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Biochimica I – Proteine Appunti scolastici Premium

Appunti di Biochimica I sulle Proteine. Nello specifico gli argomenti trattati sono i seguenti: Mantenimento della morfologia delle varie strutture, proteine di trasporto(emoglobina), Enzimi, Trasformazione da una forma di energia ad un’altra, Amminoacidi essenziali, ecc.

Esame di Biochimica I docente Prof. G. Camici

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ESTRATTO DOCUMENTO

Per dare stabilità alla struttura intervene la formazione di legami covalenti

detti traversi, o crociati. Perchè ciò avvenga è necessaria una reazione a

carico dei residui di lisina che interessa il Ce della lisina.

Questa reazione è catalizzata da un enzima, lisil-ossidasi , presente nella

regione extracellulare e prevede liberazione del gruppo amminco sottoforma

di ammoniaca (NH ) e di O molecolare (O ).Porta alla formazione di

3 2

ALLISINA un composto in cui il C della lisina diventa aldeidico.

O NH H

3

II I I

C—C—CH —CH —CH —CH —NH --CH —CH —CH —C=O

2 2 2 2 2 2 2 2

a b g d e

I

NH O

2

Lisil-ossidasi

LISINA ALLISINA

Questo composto ora può dare origine a una serie di reazioni. Ne esistono di

due tipi:

1. Una lisina o un idrossilina viene ossidata da lisinaossidasi diventando

allisina; reagisce poi per sottrazione di una molecola d’acqua con

un’altra lisina a formare una base di Schift che viene in seguito ridotta.

2. Reagiscono tra loro due allisine una in forma enolica e l’altra aldonica

per condensazione aldolica e sottrazione di una molecola d’acqua.

H H

I I

--CH —CH —CH —C=O + --CH —CH —CH —C=O

2 2 2 2 2 2

Allisina Allisina H O

2

H

I +

--CH —CH —CH —C=O=====C —CH —CH —

2 2 2 2 2

I +

C

/ \\

H O 12

3. Condensazione aldolica di due allisine con sottrazione di una molecola

di H O.

2

La formazione di legami crociati continua per tutta la vita rendendo il

collagene sempre meno elastico e più fragile.

PATOBIOCHIMICA DEL COLLAGENO

CARENZA PATOLOGIA LOCALIZZAZIONE EREDITARIETA’

Osteogenesi Intracellulare Ereditaria

Sintesi di pro- imperfetta,

(I)

  causa

deformazioni

scheletriche gravi

Ehlers-Danlos Intracellulare Ereditaria

Sintesi di pro- IV

(III)

 Ehlers-Danlos Intracellulare Ereditaria

Lisil-idrossilasi VI

Carenza di Intracellulare Acquisita

Prolil-idrossilasi vitamina C

Ehlers-Danlos Extracellulare Ereditaria

Procollagene- VII, dove il

peptidasi collageno è

abbastanza

solubile

Latirismo prende Extracellulare Ereditaria ma

Lisil-ossidasi il nome da un anche acquisita

legume,potente

inibitore della lisil-

ossidasi

Latirismo dovuto Extracellulare Acquisita

Lisil-ossidasi a carenza di Cu,

perché è un

enzima con

metabolismo

contenente rame.

Omocistinuria, Extracellulare Ereditaria

Legami trasversi malattia degli

amminoacidi

Penicillamina, Extracellulare

Legami trasversi Acquisita

un farmaco,

chelante che

contiene

omocisteina, un

composto che

coordina il Cu e 13

inibisce la lisil-

ossidasi

Elastina

Si trova nei tessuti in cui sono richieste fibre elastiche da associare al

collagene, legamenti, vasi sanguigni…

L’elastina è ricca di glicina, alanina e valina, è flessibile e facilmente

estensibile. La sua conformazione è random, con basso grado di struttura

secondaria. Sono presenti molti legami trasversi tra le catene laterali di lisina,

dello stesso tipo chimico di quelli nel collageno ma organizzati in modo

diverso. Tre residui aldeidici dell’allisina reagiscono con il gruppo amminico

della lisina a formare un residuo detto desmosina. Poiché si associano 4

catene distinte bastano un piccolo numero di legami crociati a rendere

l’elastina una rete gommosa interconnessa.

