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Biochimica I – Proteine Appunti scolastici Premium

Appunti di Biochimica I sulle Proteine. Nello specifico gli argomenti trattati sono i seguenti: Mantenimento della morfologia delle varie strutture, proteine di trasporto(emoglobina), Enzimi, Trasformazione da una forma di energia ad un’altra, Amminoacidi essenziali, ecc.

Esame di Biochimica I docente Prof. G. Camici

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ESTRATTO DOCUMENTO

OSSI, CONFORMAZIONE R

La forma T è detta così per l’aggettivo inglese tight=tesa, dando l’idea di una

proteina difficilmente accessibile all’O, tanto che se se quando assume

questa forma l’O è ancora legato viene escluso.

Consiste in una struttura dove oltre alle forme di coesione, tra i 4 monomeri ci

sono ponti salini (legami ionici).

I legami ionici sono 8 e sono simmetrici, possono essere intracatena e

intercatena.

3+

NH Asp His COO-

94 146 3+

COO- Arg Asp Lys NH

141 126 40

3+

NH Lys Asp Arg COO-

40 126 141 3+

COO- His Asp NH

146 94

INTRACATENA ad es. nelle catene l’Asp 94 carico negativamente con

l’His 146, l’ultimo amminoacido e che quindi ha ‘ultimo COOH libero.

INTERCATENA ad es. l’His 146 (catena ) con il gruppo COO- con la Lys 40

(catena ), ciò accade anche nell’altro dimero – .

  

Tra le due catene ci sono 2 coppie di ponti salini. Tra N terminale e C

a

terminale dell’altra e tra Arg 141 e Asp 126. 30

Questi legami stabilizzano la forma T, in questa forma l’O è difficilmente

2

accessibile ad uno dei 4 gruppi eme, perché:

Il piano dell’eme nella forma T è un po’ concavo.

 Il Fe legato all’His F8 non si trova al centro del gruppo eme ma lo

 sovrasta di 0,6 A°.

Questo accade per un impedimento sterico realizzato da residui, fra cui il più

significativo è la Valina dell’ansa FG.

Va ricordato che il Fe ha n°atomico 26, rientra negli elementi di transizione

(che hanno orbitali incompleti, con elettroni spaiati ed orbitali liberi)

↑↓ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑↓

Fe 3d 4s 4p

Quando diventa ione ferroso, vengono perduti 2 e- dell’orbitale 4s, quindi

rimangono vuoti 4s 4p 5s che possono ospitare i 4 N pirrolici e l’ His F8.

2+

Il Fe diventa pentacordinato. Il Fe non si trova sul piano dell’eme, grazie al

fatto che gli e- dell’orbitale si trovano ad alto spin (ospitano il maggior numero

di orbitali liberi). Le dimensioni dello ione e l’impedimento dell’ansa FG non lo

rendono in grado di trovarsi al centro dell’eme.

2+ ↑↓ ↑ ↑ ↑ ↑

Fe

Alto

spin 3d 4s 4p

Quando a livello polmonare grazie all’elevata pO si inizia a legare la prima

2

molecola di O causa una transizione di spin, perché alla forza di repulsione

interelettronica che prima portava a un alto spin si contrappone la forza di

campo del legante. Si passa dunque da alto spin a basso spin, per cui il

diametro atomico del Fe si riduce e riesce a posizionarsi al centro dell’eme.

2+ ↑↓ ↑↓ ↑↓

Fe

Basso

spin 31

Il legame di coordinazione tra His F8 (istidina prossimale) e ione ferroso non

è perpendicolare al piano dell' anello tetrapirrolico, ma è inclinato di circa 8°.

Quando l' ossigeno instaura il sesto legame di coordinazione trascina lo

 ione Fe(II) nel piano della protoporfirina IX,causandone

causandone l' appiattimento.

La repulsione tra l' eme ed uno degli idrogeni dell' anello imidazolico

 dell' istidina F8 da una parte, e quella con il residuo di valina FG5

provoca uno spostamento di His F8 che rende perpendicolare al piano

dell' eme il quinto legame di coordinazione.

Il riallineamento di His F8 trascina con sè l' elica F e il gomito FG

 provocando la rottura dei ponti idrogeno e legami salini tra il C terminale

di una sottounità b e l' elica C della sottounità a appartenente all' altro

dimero.

In questo modo lo spazio tra elica F e G non è più sufficiente per

 ospitare un residuo di Tyr che si posizionerà all’esterno.

all’esterno

Questo accade quando la prima molecola di O si lega all’eme. Poiché i

 4 monomeri cooperano, si rompono anche i ponti salini degli altri

monomeri. 32

La progressiva perdita di ponti salini è accompagnata al processo di

 ossigenazione reso sempre più facile.

