Biochimica II – Ormoni

Biochimica degli ormoni

Natura e azione degli ormoni

Quasi tutti i tessuti immettono nel circolo sanguigno prodotti chimici atti ad influenzare tessuti più o meno lontani, ma solo alcune cellule, raggruppate a formare le ghiandole endocrine, si sono specializzate in questa funzione, producendo ormoni.

• Ormoni paracrini: interagiscono con e influenzano cellule vicine.
• Ormoni autocrini: agiscono sulle stesse cellule che li hanno prodotti.

Gli ormoni esplicano la loro attività solo a livello di cellule bersaglio, dotate di recettori capaci di riconoscerli. Le modificazioni funzionali (e a volte anche strutturali) indotte dagli ormoni soddisfano l’esigenza di adattare l’organismo alle condizioni imposte dall’ambiente esterno o interno (omeostasi).

Classificazione degli ormoni

• Ormoni proteici e peptidici: insulina, glucagone, ormoni ipofisari, paratormone, calcitonina e quasi tutti gli ormoni tissutali.
• Ormoni steroidei: corticosurrenalici e sessuali.
• Ormoni derivati dagli amminoacidi: adrenalina, noradrenalina, tiroxina e triiodotironina.
• Ormoni derivati dagli acidi grassi: eicosanoidi.
• Ormoni derivati dalla vitamina D2 e D3.

Gli ormoni peptidici e proteici come pure adrenalina, noradrenalina (di natura idrofilica) circolano nel sangue liberi. Gli ormoni steroidei, la tiroxina, la triiodotironina e l'1,25-diidrossicalciferolo (derivato dalla D3), tutti di natura idrofobica, sono veicolati nel sangue da proteine leganti specifiche. Nessun ormone viene prodotto e secreto con ritmo uniforme ma secondo cicli o in seguito a determinati stimoli (secrezione pulsatoria). La vita media degli ormoni è piuttosto breve; infatti, esplicata la loro azione, vengono rapidamente inattivati ed eventualmente secreti. Ciò soddisfa l’esigenza di una risposta ormonale adeguatamente controllata e transitoria.

Recettori ormonali

I recettori ormonali sono proteine (spesso glicoproteine) capaci di riconoscere e legare l’ormone. L’interazione ormone-recettore è caratterizzata da un’elevata specificità. L’affinità elevatissima dei recettori risponde all’esigenza del tessuto bersaglio di legare il maggior numero possibile delle non molte molecole dell’ormone rilasciate in circolo dalle ghiandole endocrine.

Interazioni ormone-recettore

Il legame tra ormone [H] e recettore [R] e la conseguente formazione del complesso ormone-recettore costituisce il primo atto dell’azione ormonale (K1 e K2 sono le velocità dei processi di associazione e dissociazione dell’ormone al e dal recettore).

[H] + [R] ⇌ [HR]

All’equilibrio di reazione la costante di associazione, Ka, è uguale all’inverso della costante di dissociazione, Kd: Ka = [HR] / [H] + [R] = K1/K2 = 1/Kd. Il valore di Ka è indice dell’affinità dell’ormone per il suo recettore; è importante anche la Bmax, ovvero la massima capacità legante da parte del recettore. Sperimentalmente, in un sistema in cui il recettore rimane costante e l’ormone è aggiunto in quantità crescente, dopo un tempo prestabilito di incubazione tale da consentire di raggiungere l’equilibrio di reazione, si misurano la quota di ormone legata ([B]) cioè [HR] e la quota libera ([F]). La relazione che esiste tra B e la quantità di ormone aggiunto è di tipo iperbolico. La rappresentazione secondo Scatchard degli stessi dati in cui sull’ascissa sono riportati i valori di [HR] e sulle ordinate il rapporto [HR]/[H] è espressa da una retta la cui intercetta sull’asse dell’ascissa dà il valore di Bmax e la cui pendenza è uguale a – 1/Kd e quindi dà il valore di Kd (o Ka). Con [H] = quantità totale di ormone usato.

La saturazione del recettore si ottiene con concentrazioni di ormone 20 volte maggiori rispetto al valore della Kd. Inoltre, il grafico di prima può indicare anche la presenza nel recettore di siti di maggiore o minore affinità; infatti, se al posto della retta, si trovasse una spezzata con una prima porzione rettilinea di maggiore pendenza e una seconda porzione di minore pendenza, il primo tratto indicherebbe la presenza di un sito ad alta affinità, il secondo tratto un sito a bassa affinità.