STRUTTURA TERZIARIA

PROTEINE GLOBULARI

L’aspetto delle proteine con struttura terziaria è di tipo globulare. Queste

proteine sono dette così perché le loro catene polipeptidiche sono ripiegate in

strutture compatte.

La catena polipeptidica è spesso avvolta in uno dei tipi di struttura secondaria

( elica, foglietto ), per rendere però queste strutture compatte le regioni

 

devono essere ripiegate l’una sull’altra. Questo ripiegamento è la struttura

terziaria della proteina, che conferisce alla molecola la forma tridimensionale.

ESPERIMENTO di C. A nfinsen:

prendiamo un enzima pancreatico la ribonucleasi, che ha un effetto idrolitico

sugli acidi nucleici.

Questo enzima è costituito da circa 100 residui, tra cui troviamo 8 cisteine ,

che man mano che la proteina organizza la struttura globulare, formano 4

residui di cistina.

H N H N

3 3

I I

H—C—CH —SH + SH—CH —C—H

2 2

I I

- -

COO COO

Cisteina Cisteina

H N H N

3 3

I I + -

H—C—CH —S—-------S—CH —C—H +2H +2e

2 2

I ponte I 14

- -

COO disolfuro COO

CISTINA

Il gruppo sulfidrilico (SH) delle due cisteine si ossidano e si forma il ponte

disolfuro con sottrazione di elettroni, dando origine alla cistina.

b

Facciamo fondere la nostra proteina in presenza di mercapto etanolo.

Questo composto è un derivato dell’alcool etilico (CH —CH —OH), ha

3 2

proprietà riducenti perché presenta legato al C un gruppo SH.



b

CH—CH OH mercapto etanolo

2

I

SH a) Se aggiungiamo alla ribonucleasi che sta denaturando il mercapto

etanolo, i residui di cistina saranno ridotti e quindi avremo una proteina

denaturata e ridotta che non ha più funzione biologica.

b) Facciamo raffreddare (riscaldata per farla denaturare) questa soluzione

in un tubo da dialisi che permette il passaggio solo a piccole molecole.

Quindi il mercapto etanolo esce, mentre la proteina raffredandosi

riforma i ponti disolfuro.

c) Facendo il dosaggio dell’attività dell’enzima troveremo che ha

riacquisito il 100% della sua attività.

Ciò significa che tra tutte le possibili strutture si è riformata nello stesso

modo, probabilisticamente ciò è impossibile. Questo ci fa capire che la

proteina ha intrinsecamente le informazioni per assumere la

conformazione nativa, nella sequenza primaria.

Oltre ai residui più o meno compatibili con le strutture particolarmente

importante per influenzare la formazione è L’EFFETTO IDROFOBICO.

La proteina presenta residui sia idrofilici che idrofobici, che danno alla

proteina una determinata conformazione a seconda dell’ambiente in cui si

trova. In ambiente acquoso le catene R idrofiliche staranno all’esterno,le

idrofobiche all’interno. Mentre le catene apolari rifuggono l’ambiente acquoso

e per questo tendono ad addossarsi tra loro dando origine al cosiddetto

legame idrofobico (in realtà non c’è il legame ma solo la tendenza a

addossarsi per rifuggire l’ambiente).

La struttura terziaria è ulteriormente stabilizzata da:

Effetto idrofobico è realizzato dove ci sono 2 residui di fenilalanina,

G assolutamente idrofobici, o quando ci sono gruppi metilici.

Legami idrogeno ad esempio tra una fenilalanina e un gruppo acido.

G Attrazione ionica legami tra cariche opposte dei residui che vengono a

G confrontarsi a distanza compatibile 15

Legami covalenti nelle proteine semplici, perché nelle proteine

G coniugate intervengono ulteriori legami tra la proteina e l’entità non

proteica.

Metodologie per la ricostruzione delle mappe delle proteine.