Alla fine otteniamo la proteina nella forma R dove non ci sono più ponti

 salini e ha acquisito la massima affinità all’O.

Quando a livello dei tessuti viene rilasciata la prima molecola di O, il Fe

torna ad alto spin, e si allontana dal centro dell’eme.

Il segmento F si ritira, si crea l’ansa, inizia la formazione dei ponti salini fino a

passare a bassa affinità per l’O.

In termini di cristallo è evidente l’allontanamento tra i due monomeri tra loro

di 7-8 A°, quando passa nella forma T.

Il cambio di conformazione oltre che la concentrazione dei reagenti permette

maggiore liberazione e acquisizione di O.

Modulazione del processo di ossigenazione e

deossigenazione

Un tessuto attivo metabolicamente consuma O e produce composti ultimi del

metabolismo. Se è un tessuto aerobio (cuore, cervello) un nutriente viene

bruciato con l’O , producendo H O e CO . Se un tessuto è occasionalmente

2 2 2

anaerobio (muscolare), produce anche acido lattico.

Un tessuto più lavora più produce composti acidi, CO , calore.

2

Nei tessuti dove l’Hb arriva si produce CO , abbassamento del pH,

2

innalzamento di temperatura.

Ci aspettiamo di vedere che questa situazione sposti l’equilibrio verso la

forma T. 33

PCO 2

Y 10mmHg

20mmHg

40mmHg

0,4

0,25 15 30 45 60 PO 2

L’Hb quando arriva nel capillare trova un pCO =20mmHg, Y=0,4, cioè il 60%

2

dei siti ha ceduto l’ O .

2

Nella curva con pCO =40 mmHg, Y=0,25, il 75% dei siti ha ceduto l’ O .

2 2

Se quindi la pCO =40 mmHg la curva si sposta a destra, mentre se la la

2

pCO =10mmHg si sposta a sx.

2

Maggiore è la produzione di CO maggiore è la tendenza a liberare O .

2 2

Con lo stesso schema sperimentale possiamo vedere l’influenza del pH.

Man mano che il pH diminuisce l a curva si sposta verso destra, facilitando il

rilascio di ossigeno, diminuisce il valore di Y.

L’effetto di CO e del pH va visto sempre in termini di equilibrio R—T.

2

La CO agisce in 2 modi:

2

1) La CO può reagire con gruppi amminici terminali non coinvolti nei ponti

salini: +

+

NH + CO N—COO- + H

3 2 I

H +

E’ una carbamminazione che provoca liberazione di H .

Quando la CO si lega all’Hb non si lega al gruppo eme ma ai gruppi

2

amminici terminali, formando una carboamminoHb.

Introduce così 2 cariche negative nell’Hb realizzando ulteriori ponti

salini.

Ogni volta che la CO si lega all’Hb sposta l’equilibrio verso la forma T,

2 +

introducendo nuovi ponti salini, inoltre si libera H e si abbassa quindi il

pH. → →

2) CO + H O H CO H CO

2 2 2 3 3- 34

H+

Questa reazione può avvenire nel plasma e negli eritrociti.

Per cui maggiore è la CO maggiore è l’acidità, maggiore

2

l’abbassamento di pH.

Questo abbassamento di pH è L’EFFETTO BOHR.

Questo effetto può essere sintetizzato con una reazione:

si forma emoglobina protonata e si libera ossigeno molecolare e a livello dei

tessuti si versano nel sangue i composti acidi prodotti, determinando un

ambiente più acido.

L’effetto dell’acidità è facilitare dissociazione di ossigeno, perché più basso è

il pH più alta è la probabilità che si formino ponti salini.

In questo diagramma

rappresenta la curva di

dissociazione dell’Hb e il

valore della pO a livello

2

dei polmoni, in dipendenza

dal pH. Da notare che c’è

sempre una saturazione

quasi totale.

Per formare un ponte salino occorre che le coppie ioniche siano

contrapposte, ravvicinate ad una distanza favorevole e con gruppi di cariche

opposte. Le cariche + o – sono in funzione del pH che regola il grado di

protonazione e deprotonazione. Va ricordato che l regole della dissociazione

valgono solo in ambiente acquoso, quindi in ambiente idrofobico possono o

no comportarsi in quel modo.

Nello strato Deossi l'istidina forma un ponte salino con Asp94 se l'anello

dell'Istidina è protonato. Questo stabilizza la forma protonata dell'Istidina

causando un pKa elevato nello stato deossi. Il ponte salino non si forma nello

stato ossiemoglobina. Quindi la protonazione della His146 favorisce la

conformazione deossi. 35

Se una molecola di Hb inizia la fase di deossigenazione questa va sempre a

termine, allo steso modo se c’è una molecola che non inizia il processo ,

ritorna ai polmoni in forma ossigenata.