Caratteristiche molecolari dei recettori

La gran parte degli ormoni trovano i corrispondenti recettori sulle membrane plasmatiche delle cellule bersaglio: recettori di membrana. Gli altri ormoni, di natura idrofobica, trovano i corrispondenti recettori all’interno della cellula:

• Nel citoplasma: ormoni corticosteroidi.
• Nel nucleo: ormoni steroidei, sessuali, tiroidei e ormone derivante dalla vitamina D.

L’azione degli ormoni che hanno recettori di membrana consiste nell’attivare, attraverso l’interazione col recettore, un processo di trasduzione dei segnali attraverso la membrana con produzione spesso di un secondo messaggero. Il messaggero secondario a sua volta dà inizio ad una cascata di reazioni con produzione dell’effetto metabolico-funzionale finale che è proprio dell’ormone. Per interagire con i recettori citoplasmatici o nucleari, i relativi ormoni devono invece entrare nella cellula. Il loro passaggio attraverso la membrana avviene di solito per trasporto facilitato con intervento di specifiche proteine carrier di membrana. In tal modo anche per questi ormoni la membrana esplica un riconoscimento specifico.

Recettori citoplasmatici

La struttura di questi recettori presenta quattro principali motivi o domini funzionali, a partire dall’estremità aminoterminale:

• Il dominio a struttura variabile (detto anche antigenico) responsabile delle interazioni che riguardano la modulazione del processo di trascrizione.
• Il dominio di interazione con il DNA che lega specifiche porzioni del DNA dette elementi di risposta all’ormone (HRE) ed è responsabile dell’innesco del processo di trascrizione. Contiene strutture a dita di zinco in grado di legare DNA.
• Il dominio di riconoscimento e orientamento nel nucleo.
• Il dominio di interazione con l’ormone, il quale, quando occupato dall’ormone, conferisce al recettore la conformazione attiva con conseguente avvio della trascrizione. In questo sono presenti due sottodomini, uno pure partecipante alla modulazione del processo di trascrizione e l’altro legante particolari proteine chaperon (da shock termico, HSP).

L’ingresso dell’ormone, provocando dimerizzazione del recettore, spiazza le HSP, facendo assumere al recettore la forma attiva, con conseguente attacco all’HRE: la trascrizione del gene strutturale specifico ha così inizio. L’HRE, associato a diverse proteine implicate nel processo di repressione/attivazione della trascrizione, costituisce l’unità di risposta ormonale, HRU.

Recettori nucleari

La struttura è simile a quella qui sopra descritta, ma il dominio di legame con l’ormone è sprovvisto dei sottodomini leganti le HSP e modulante la trascrizione. Uno dei meccanismi con cui un tessuto può modificare la risposta ad un ormone è la variazione del numero dei recettori. Per esempio, un eccesso di ormone può indurre la diminuzione abbastanza rapida dei relativi recettori, dovuta ad internalizzazione del complesso ormone-recettore con meccanismo endocitotico (down-regulation).

Meccanismi di azione degli ormoni

La cellula risponde allo stimolo creato dall’interazione ormone-recettore in tre modi:

• Incentivando la sintesi di determinate proteine.
• Modificando la permeabilità delle membrane cellulari a sostanze specifiche.
• Modulando (stimolando o inibendo) l’attività di determinati enzimi.

Il meccanismo 1 implica risposte piuttosto lente ma durature; i meccanismi 2 e 3 evocano risposte rapide ma fugaci. Alcuni ormoni agiscono tramite uno di questi meccanismi, altri tramite più meccanismi contemporaneamente. L’insulina, ad esempio, agisce con i meccanismi 1 e 2 e probabilmente anche 3. Lo stesso ormone può anche agire con meccanismi diversi a livello di differenti tessuti bersaglio.

Azione sulla sintesi proteica

Stimolazione della trascrizione

Modalità tipica di molti ormoni di natura lipofilica. In alcuni casi l’interazione tra il complesso ormone-recettore e il corrispondente HRE è sufficiente ad attivare il sistema genico promotore consentendo l’inizio della trascrizione del gene strutturale. In altri casi il processo di attivazione è più complesso e richiede l’intervento oltre che dell’HRE, di altri elementi di DNA e di fattori proteici di trascrizione. L’insieme di tutti questi elementi costituisce l’HRU, l’unità di risposta all’ormone.