 RISONANZA MAGNETICA NUCLEARE si basa sull’iterazione tra

campo magnetico esterno e qualità magnetiche dei nuclei. Il protone è il

nucleo più seguito. Quando si espone una proteina ad un campo

magnetico esterno i nuclei si orientano e visto che il comportamento dei

protoni dipende dal gruppo a cui il protone appartiene, si ottine una

mappatura degli atomi di H.

 CRISTALLOGRAFIA A RAGGI X per questa metodica è necessario

fare il cristallo della proteina.

Per fare il cristallo si prende una proteina solubile e la si fa precipitare

aggiungendo un sale: il solfato di ammonio. Questo processo è detto di

salting-out. Successivamente alla salificazione la proteina precipita

perché il sale ha tolto alla proteina l’H O di idratazione, che la

2

manteneva in funzione.

In laboratorio si lasciano in frigorifero la proteina e il sale per 24/48 ore,

ottenendo il cristallo.

I cristalli sono investiti da raggi X che hanno lunghezze d’onda dello

stesso ordine delle distanze atomiche e interagiscono con gli elettroni

dando mappature, che vengono rielaborate da comlessi processi

matematici dando una distribuzione atomica.

Patologie connesse ad una non corretta struttura terziaria

delle proteine.

Malattia di Alzheimer una sindrome neurologica caratterizzate da vari

fenomeni fra cui la produzione abbondante di proteina amiloide. Questa

proteina è processata da un precursore in quantità normale. In questa

patologia la proteina amiloide è prodotta in eccesso e probabilmente a causa

di mutazioni con struttura terziaria alterata. Questo fa sì che la proteina

precipiti, e questo induce la cellula a non riconoscerla inducendone un

ulteriore produzione. Si formano anche le tipiche placche amiloidi.

Malattia di Kreuzfeld-Jacob (BSE, SCRAPI) dovuta al non corretto

raggiungimento della struttura terziaria dei prioni. Questi precipitano e viene

indotta ulteriore produzione che precipiterà ugualmente. E’ infettiva perché i

prioni al contrario delle altre proteine sono resistenti alle proteasi intestinali

per questo non vengono degradati. Vengono perciò assorbite dal sistema

16

linfatico, vanno in circolo e risalgono attraverso i vasi linfatici al SNC. Questi

prioni errati formano dei dimeri coi prioni sani causando una malformazione

confomazionale che si autoalimenta.

STRUTTURA QUATERNARIA

EMOGLOBINA

Questa proteina può essere studiata come modello delle strutture

quaternarie. Se ne conoscono circa 200 varianti. Per meglio comprendere

questa proteina è necessario studiare una proteina molto simile la

mioglobina.

Sono simili perché:

l’omologia di sequenza (stesso residuo nella stessa posizione) è pari al

 50%;

il singolo monomero della mioglobina è molto simile a quelli che

 costituiscono l’emoglobina;

entrambe presentano il gruppo eme, sono emoproteine (non sono le

 uniche);

entrambe hanno andamento secondario ad elica, tranne nei gomiti

 dove viene perduta la struttura secondaria per consentire il formarsi

della struttura globulare. Circa il 70% ha struttura ad elica e il 30% a



tratti random. Ci sono 8 segmenti ad elica (denominati con le lettere



maiuscole dell’alfabeto), articolati in 7 gomiti (denominati con le lettere

minuscole dell’alfabeto).

Le differenze sono:

l’emoglobina ha raggiunto un livello strutturale quaternario mentre

 la mioglobina solo terziario, pur avendo analoga struttura terziaria. 17

L’emoglobina è un tetramero formato da 4 monomeri denominati

questi sono a due a due uguali. Gli sono costituiti da 141

 

residui, i da 146.

La mioglobina ha 153 residui, dove per convenzione il residuo 1 è l’ N-

terminale e il 153 il C-terminale.

Esiste una via biosintetica che conduce al gruppo eme, la via biosintetica

delle porfirine. Partendo dalla porfirina IX, caratterizzata, come tutte le

porfirine da una struttura di base composta da un anello tetrapirrolico ciclico.

Ogni pirrolo presenta un N e 4 C, sono collegati dai CH.