Quando l’O viene rilasciato c’è una ricompattazione dei gruppi che si erano

rilasciati , ma per renderli attivi nei confronti dei ponti salini devono essere

protonati. La protoonazione è in funzione del pH, più basso è il pH a livello

tissutale, maggiore è la probabilità che vengano protonati.

La reazione avviene comunque ma quanto più basso è il pH, tanto è più

probabile il passaggio di molecole di molecole di Hb dalla forma R a quella T

(EFFETTO BOHR).

L’effetto Bohr costituisce un sistema isoprotico (i protoni non si muovono) di

neutralizzazione del pH.

Agisce come una sorta di sistema tampone, l’acidità prodotta a livello

tissutale viene neutralizzata quando l’Hb in fase di deossigenazione lega gli

+

H , importanti a livello polmonare in fase di ossigenazione.

LIVELLO TISSUTALE (40mmHg)

CO 2

Anidrasi

carbonica

CO H CO3 HCO3

2 2 Cl-

H+

O + HbH+ HbO

2 2

H+

O + HbCOO- HbO

2 2

CO 2

I tessuti a livello cellulare producono sempre CO assumendo sempre

2

ossigeno.

Tra la pCO mitocondriale e la pCO capillare c’è un ampio gradiente

2 2

pressorio per cui la CO presente può diffondere liberamente in distretti dove

2

c’è più bassa pressione parziale.

Quindi la CO prodotta nei tessuti tende a passare nell’eritrocita (il

 2

riquadro).

Nel plasma c’è una scarsa capacità di far reagire CO e H O per

 2 2

formare H CO3( ac. Carbonico).

2 36

Nell’eritrocita questa capacità è amplificata dall’enzima anidrasi

carbonica.

L’ acido carbonico è un acido debole e si dissocia in bicarbonato e

 H+.

Il protone rilasciato favorisce la protonazione dell’Hb e quindi

 l’acquisizione della forma T e il rilascio dell’O.

L’anidride carbonica attraverso la carbamilazione con l’Hb

 ossigenata forma carbo-amin-Hb, che è più suscettibile alla

formazione di ponti salini e libera O.

Il bicarbonato prima prodotto non serve all’eritrocita ma è molto

 utile nel plasma dove costituisce il principale sistema tampone.

All’equilibrio la concentrazione del bicarbonato nel plasma è pari a

25mM, la concentrazione dell’acido carbonico è 1,25 mM. Attraverso

questi dati è possibile ricavare il pH, con la formula di Henderson e

Hasselbalch. ⇒

pH = pK + lg [ SALE ] =6,1 + lg20 =6,1+1,3= 7,4

[ACIDO]

Il bicarbonato formato fuoriesce dall’eritrocita grazie allo scambio con lo

 ione Cl-. Uno scambio elettroneutro, realizzato da una particolare

proteina di membrana, chiamata canale per gli anioni.

LIVELLO POLMONARE (100 mmHg)

O 2

+

HbH + O HbO

2 2

+

H

H O

2 3-

CO H CO HCO

2 2 3 Cl -

-

CO + HbO O + HbCOO

2 2 2 Carbamilazione 37

✿ A livello polmonare l’ O entra nell’eritrocita a causa del gradiente di

pressione parziale.

✿ L’ Hb deossigenata e protonata inizia il processo di ossigenazione

con la reazione di deprotonazione (effetto Bohr).

✿ L’ O causa il cambiamento conformazionale , c’è variazione di pK, i

gruppi diventano più acidi, si ha rilascio di protoni.

✿ I protoni rilasciati inducono la reazione opposta a quella dei tessuti,

reagiscono col bicarbonato, formando l’acido carbonico.

✿ L’acido carbonico catalizzata dall’anidrasi carbonica viene scissa

in C O e H O. La CO viene poi eliminata dai polmoni.

2 2 2

✿ Va ricordato che la CO viene continuamente sottratta dalla ventilazione

2

polmonare, e gli H+ vengono continuamente immessi spostando

l’equilibrio della reazione da dx a sx.

✿ Gli H+ scomparsi a livello dei tessuti sono stati neutralizzati,

portati dall’Hb ed eliminati come anidride carbonica dalla

ventilazione polmonare.

✿ La carbossi-Hb reagendo con l’O libera anidride carbonica e l’Hb si

trova in forma ossidata. La CO che viaggia sottoforma di carbossi-Hb è

2

il 17-20% il resto viaggia come bicarbonato.