La comunicazione tra una HRU e l’apparato trascrizionale richiede a sua volta la partecipazione di una o più proteine che costituiscono la classe dei co-regolatori. Co-regolatori sono ad esempio:

• La proteina legante CREB, detta CBP.
• La proteina p300, spesso associata a CBP.

Il complesso CBP-p300 può esprimere attività acil-trasferasica su gruppi amminici di istoni facilitando il distacco di questi dal DNA. Anche ormoni idrofilici hanno la possibilità di innescare la trascrizione di geni strutturali specifici, promuovendo l’attivazione di particolari proteine intranucleari, a loro volta attivanti co-regolatori della trascrizione. Gli effetti di questi ormoni sono inibiti da parte della Actinomicina D, un inibitore appunto della trascrizione!

Stimolazione della traduzione

Alcuni ormoni stimolano la sintesi proteica attivando la fase di traduzione. Nel caso di questi ormoni, i loro effetti funzionali non sono inibiti da parte della Actinomicina D! I meccanismi molecolari di questi effetti sono poco noti.

Azione sulla permeabilità delle membrane cellulari

Alcuni ormoni agiscono modificando il trasporto di taluni nutrienti attraverso le membrane cellulari. Tipico esempio è quello dell’insulina, a livello del sarcolemma delle cellule del muscolo scheletrico o della membrana plasmatica degli adipociti. Il trasporto del glucosio o degli aminoacidi attraverso queste membrane è attivo solo in presenza di insulina. I carrier dei nutrienti vengono cioè attivati nel momento in cui l’ormone si lega al suo specifico recettore di membrana.

Controllo della proliferazione cellulare: proto-oncogeni e geni soppressori della crescita tumorale

Sono noti geni mutati, chiamati oncogeni, che producono proteine non più regolabili, con conseguente proliferazione non controllata e sviluppo di tumori. I corrispondenti geni normali sono chiamati proto-oncogeni. Sono pure noti geni (chiamati geni soppressori della crescita tumorale) che esprimono proteine il cui ruolo fisiologico è di interrompere il processo proliferativo.

Ormoni polipeptidici

Molti organismi e moltissime cellule sono capaci di produrre ormoni di natura polipeptidica. Vengono sintetizzati con il meccanismo generale della sintesi proteica e per quelli di natura glicoproteica, il completamento della molecola per aggiunta della porzione glicidica, avviene nell’apparato di Golgi. Gli ormoni polipeptidici vengono inattivati per degradazione idrolitica catalizzata o da proteasi specifiche, come nel caso dell’insulina (insulinasi) e della angiotensina II (angiotensinasi) o da proteasi non specifiche.

Ormoni del pancreas

Insulina

Struttura

La molecola d’insulina è formata da due catene polipeptidiche (A e B) formate rispettivamente da 21 e 30 amminoacidi. La struttura tridimensionale è assai compatta, anche per i numerosi legami salini ed idrogeno che, in aggiunta ai due legami disolfuro, tengono coese le due catene A e B. In soluzione, le molecole di insulina tendono ad aggregarsi in strutture dimeriche, tetrameriche o esameriche. La struttura quaternaria più facilmente assunta dall’insulina in presenza di zinco (è appunto la zinco-insulina che viene secreta dal pancreas) è quella esamerica. Due atomi di Zn ubicati nel cuore di tale struttura servono a stabilizzarla.

Si ritiene che l’insulina venga secreta dalle cellule β- (o B) pancreatiche (isole di Langerhans) in forma esamerica, ma che la sua azione a livello delle cellule bersaglio venga esplicata nella forma monomerica.

Biosintesi e catabolismo

Il gene dell’insulina nell’uomo si trova nel braccio corto del cromosoma 11 e viene sintetizzata in forma di precursore inattivo, la proinsulina. Questa consta di una unica catena polipeptidica formata da 78 a 86 residui. I due segmenti N- e C- terminali andranno a costituire rispettivamente le catene B e A dell’insulina, mentre il segmento intermedio (peptide C o peptide di connessione) viene distaccato al momento della conversione proinsulina insulina.