Dalla porfirina IX si passa alla protoporfirina IX. +

Protoporfirina + Fe2+ -------------> Eme + 2 H 18

Nella protoporfirina XI sono presenti 3 tipi di catene laterali:

1. un gruppo metilico CH (metile);

3

2. un gruppo a 2 atomi di carbonio, CH=CH (vinile);

2 -

3. un gruppo a tre atomi di carbonio, CH —CH —COO (residuo di acido

2 2

propionico, un proprionile).

Nell’anello 1 abbiamo una catena corta CH (metile) e una lunga

 3

CH=CH (vinile);

2

Nell’anello 2 uguale all’ 1;

 Nell’ anello 3 abbiamo catena corta CH (metile) e la catena lunga è

 3 -

sostituito da un proponile CH —CH —COO ;

2 2 -

Nell’ anello 4 troviamo rima la catena corta CH —CH —COO

 2 2

(rappresentata dal proponile) e una corta CH (metile). Esiste una serie

3

di porfirine in cui non è avvenuta l’ inversione, sono patologiche dette

porfirine della serie 1, le altre in cui è avvenute l’inversione sono della

serie 3.

La protoporfirina IX diventa Fe- protoporfirina IX (gruppo EME), solo

quando si lega ad uno ione di Fe. 19

2+

☻ Il Fe si presenta in forma di ossidazione ferrosa, Fe , legato al centro

del gruppo eme tramite legami dativi tra Fe (elemento che dispone di

doppietti elettronici) e N (elemento che presenta orbitali vuoti).

☻ Al mantenimento in sede del Fe contribuiscono legami ionici, infatti

guardando la struttura della protoporfirina IX ci dovrebbero essere 2 NH

-

per rendere l’N trivalente , nell’ emoglobina questi NH sono N . Le

2+

cariche negative controbilanciano i 2 protoni del Fe .

☻ Ma il ferro non è legato solo dai legami di coordinazione con l’N detti

planari, ma realizza legami ortogonali alla struttura dell’eme (legami

legami

assiali). I legami assiali si realizzano con il residuo di istidina in

F8. L’istidina è un amminoacido basico che presenta nel residuo R un

anello imidazolico, che al suo interno contienine un N con un doppietto

libero che permette il legame.

☻ Quando la proteina si presenta in forma ossigenata, questo costituisce

il sesto legame di coordinazione, dalla parte opposta del legame con

l’His F8.

Quindi l’emoglobina in forma esagerata presenta il Fe in forma di esa-

coordinazione (4 legami con l’N planari, 2 assiali). 20

Se prendessimo il gruppo eme e lo tirassimo fuori dalla proteina il Fe passa

3+

in forma ossidata, diventa ione ferrico (Fe )

, perdendo un elettrone.

2+ 3+ 2-

Fe + O Fe + O

2

Questo porta a due situazioni estremamente deleterie:

1) Il Fe è capace di legare l’O solo se è in forma ferrosa, in forma ferrica

non è più funzionale. All’interno del gruppo eme si crea un eccesso di

carica positiva che lega con molta più affinità uno ione carico

-

negativamente, OH . Ciò porta ad una forma ossidata di mioglobina o di

emoglobina detta metaemoglobina (non funzionante).

2-

2) Si crea una particolare forma di O, la O , ione superossido, che rientra

nelle specie reattive dell’O (ROS), i radicali liberi (che vengono sempre

prodotti ma con minor probabilità).

P erché quando si lega l’O nella proteina nativa, dando ossigenazione, non

2

c’è sottrazione di elettroni cioè ossidazione (che rende non funzionante la

proteina), come accade nel gruppo eme enucleato?

L’O viaggia sempre disciolto nell’acqua, secondo diverse

concentrazioni( pressione parziale). Per legarsi deve attraversare la parte

interna della proteina che è quasi completamente idrofobia, quindi arriva poca

acqua e poco O. L’O che arriva è in quantità tale da produrre ossigenazione

ma non ossidazione. L’acqua riesce a entrare in piccola quantità grazie a una

breccia nel fronte apolare causata da due residui.