2-3 Bifosfoglicerato (2-3 BDG)

Prima quando si teneva in una sacca non deteriorata del sangue, questo si

mostrava come se l’Hb fosse poco suscettibile alla deossigenazione, non

completamente capace di rilasciare O. Dopo numerose ricerche si scoprì

l’esistenza di una molecola negli eritrociti. 38

E’ un derivato fosforilato dell’acido glicerico,

presenta in posizione 2 e 3 dell’acido glicemico

gruppi alcolici esterificati da gruppi fosfato.

Questo composto viene prodotto (negli eritrociti

nella glicolisi) da un precursore che è l’acido 1,3

difosfoglicerico.

La contrazione di questo composto all’equilibrio è di 5mM, a questa

concentrazione esercita un azione che favorisce il rilascio dell’O dall’ Hb.

Nelle sacche accadeva che veniva meno in una certa misura la capacità di

cedere l’O perché durante la lunga conservazione il glucosio (precursore) si

esauriva e quindi si esauriva anche il BFG.

pH 7,4

fisiologico

T° 37°

PCO 40 mmHg

2

BPG 5 mM

Va ricordato che quando variano le condizioni standard c’è uno spostamneto

della curva di dissociazione dell’Hb. 39

In assenza di BPG la curva si

sposta a sinistra e la proteina

continua ad avere alta affinità per

l’O. A valori elevati di BPG la

curva si sposta a sinistra,

favorendo la dissociazione.

Durante la reazione di deossigenazione, mentre si formano i ponti salini ,

l’effetto maggiore è l’allontanamento delle catene . Nella tasca che si

forma si inserisce la molecola di BPG. Il BPG è una molecola con 5 cariche

negative, il sito occupa è caratterizzato dalla presenza di cariche positive,

creando nuove coppie ioniche, stabilizzando ulteriormente la forma T.

Ricordando l’Hb fetale:

L' emoglobina fetale HbF è in grado di sottrarre O all'emoglobina

( )

 2

2 2

adulta (HbA). Ciò avviene perche l' emoglobina fetale non possedendo

catene dalle gamma) non lega il 2,3-BPG e quindi ha un'

(rimpiazzate

affinità per l' ossigeno superiore a quella dell' HbA.

Il fenomeno dell' adattamento alle alte quote ( ovvero a respirare un' aria a

più basso contenuto di O ) è legato in parte ad una aumentata sintesi di

2

emoglobina, nonchè all' aumento della concentrazione del 2,3-BPG. 40

ASPETTI ANOMALI DELL’ Hb E DELLA SUA

REAZIONE

Gli aspetti anomali dell’Hb si possono classificare in 4 livelli:

❦ Anomalie da liganti: il ligante principale è l’O ma ce ne possono essere

diversi come il monossido di carbonio.

❦ Anomalie derivanti da configurazione quaternaria: dovute ad un diverso

assemblaggio dell’emoglobina, pur rimanendo sempre un tetramero.

❦ Anomalie riguardanti al struttura primaria: dovute a mutazioni puntiformi

dei geni che codificano per le catene alfa e beta.

❦ Anomalie riguardanti lo stato di ossidazione del ferro.

Anomalie da liganti

Monossido di carbonio (CO):

E’ un gas presente nell’atmosfera a bassa pressione, tranne in rare

condizioni in cui il CO prodotto dalle combustioni si trova a pressioni più alte.

E’ un gas tossico, la tossicità è rappresentata quando si lega al gruppo eme

delle emoproteine. Si lega al gruppo eme quando il Fe si trova in forma

ridotta (ione ferroso), come fa l’O.

Questo crea competizione tra i due gas. L’esito della competizione

dipende da due fattori: la diversa affinità e la pressione parziale. L’affinità

del CO nei confronti del gruppo eme se èm fuori della proteina è 25.000 volte

superiore a quella dell’O. Mentre nella proteina è di 200 volte superiore a

quella dell’O. Questo crollo di affinità del CO è causato dall’ His distale E7.

Questo residuo occupa uno spazio nella zona dell’eme ed obbliga ad una

distorsione il legame ione ferroso- CO. In condizioni normali di pressione

parziale la competizione è vinta dall’O.

Non solo l’Hb è suscettibile al legame col CO ma anche altre emoproteine

come la citocromo ossidasi. 41

Anomalie derivanti da configurazioni quaternarie.

Esistono difetti genetici che portano alterazioni a carico dell’Hb, dove alcune

catene non sono prodotte o non i quantità sufficiente.

La condizione patologica che ne deriva è la talassemia, una malattia con

talassemia

elevata incidenza.

Per la mancata o scarsa produzione di catene parliamo di talassemie , le

 

talassemie rappresentano mancata o scarsa produzione di catene .

