed esce dalla cellula attraverso un traslocasi specifico. Qui l'aspartato viene convertito in ossalacetato dalla AST mitocondriale. Il glutammato prodotto dall'alfachetoglutarato di partenza entra nel mitocondrio e l'ossalacetato viene ridotto dalla malato deidrogenasi citosolica NADH dipendente. La navetta glicerolo-3-fosfato/diidrossiacetonfosfato produce 1 FADH ridotto equivalente a 2 ATP. La navetta malato/aspartato produce 1 NADH ridotto equivalente a 3 ATP.

Metabolismo del glicogeno

Sintesi di glicogeno

Il glicogeno è un omopolisaccaride ramificato che viene accumulato principalmente in muscolo e fegato. Serve come riserva di energia; il glicogeno viene scisso quando il nostro organismo ha bisogno di glucosio. Le tappe metaboliche che portano alla formazione del glicogeno sono dette glicogenosintesi. Il metabolismo del glicogeno è finemente regolato. La prima tappa della glicogenosintesi è la fosfo glucosio mutasi, un enzima appartenente alla classe delle isomerasi, che converte il glucosio-6-fosfato in glucosio-1-fosfato.

La seconda tappa avviene ad opera dell'enzima Glucosio-1-fosfato (G1P) uridil transferasi (UDP pirofosforilasi), trasferisce una molecola di UMP al G1P diventando così Uridinadifosfato-glucosio (UDPG). La pirofosforolisi a carico del pirofosfato avviene subito dopo il trasferimento del Glucosio-1-fosfato all'UMP. A questo punto, una proteina chiamata glicogenina attraverso un ossidrile tirosinico lega il glucosio dell'UDPG, producendo UDP e glucosio. La proteina ha attività autocatalitiche, si lega alla glicogenosintasi e sintetizza un polisaccaride di 8 molecole di glucosio aggiungendo ulteriori 7 residui di glucosio. L'UDP viene ripristinato a UTP da una chinasi ATP dipendente.

A questo punto, la glicogeno sintasi incorpora glucosio in una catena preformata detta primer e continua nella sintesi del glicogeno fino a formare catene omopolisaccaridiche di almeno 11 residui di glucosio. Interviene a questo punto un ulteriore enzima detto enzima ramificatore che stacca dalla catena principale omopolisaccaridica di almeno 11 molecole di glucosio, un residuo di almeno 7 molecole di glucosio inserendola sulla quarta molecola di glucosio della catena che ormai è a 4 atomi di glucosio. L'attacco avviene in posizione alfa-1,6, questo è il primo punto di ramificazione.

La glicogeno sintasi continua con la sintesi della catena omopolisaccaridica sintetizzando una catena di massimo 14 molecole glucidiche. L'enzima ramificatore continua ad inserire omopolisaccaridi a 7 residui di glucosio con una distanza di 4 molecole di glucosio alla catena ramificata. Ogni catena di glucosio a circa 14 atomi di glucosio possiede massimo due ramificazioni. Ogni catena ramificata viene allungata dalla glicogeno sintasi fino ad un massimo di 14 molecole di glucosio e così via, l'enzima ramificatore continua ad inserire polisaccaridi a 7 atomi di glucosio in posizione alfa-1,6 ogni 4 residui di una nuova ramificazione. Ad un certo punto, l'azione combinata della glicogeno sintasi e dell'enzima ramificatore porta alla formazione di una molecola che assume la forma di un granulo.

Regolazioni enzimatiche della sintesi di glicogeno

La glicogeno sintasi è un omotetramero che viene regolato in modo covalente o in modo allosterico. L'enzima defosforillato è attivo, mentre è inattivo quando è fosforilato. La fosforilazione o defosforilazione dell'enzima mediante un controllo covalente avviene grazie al controllo ormonale e alle concentrazioni di calcio. Oppure, la regolazione di tipo allosterico differisce a seconda che questa si trovi nel fegato o nel muscolo. Nel fegato l'enzima può essere attivato dalla concentrazione di glucosio. Nel muscolo l'enzima può essere inattivato dall'aumento di glicogeno.

Glicogeno lisi

La prima tappa della glicogeno lisi parte dalla glicogeno fosforilasi. La glicogeno fosforilasi libera unità glicosidiche attraverso la fosforolisi e non l'idrolisi. È un enzima piridossalfosfato dipendente, stacca il legame alfa-1,4 glicosidico e utilizza un gruppo fosfato per trasferire gran parte dell'energia di rottura al glucosio.

La seconda tappa della glicogenolisi è data dall'enzima deramificatore che trasferisce 3 residui glicosidici ad una catena vicina non riducente. Quando la catena ramificata è all'ultimo glucosio legato ad un'altra catena con legame alfa-1,6-glucosidico, interviene l'enzima glucosidasi che scinde il legame alfa-1,6 del punto di ramificazione attraverso idrolisi.

Successivamente, un enzima appartenente alla classe delle isomerasi, la fosfoglucomutasi, converte il glucosio-1-fosfato in glucosio-6-fosfato. Il glucosio-6-fosfato nel fegato, intestino e rene, entra all'interno del reticolo endoplasmatico e viene convertito in glucosio dalla glucosio-6-fosfatasi. Il glucosio e il fosfato escono dai trasportatori specifici dal RE e dal citoplasma attraverso il trasportatore GLUT2. Il glucosio esce dalla cellula e viene immesso nel circolo ematico.

Regolazione del catabolismo del glicogeno

La glicogeno fosforilasi può essere regolata da ormoni o dalla concentrazione di calcio in modo covalente. Fosforilata è attiva, defosforilata è inattiva. La glicogeno fosforilasi può essere controllata in modo allosterico. Nel muscolo è un dimero, l'AMP è un effettore allosterico positivo. L'ATP è un effettore allosterico negativo. Nel fegato si presenta come un tetramero, il glucosio è un affettore allosterico negativo.

Shunt dell'esoso monofosfato

Lo shunt dell'esoso monofosfato è una via ossidativa citoplasmatica, presente in tutte le cellule ma attiva specialmente in tessuti a rapida proliferazione.