Un residuo è F8-His-93 che è lo stesso residuo che forma il primo legame

assiale con il Fe, l’altro residuo è E7-His-64 che non crea un legame assiale

con il Fe ma un legame H quando l’O si è già legato al Fe. 21

FUNZIONE DI MIOGLOBINA ED EMOGLOBINA

Nel mitocondrio si svolgono le ossidazioni biologiche, reazioni dove l’O

molecolare reagisce con una serie di substrati ridotti SH 2

½ O + SH S + H O

2 2 2

S si ossida e l’ossigeno si riduce, dando origine ad acqua, l’O è usato come

carburante e SH come combustibile, avviene combustione e si sviluppa

2

energia.

L’O per arrivare al mitocondrio compie un viaggio.

Parte dall’ ambiente esterno dove è presente a una concentrazione del

 20%, quindi la pressione parziale dell’ossigeno nell’atmosfera sarà di

152 mmHg (20 X 760 mmHg).

Mentre arriva agli alveoli polmonari diminuisce la pressione parziale, a

 livello alveolare è di 100mmHg. L’ossigeno diffonde. Passa

nell’eritrocita e si lega all’emoglobina (ossiemoglobina). Ogni gruppo

eme può legare una molecola di O quindi ogni eritrocita lega 4 molecole

di O. Per saturare completamente l’emoglobina è sufficiente una

pressione di 100mmHg.

Percorre la circolazione arteriosa per raggiungere i tessuti, a livello dei

 capillari c’è lo scambio dei gas. La pO qui varia da tessuto a tessuto

2

ma è circa 20-40 mmHg. Se la pO diminuisce sollecita il rilascio dell’

2

ossigeno dall’emoglobina. 22

Dall’interstizio passa per diffusione nel citosol dove c’è una pressione di

 10mmHg.

Sempre per diffusione passa nella matrice mitocondriale dove la pO è

 2

di 1mmHg, qui verrà utilizzato.

L’emoglobina ora è deossigenata e ritornata ai polmoni è pronta ad una

nuova ossigenazione.

La mioglobina, nei mitocondri quando arriva l’ossigeno va incontro a questa

reazione: Mb + O <====> MbO

2 2

Da mioglobina e ossigeno otteniamo la mioglobina ossigenata.

La quantità di ossigeno che si legherà dipende dalla pressione parziale

dell’ossigeno e dall’affinità della mioglobina nei suoi confronti. Grazie a questi

parametri si può estrapolare una curva di dissociazione che ci permette di

vedere il grado di saturazione della mioglobina.

La curva che otterremo è di tipo iperbolico, quando essa raggiunge la

saturazione significa che tutti i gruppi eme hanno legato una molecola di

ossigeno. Si osserva il valore della p50 , cioè la pressione parziale a cui la

proteina è al 50% ossigenata. La p50 della

mioglobina è di circa

2,8mmHg.

Se la mioglobina si

confronta con O alla

pressione parziale di

2,8mmHg si saturerà al

50%.

Sapendo che nel citosol la pO è di 10mmHg, nella cellula muscolare la

2

mioglobina trovandosi a questa pressione sarà quasi completamente

ossigenta. Nel momento in cui la cellula muscolare debba far fronte ad una

23

immediata e vigorosa attività fisica, il mitocondrio opererà più velocemente, e

preleverà più ossigeno dal citosol, ma essendo un passaggio per diffusione la

pressione parziale scenderà. Questo abbassamento di pressione farà

rilasciare l’ossigeno. Ad esempio se la pressione scende a 4mmHg

l’emoglobina sarà saturata al 65% e il restante 35% sarà rilasciato.

La mioglobina ha dunque delle caratteristiche che la rendono una

proteina di deposito.

Questa reazione si può analizzare attraverso la costante di dissociazione

(K ):

dis [Mb] [O ]

2

K = ——––——

dis [Mb ∙ O ]

2

la costante di dissociazione è il reciproco della costante di associazione (K )

ass

K= [MbO ] / [Mb] [O ]

2 2

Più basso è il valore della costante di dissociazione, più alta è l’affinità tra la

proteina e il ligante. Più alto è il valore della costante di associazione più è

elevata l’affinità.