 

Considerando che l’Hb si forma comunque in forma tetramerica, nelle

talassemie l’assemblaggio sarà errato.

a

Per quanto riguarda le catene ci sono 4 geni codificanti, 2 per ciascuno dei

cromosomi 16. Questi geni possono essere tutti funzionanti, nel fenotipo

normale; oppure a seconda del numero di geni funzionanti avremo una più o

meno grave gravità.

Le catene hanno un numero inferiore di geni, soltanto 2, uno per ogni

b geni

cromosoma 11. 42

SITUAZIONE NORMALE = /



  



-TALASSEMIE

  

Nessun gene si esprime, non c’è nessuna

₂ ₂

 

(Portland) produzione di catene Questa è un’Hb

.

isolata nel feto con catene di tipo

₂ ₂

da tetrameri . La

composta  

malattia associata è l’IDROPE FETALE,

non compatibile con la vita.

_ _/_ _ ₄

 La Bart’s è un Hb anomala la malattia

(Bart’s) associata è l’IDROPE FETALE.

Si esprime solo uno dei 4 geni , esiste la

 possibilità di produrre Hb normale, ma

(Hb H) esistono parecchie molecole anomale.

_ _/ _

 ₄

 Porta ANEMIE dove l’Hb istabile

(Bart’s) precipita, EMOLISI, MICROCITOSI,

30% CORPI DI INCLUSIONE.

INCLUSIONE

2 su 4 geni vengono espressi. La

_/ _(trans)

  diagnosi si fa mediante prelievo del

cordone ombelicale. Si trova al 5% circa

 e si dice che c’è TRAIT TALASSEMICO,

_ _/ (cis)

  cioè tendenza alla possibilità di

trasmettere questo carattere. E’

abbastanza compatibile con la vita

Situazione del tutto ASINTOMATICA,

ASINTOMATICA

_/

   dove solo uno dei geni non funziona. Si

trova la in quantità limitata.



-TALASSEMIE

  

_/_ MORBO DI COOLEY da cui risulta un

⁰ ₂ ₂ (Hb

    anemia grave. I pazienti sono

F) 20-80% caratterizzati da un elevata Hb fetale. La

quantità può variare a seconda della

gravità dal 20 all’80%.

TALASSEMIA MINOR, anemia lieve.

MINOR

_/  Diagnosticata con il dosaggio dell’Hb ,

Aumento presente in ognuno in quantità variabile

di Hb A dall’1 al 2%.

₂ ₂

( )

Anomalie della struttura primaria, mutazioni puntiformi.

43

Fino ad ora sono state individuate circa 200 emoglobine con anomalie della

struttura primaria. Una mutazione a livello primario può causare vari processi.

L’EMOGLOBINA KANSAS caratterizzata da una mutazione nella catena in

posizione 102 aspargina- treonina. Questa proteina ha conservato l’effetto

cooperativo, ma alle concentrazioni a cui dovrebbe saturare il 100%, satura il

35-40%; allo stesso modo rilascia ai tessuti una quantità nettamente inferiore

di O. Già quando la saturazione scende al 60% si ha difficoltà serie

nell’ossigenazione dei tessuti. L’Hb Kansas è difficilmente compatibile con la

vita.

L’EMOGLOBINA R RANIER caratterizzata da una mutazione tirosina-cisteina

su 145. Questa è un’ Hb molto più affine all’ O, quasi come la mioglobina,

tanto che a livello dei capillari non cede O. A 30-40 mmHg quest’emoglobina

è completamente satura.

SATURAZIONE

(%) Hb Ranieri

Hb A

Hb Kansas ₂

pO (mmHg)

ANEMIA FALCIFORME (Hb S) fu studiata a partire dalle osservazioni di un

metodico medico di Chicago, James Herrick, che nel sangue di uno studente

vide la presenza di cell. rosse anomale a forma di falcetto. Questo stato è

quello di un anemia grave perché questi eritrociti si rompono e danno una

anemia intravasale.

Bisogna verificare se l’Hb si comporta normalmente, un metodo per verificarlo

è l’elettroforesi, che permette di svelare anomalie catena.

Per eseguire l’elettroforesi:

1. Prendiamo l’Hb normale e allontaniamo i globuli dal plasma con

centrifugazione.

2. Sottoponiamo i globuli a lisi in una soluzione ipotonica.

3. Si effettua una ulteriore centrifugazione , l’ Hb che è rimasta in

soluzione è pronta per essere analizzata.

Sottoponiamo ad elettroforesi l’Hb:

Di un individuo sano

 44

Di un eterozigote che ha sia l’Hb S si la A

 Di un omozigote per il gene mutato.