È la lunghezza del peptide C di connessione a variare da specie a specie; questo è connesso con i due segmenti esterni da due coppie di amino acidi basici. In realtà, la catena della proinsulina viene sintetizzata in forma di una proteina più complessa, la pre-proinsulina. È nell’ambito della pre-proinsulina che si formano i ponti disolfuro che caratterizzano l’insulina. La trasformazione pre-proinsulina proinsulina è catalizzata da un enzima tripsino simile negli spazi luminali del reticolo endoplasmatico non appena la pre-proinsulina vi penetra a sintesi ultimata. Il peptide N-terminale della pre-proinsulina è detto peptide leader, in quanto dirige la neo formata pre-proinsulina alla sua specifica destinazione: le vescicole del reticolo endoplasmatico. La capacità della pre-proinsulina di attraversare le membrane intracellulari è conferita dalla idrofobicità del segmento leader, ricco di aminoacidi idrofobici. La proinsulina viene trasformata in insulina nell’apparato di Golgi e in parte anche in vescicole gemmate del Golgi (vescicole β) nelle quali insulina e una residua parte di proinsulina vengono depositate.

Pre-proinsulina → Proinsulina → Insulina

(104 amminoacidi → 81 amminoacidi → 51 amminoacidi)

La esocitosi delle vescicole β è preceduta dalla fusione della membrana delimitante le vescicole con la membrana plasmatica. È infatti la secrezione dell’insulina preformata, non la sua sintesi, l’evento immediatamente conseguente alla stimolazione delle cellule β. La secrezione nel sangue di quantità stechiometriche di insulina e di peptide C consente di utilizzare la concentrazione ematica di quest’ultimo come indice di secrezione dell’insulina endogena nei soggetti diabetici, ai quali viene somministrata insulina (esogena). Il rilascio dell’insulina dalle cellule β è preceduto da un aumento della concentrazione citoplasmatica dei Ca²⁺, condizione necessaria per la fusione delle vescicole β con la membrana plasmatica!

L’insulina viene secreta nella vena pancreatica, che si riversa nel sistema portale. Prima di entrare nel circolo generale passa quindi attraverso il fegato, dove viene in parte demolita. Nell’uomo la vita media dell’insulina circolante è di 7-15 minuti. Responsabili della sua inattivazione sono enzimi proteolitici contenuti nei lisosomi dei tessuti che la utilizzano. Il fegato possiede anche la glutatione-insulina-trans-idrogenasi che inattiva l’insulina riducendo in tioli i ponti disolfuro che tengono unite le due catene A e B. Una volta separate, le due catene vengono demolite da proteasi lisosomali denominate complessivamente “insulinasi”.

Regolazione della secrezione dell’insulina

La quantità di insulina secreta pro die è circa 1 unità/kg di peso. Nei soggetti adulti la quantità immagazzinata nel pancreas, sia in forma di insulina che di proinsulina, è pari a 350-400 unità. I due principali fattori di regolazione della secrezione dell’insulina sono:

• La glicemia.
• Il glucagone.

Lo stimolo da glucosio implica due processi:

1. Il legame del glucosio al suo recettore specifico (glucorecettore).
2. La formazione di un intermedio metabolico, connesso alla glicolisi, entro le cellule.

La combinazione di questi due processi determina un aumento di Ca²⁺ nelle cellule β ed una ridistribuzione intracellulare di questo catione. La risposta secretoria di insulina alla stimolazione da glucosio è tipicamente bifasica: con un primo picco meno accentuato e più breve, seguito da un secondo picco più accentuato e di maggior durata. Il meccanismo di stimolazione da parte del glucagone è certamente secondario alla sua azione sulla formazione del cAMP, ma il modo con cui l’aumentata concentrazione cellulare di cAMP si traduce in aumentata secrezione di insulina non è ancora noto. Pertanto Ca²⁺ e cAMP segnalano entro le cellule β l’azione del glucosio e del glucagone rispettivamente; in entrambi i casi ne consegue stimolazione della secrezione insulinica.

I recettori dell'insulina

Fondamentalmente i tessuti bersaglio di questo ormone sono il fegato, il muscolo e il tessuto adiposo. I recettori dell’insulina, di natura glicoproteica, sono saldamenti ancorati alla membrana plasmatica. Sono recettori ad unica porzione α-elicizzata intramembrana in forma di dimeri tenuti legati da un ponte disolfuro. Altri recettori si trovano all’interno della cellula. Il numero dei recettori di superficie può diminuire o per diminuita sintesi o per aumentata demolizione o per internalizzazione. Questa possibilità di variazione nel numero dei recettori costituisce il più importante fattore di controllo della sensibilità delle cellule all’insulina! La insulino resistenza è infatti spesso determinata da una diminuzione nel numero dei recettori di membrana. Un epatocita contiene 1700 recettori circa ed un adipocita ne contiene 10.000 circa; è tuttavia sufficiente che l’insulina si leghi ad un decimo circa di questi recettori per evocare nell’adipocita una sensibile risposta metabolica.