La costante di dissociazione è usata per conoscere il valore frazionario della

percentuale di saturazione (Y). Siti occupati

Y= ——––————––

Siti totali

Il valore massimo di questo rapporto è 1, quando il valore del numeratore è

uguale al denominatore e quindi tutti i siti deel’eme sono occupati.

Il valore minino è 0 quando il numeratore è uguale a 0.

Y dipende:

direttamente dalla pressione parziale di ossigeno (+ aumenta + cresce

 la probabilità di saturare i vari siti) pO ;

2

inversamente dalla costante di dissociazione + pO , K + pO .

 dis 2

2

pO 2

Y= ——––———

K + pO

dis 2

Questa è l’equazione di un iperbole equilatera in cui le variabili sono Y e la

pO . Costruiamo un grafico in cui poniamo la variabile dipendente sulle

2

ascisse (pO ) e la variabile indipendente sulle ordinate (Y).

2 24

Y

0 pO 2

FUNZIONE DI TRASPORTO DELL’EMOGLOBINA

L’emoglobina con l’ossigeno va incontro ad una reazione reversibile:

⇄ Hb ∙ 4O

Hb + 4O 2 2

In realtà le quattro molecole di ossigeno non vengono legate tutte

contemporaneamente, va ricordato anche che i quattro monomeri

dell’emoglobina non sono tra loro indipendenti, e che l’emoglobina non funge

da deposito come la mioglobina ma come trasportatore.

Per essere un buon trasportatore deve:

✏ essere in grado di trasportare molta merce;

✏ essere in grado di liberare la merce giunto a destinazione.

Se l’emoglobina si comportasse come la mioglobina avremmo questa

situazione:

A livello polmonare l’eritrocita incontra una pO prossima ai 100mmHg,

2

l’emoglobina (con curva di dissociazione uguale alla mioglobina) sarebbe

sicuramente saturata.

Nei capillari con una pO tra i 20 e i 40 mmHg, l’equilibrio della reazione si

2

sposta a sinistra ma in realtà non ci sarebbe dissociazione perché il valore di

Y non sarebbe cambiato.

Quindi se l’emoglobina si comportasse come la mioglobina sarebbe un

trasportatore molto scarso.

In realtà la curva di dissociazione dell’emoglobina non ha andamento

iperbolico come la mioglobina, ma ha un andamento sigmoideo. 25

Confronto delle cinetiche di

legame dell'ossigeno di

mioglobina e emoglobina.

Per saturazione relativa si

intende la frazione di siti totali che

lega l'ossigeno; P è la pressione

50

parziale di ossigeno (pO )

2

necessaria per ottenere la

semisaturazione, ovvero il 50%

dei siti totali legati all'ossigeno.

Quindi in realtà l’emoglobina:

A livello polmonare l’emoglobina si satura al 100% (Y= prossima 1);

Nei capillari dove la pO è in media di 30mmHg, il valore di Y scende a 0,5.

2

La metà dei siti libererà ossigeno.

In un tessuto più attivo metabolicamente ( cervello,cuore, muscolo

scheletrico…), che consuma più rapidamente ossigeno, la nei capillari sarà

di 20mmHg e il valore di Y scende a 0,3, il 70% dei siti cederà ossigeno.

L’andamento sigmoideo è il risultato tra la struttura dell’emoglobina e

l’ambiente in cui opera.

L’emoglobina si trasforma da una molecola ad alta affinità per l’O negli alveoli

ad una a bassa nei capillari. Per permettere ciò si verifica un cambio

conformazionale della proteina. Le proteine quaternarie modulano la loro

funzione in risposta a variazioni strutturali.

La pO dell’emoglobina è pari a 26mmHg.

2

La mioglobina è molto più affine dell’emoglobina all’ossigeno. Per questo

l’ossigeno che viene rilasciato dall’emoglobina viene preso dalla mioglobina

che ha più affinità, e quando questa l’avrà ceduto lo prenderanno le proteine

mitocondriali ad affinità ancora maggiore. 26

I 4 monomeri dell’emoglobina nelle fasi di sviluppo

Nella vita di un individuo l’emoglobina non è la stessa. Distinguiamo una vita

embrionale, fetale, adulta.