L’Hb dell’individuo sano migra tutta da una parte e si ferma in un certo punto.

L’Hb dell’eterozigote si ripartisce in due sezioni, una che ha le caratteristiche

elettroforetiche dell’Hb sana, un di quella patologica.

L’Hb dell’omozigote migra da una parte con motilità elettroforetica maggiore.

A A A S S S +

Hb A

Hb S -

origine

L’ Hb è più veloce a spostarsi al polo negativo quando ha una carica positiva

in più o una negativa in meno.

Per capire cosa non funziona all’Hb anomala per cui si comporta così

effettuiamo il FINGEPRINTING dell’Hb.

Ogni proteina trattata a determinate condizioni presenta le sue peculiarità.

1. Si prende l’ Hb di un individuo sano e la si sottopone a digestione

triplica con un enzima proteolitico, l’enzima tripsina . Questo enzima

favorisce la scissione di legami peptidici che collegano un residuo

all’altro nelle varie proteine, specie quelli in cui c’è arginina o lisina. Se

ad es. abbiamo una proteina con 15 legami peptidici con arginina o

lisina, la proteina sarà tagliata in 15 punti, formando 16 frammenti.

2. Prendiamo una goccia di questo miscuglio di frammenti e lo

sottoponiamo ad elettroforesi , ogni frammento essendo diverso

dall’altro avrà propria motilità elettroforetica.

3. I frammenti sono numerosi e si addossano, non permettendo una

buona risoluzione.

4. Si aggiunge quindi una seconda divisione ortogonale, e si sottopone lo

stesso foglio a cromatografia. Questa tecnica separativa si basa sul

coefficiente di ripartizione.

5. Otteniamo così un’ottima risoluzione dei peptidi. 45

CROMATOGRAFIA

ELETTROFORESI in direzione orizzontale in direzione verticale

⑦ ③

MISCELA DI ⑤

PEPTIDI ⑥

+ - ② ① ④

①②③④⑤⑥⑦⑧⑨

Paragonate le Hb di un individuo sano saranno perfettamente sovrapponibili.

Se il paziente è affetto da anemia falciforme troviamo una mappa in cui tutti i

frammenti si sovrappongono tranne uno. Questo ci indica che questo

frammento avrà una struttura primaria diversa dall’Hb nativa.

6. Recuperiamo il frammento anomalo, con le normali metodologie per la

sequenza primaria.

7. Confrontiamo la sequenza primaria del peptide anomalo con quella del

peptide dell’individuo sano.

8. Il frammento contiene una catena formata da 8 amminoacidi. La

mutazione è a carico delle catene beta dove in posizione 6 l’acido

glutammico è sostituito da una valina.

Quindi l’anemia falciforme è causata dalla variazione di un singolo residuo,

avendo il glutammato carica negativa, l’Hb S ha una carica negativa in meno

e migrerà più velocemente verso il polo negativo. E’ possibile analizzando le

triplette codificanti comprendere come è avvenuta la mutazione.

CODONI

VALINA ACIDO La mutazione è avvenuta a carico della

GLUTAMMICO seconda base. Dove un uracile viene

sostituito da un adenina.

GUU /

GUC /

GUA GAA

GUG GAG

La valina fa parte dei ramificati, presenta una catena alifatica apolare ,

mentre il glutammato è un residuo polare. Questa sostituzione comporta

l’assunzione di carattere apolare, idrofobico al posto di uno idrofilo e polare.

46

L’assunzione di un carattere idrofobico comporta l’effetto idrofobico, la forza

che tende a far convergere tra loro i gruppi idrofobici. Parte una reazione

comandata dall’effetto idrofobico che scatena la polimerizzazione delle

catene emoglobiniche. I vari tetrameri si uniscono con quelle unità chiamate

appiccicose. L’Hb non è più una proteina

solubile ma diventa fibrosa, le

lunghe catene fibrose

impongono all’eritrocita la

conformazione a falcetto. Sono

le forme T che scoprono queste

unità appiccicose.

L’Hb S arriva ai tessuti

ossigenata, libera ossigeno,

assume la forma T, si realizza

la polimerizzazione. I globuli

rossi perdono le loro

caratteristiche principali, la

deformabilità, la capacità di

passare anche nei capillari

molto piccoli, causando così

ostruzione dei capillari ed

emolisi.

Anomalie dello stato di ossidazione del Ferro.

Esiste una famiglia di Hb dette M, che hanno una maggiore tendenza a

transitare il ferro da ferroso a ferrico.

Eseguendo il dosaggio della metemoglobina vediamo che è presente in

ognuno in una quantità che non supera il 2%.

Ciò significa che si forma ma viene continuamente ricondotta a emoglobina

funzionante. Si riforma spontaneamente perché la reazione di ossigenazione

non è perfetta al 100% e su 100 molecole che si ossigenano una subisce

anche ossidazione, il ferro diviene ferrico e l’O superossido.

I mezzi che riconducono la metaemoglobina ad emoglobina funzionante

usano substrati ed enzimi.

Nell’eritrocita è presente un tripeptide: il GLUTATIONE, GSH, composto da

Gly-Cys-Glu, glicina,cisteina, glutammato.

L’eritrocita lavora per mantenere i livelli di glutatione alti, infatti il glutatione è

un forte riducente. Due unità di glutatione ridotto diventano un unità di

47

glutatione ossidato, liberando anche due riducenti e due elettroni. Questi

equivalenti di riduzione hanno molteplici funzioni, come antiossidanti con i

radicali liberi dell’O, e fa transitare la metaemoglobina in emoglobina

funzionante.

Gly-Cis-Glu =GSH glutatione ridotto

2 GSH GS-SG (glutatione ossidato)

2H

MHb Hb

Esiste anche un altro sistema enzimatico che assolve la stessa funzione, la

metaglobina reduttasi NADH dipendente. L’NADH è un forte riducente che

viene utilizzato in questi casi.

Il glutatione e la metaglobina reduttasi NADH dipendente assicurano che la

metaglobina mantenga valori bassi. Se aumenta può pregiudicare lo stato di

ossigenazione tissutale, infatti la metaglobina non lega l’O ma l’OH per

neutralizzare la carica positiva del Fe.

Inalazione o digestione di forti ossidanti ( nitrati, candeggina) porta ad un

aumento della metaglobina.

Esistono forme di emoglobina geneticamente determinate a dare produzione

di metaglobina.

Le mutazioni che portano a queste situazioni sono sempre sostituzioni di

residui apolari con residui polari, questa situazione favorisce l’ingresso di

acqua e quindi di ossigeno, rendendo più facile l’ossidazione.

Hb M

idrofobo polare

Hb M - Bristol Val Asp 67

Hb M - Hammersmith Phe Ser 42

Hb M - Koln Val Met 98

Hb M - Milwaukee Val Glu 67

Hb M - Norfolk Gly Asp 57

 48

Inoltre danno ugualmente Hb M mutazioni a carico dell’ His distale E7.

Hb M – Boston His E7 Tyr 

Hb M - Sasksatoon His E7 Tyr 

Hb M - Zurich His E7 Arg Mutazione non produttiva, il

 grado di protezione dell’ His è

uguale a quello dell’ Arg

Le proteine del sangue.

Nel sangue ci sono numerose proteine che prendono il nome di proteine

plasmatiche.

Il plasma è la parte non corpuscolata del sangue. Si ottiene facendo

t centrifugare un campione di sangue intero con un anticoagulante. Nella

provetta la parte corpuscolata si disporrà sul fondo, il plasma il

superficie.

La parte corpuscolata è l’ematocrito , che in condizioni normali non

t supera il 45% del sangue intero.

I soluti sono rappresentati da una serie di sali, composti inorganici,

t metaboliti (ad es. ac.lattico), proteine.

proteine

H O

₂ COMPOSTI 10%

INORGANICI

METABOLITI 20%

ORGANICI E

ALTRI

SOLUTI PRODOTTI 70%

PROTEINE

EMAZIE PLASMATICHE

LEUCOCITI

PIASTRINE 49

Se si lascia coagulare il sangue e si centrifuga si ottiene il siero.

t La differenza tra plasma e siero è che il plasma non contiene

fibrinogeno (sostanza usata durante la coagulazione).

La misura delle proteine del sangue avviene nel siero.

t La misura delle proteine nel siero è ormai un esame rutinario ma che dà

importanti indicazioni. E’ possibile verificare sia la % totale delle

proteine plasmatiche, sia il rapporto % delle varie classi.

Le proteine plasmatiche sono 6,5-7,5 g/100ml di sangue.

t La maggior parte di queste proteine è di sintesi epatica , fra le quali la

t maggior componente è l’albumina, un decremento delle proteine

plastiche può indicare la mancata o incompleta sintesi da parte del

fegato o la perdita a livello renale.

Ci sono diversi metodi per misurare la quantità di proteine: si tratta una

t certa quantità di siero o plasma con dei reattivi, il più usato è il biureto

(una soluzione alcalina di Cu) che sviluppa con le proteine un’ intensità

di colorazione proporzionale alla concentrazione.

Composizione delle proteine

La classificazione delle proteine più usata è quella elettroforetica.