EMOGLOBINA NELLE VARIE FASI DI SVILUPPO

VITA z e z a a e

2 2 2 2 2 2

EMBRIONALE GOWER I PORTLAND GOWER II

VITA FETALE a g a b

2 2 2 2

Hb F (fetale)

98% Hb A (adulta)

1-2 %

VITA ADULTA a b a g a d

2 2 2 2 2 2

Hb A (adulta)

97-98% Hb F (fetale) Hb A2

1,5 % 2-3 %

L’emoglobina è un tetramero già nella vita embrionale, dove è costituito da 2

catene di tipo , le catene sono di tipo .

  

Nella vita fetale il gene delle catene viene disattivato e viene attivato il gene

delle catene . Alle catene si associano delle catene di tipo non , catene

  

. Quindi troveremo un tetramero composto da per il 98% da 2 catene e 2

  

e il restante da emoglobina adulta (2 catene e 2 catene ).

  27

Al momento della nascita ci sarà un 50% di emoglobina fetale e 50% di

emoglobina adulta.

Gia 4 mesi dopo la nascita troviamo l’emoglobina che troviamo in un

individuo adulto, cioè composta 97% da emoglobina adulta, un 1% che

rappresenta un retaggio dell’emoglobina fetale, e un 2% di un nuovo tipo di

emoglobina di tipo .

 

2 2

L’emoglobina fetale ha una funzione specifica. Il feto prende l’ossigeno

attraverso la circolazione materna, strappandolo all’emoglobina materna,

questo richiede che l’emoglobina fetale abbia un affinità più alta di quella

materna per l’O. Se quest’ emoglobina persistesse nella vita adulta creerebbe

problemi perché sarebbe riluttante a cedere O a livello capillare.

Va ricordato che esistono circa 200 varianti di emoglobina adulta.

Cambiamento conformazionale dell’emoglobina.

Il cambiamento conformazionale che garantisce all’emoglobina lo

svolgimento della sua funzione di trasportatore deve essere indotto da

qualcosa: il valore di pressione parziale dell’O.

Una prova che ci dimostra che va incontro a cambi conformazionali è

realizzata coi cristalli di emoglobina.

1) Si fanno scoppiare gli eritrociti in una soluzione ipotonica, liberando

l’emoglobina;

2) Si centrifuga;

3) Quello che resta delle membrane cell.(fantasmi) precipita, l’emoglobina

rimane in soluzione;

4) Si tratta con Sali, solfato di ammonio;

5) Si mette in frigorifero per 24-48 ore e si formano i cristalli di

emoglobina.

Se realizziamo questi in assenza di ossigeno vedremo che una volta esposti

all’O i cristalli si frantumeranno proprio in seguito al cambio conformazionale

da deossiemoglobina a ossiemoglobina.

Una molecola di emoglobina proveniente dai tessuti che ritorna a livello

polmonare si trova in una conformazione a bassa affinità, ma la pressione

parziale è così elevata che induce il primo gruppo eme a legarsi.

Questa è la tappa limitante dell’ossigenzione, la più lenta. Fa partire l’effetto

cooperativo che c’è fra i vari gruppi eme, il secondo gruppo eme sarà più

accessibile e così la terza e la quarta molecola.

Questo è la cooperatività positiva di legame. 28

Le reazioni che avvengono nell’emoglobina per legare O sono in realtà 4

ognuna con la sua costante di dissociazione e vediamo che man mano

diminuisce aumentando così l’affinità per l’O.

Il processo inverso avviene a livello dei tessuti.

Questo spiega anche l’andamento sigmoideo della curva di saturazione.

La conformazione a bassa affinità è detta CONFORMAZIONE T.

La conformazione della proteina si riferisce sia a livello quaternario (iterazioni

tra i monomeri) che a livello terziario (spostamenti di eliche).

FORMA T bassa affinità per l’O 2

⇨ DeossiHb

DEOSSI, CONFORMAZIONE T

La conformazione ad alta affinità è detta CONFORMAZIONE R.