Un sistema elettroforetico è composto da un foglio di carta o di acetato di

cellulosa (un materiale che non deve reagire chimicamente con la proteina), e

da un circuito ai cui terminali applichiamo differenza di potenziale, ottenendo

un lato positivo e uno negativo.

Le proteine vengono stratificate sul foglio a pH relativamente alcalino 8.5-8.6.

Questo perché questo valore è superiore al punto isoelettrico di tutte le

proteine del plasma, che di conseguenza a un pH così alto saranno cariche

negativamente e tenderanno a migrare a circuito chiuso verso il polo positivo.

La velocità di migrazione è da attribuire al numero di cariche nette negative

presenti su una proteina ad un determinato valore di pH.

In questo modo le proteine si raggruppano in strisce.

strisce

Le proteine plasmatiche non sono colorate, ma le bande possono essere

evidenziate con opportune colorazioni: l’elettroferogramma.

La prima banda che appare è quella delle proteine più veloci, le albumine , le

altre bande vengono chiamate e hanno velocità di migrazione



 







gradatamente decrescente. 50

L’interpretazione quantitativa di un elettroferogramma, si effettua attraverso

analisi densitometrica.

ALBUMINA  ₂

GLOBULINE 



La striscia viene fatta attraversare da un raggio laser, in questo modo si

laser

apprezza la densità di ciascuna banda attraverso i tracciati densiometrici.

densiometrici

Otteniamo una serie di picchi corrispondenti alle singole bande.

I picchi possono essere di diverso tipo: alti e stretti che significano che le

proteine migrate sono uguali tra loro; bassi e larghi significa che le proteine

migrate sono eterogenee.

Il risultato che otteniamo è il tracciato elettroforetico. E’ possibile anche

misurare l’area sottostante alla curva, e da essa ricavare l’area di ciascun

picco. Alb 

% 59 4 9 12 16

I valori medi delle proteine plasmatiche:

Albumina 60%

Globuline 40%

4%

 8%

 12%

 15-18%

 51

Importante è il rapporto tra albumina e globuline :

A/G=1.5

Bisogna comunque guardare con attenzione ogni picco, che può essere

indicativo di modifiche che non alterano le percentuali.

ALBUMINA

Rappresenta il 60% delle proteine plasmatiche, presente circa 4g/100ml di

sangue. E’ indice di buona nutrizione , la caduta del valore di albumina

corrisponde a scarsa nutrizione, associata a particolari sintomi (ad es. edema

agli arti).

Assolve due funzioni:

TRASPORTO

† L’albumina trasporta un’ampia gamma di molecole endogene ed

esogene.

Molecole endogene come gli acidi grassi che sono molecole

idrocarburiche, alifatiche, idrofobiche. Gli acidi grassi si muovono dal

tessuto adiposo al cuore, ai muscoli scheletrici, al fegato, attraverso un

ambiente acquoso. Non possono però circolare in soluzione essendo

insolubili e per questo si fanno trasportare dall’albumina. L’albumina

può portare 18 molecole di acidi grassi a pH fisiologico (7.4).

L’albumina non trasporta solo acidi grassi, ma anche la bilirubina, un

prodotto di derivazione dell’emgloobina, sintetizzato a livello della milza,

del midollo, del fegato. La bilirubina è assolutamente insolubile e ha la

tendenza ad attraversa le membrane, e se ciò avviene a livello

encefalico può causare gravi danni.

Tra le molecole endogene trasportate dall’albumina ci sono

ormoni, vitamine e molecole che occasionalmente si trovano in

circolo perché tossiche o farmacologiche. Infatti quando si

somministra un farmaco bisogna considerare la costante di

dissociazione tra l’albumina e il farmaco (biodisponibiltà del farmaco).

Nel sangue ci sono tre frazioni alluminiche:

pre-albumina,

o post-albumina,

o albumina.

o

L’albumina è formata da una singola catena, è una proteina globulare,

ha punto isoelettrico 4.7, ha forma ellissoidale. Questa forma dà

all’albumina bassa viscosità, meno resistenza al pompaggio sanguigno.

REGOLAZIONE DELLA PRESSIONE OSMOTICA.

† Se misuriamo le proteine plasmatiche in un soggetto con edema agli

arti inferiori, troveremo che sono più o meno costanti ma la quantità di

albumina è sicuramente più bassa. Basta una diminuzione del 10% (da

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PAGINE

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1.26 MB

AUTORE

Sara F

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+1 anno fa


DETTAGLI
Esame: Biochimica I
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in Biotecnologie mediche e farmaceutiche
SSD:
Università: Firenze - Unifi
A.A.: 2013-2014

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Sara F di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biochimica I e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Firenze - Unifi o del prof Camici Guido.

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