FORMA R alta affinità per l’O

2

⇨ OssiHb 29

OSSI, CONFORMAZIONE R

La forma T è detta così per l’aggettivo inglese tight=tesa, dando l’idea di una

proteina difficilmente accessibile all’O, tanto che se se quando assume

questa forma l’O è ancora legato viene escluso.

Consiste in una struttura dove oltre alle forme di coesione, tra i 4 monomeri ci

sono ponti salini (legami ionici).

I legami ionici sono 8 e sono simmetrici, possono essere intracatena e

intercatena.

3+

NH Asp His COO-

94 146 3+

COO- Arg Asp Lys NH

141 126 40

3+

NH Lys Asp Arg COO-

40 126 141 3+

COO- His Asp NH

146 94

INTRACATENA ad es. nelle catene l’Asp 94 carico negativamente con

l’His 146, l’ultimo amminoacido e che quindi ha ‘ultimo COOH libero.

INTERCATENA ad es. l’His 146 (catena ) con il gruppo COO- con la Lys 40

(catena ), ciò accade anche nell’altro dimero – .

  

Tra le due catene ci sono 2 coppie di ponti salini. Tra N terminale e C

a

terminale dell’altra e tra Arg 141 e Asp 126. 30

Questi legami stabilizzano la forma T, in questa forma l’O è difficilmente

2

accessibile ad uno dei 4 gruppi eme, perché:

Il piano dell’eme nella forma T è un po’ concavo.

 Il Fe legato all’His F8 non si trova al centro del gruppo eme ma lo

 sovrasta di 0,6 A°.

Questo accade per un impedimento sterico realizzato da residui, fra cui il più

significativo è la Valina dell’ansa FG.

Va ricordato che il Fe ha n°atomico 26, rientra negli elementi di transizione

(che hanno orbitali incompleti, con elettroni spaiati ed orbitali liberi)

↑↓ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑↓

Fe 3d 4s 4p

Quando diventa ione ferroso, vengono perduti 2 e- dell’orbitale 4s, quindi

rimangono vuoti 4s 4p 5s che possono ospitare i 4 N pirrolici e l’ His F8.

2+

Il Fe diventa pentacordinato. Il Fe non si trova sul piano dell’eme, grazie al

fatto che gli e- dell’orbitale si trovano ad alto spin (ospitano il maggior numero

di orbitali liberi). Le dimensioni dello ione e l’impedimento dell’ansa FG non lo

rendono in grado di trovarsi al centro dell’eme.

2+ ↑↓ ↑ ↑ ↑ ↑

Fe

Alto

spin 3d 4s 4p

Quando a livello polmonare grazie all’elevata pO si inizia a legare la prima

2

molecola di O causa una transizione di spin, perché alla forza di repulsione

interelettronica che prima portava a un alto spin si contrappone la forza di

campo del legante. Si passa dunque da alto spin a basso spin, per cui il

diametro atomico del Fe si riduce e riesce a posizionarsi al centro dell’eme.

2+ ↑↓ ↑↓ ↑↓

Fe

Basso

spin 31

Il legame di coordinazione tra His F8 (istidina prossimale) e ione ferroso non

è perpendicolare al piano dell' anello tetrapirrolico, ma è inclinato di circa 8°.

Quando l' ossigeno instaura il sesto legame di coordinazione trascina lo

 ione Fe(II) nel piano della protoporfirina IX,causandone

causandone l' appiattimento.

La repulsione tra l' eme ed uno degli idrogeni dell' anello imidazolico

 dell' istidina F8 da una parte, e quella con il residuo di valina FG5

provoca uno spostamento di His F8 che rende perpendicolare al piano

dell' eme il quinto legame di coordinazione.

Il riallineamento di His F8 trascina con sè l' elica F e il gomito FG

 provocando la rottura dei ponti idrogeno e legami salini tra il C terminale

di una sottounità b e l' elica C della sottounità a appartenente all' altro

dimero.

In questo modo lo spazio tra elica F e G non è più sufficiente per

 ospitare un residuo di Tyr che si posizionerà all’esterno.

all’esterno

Questo accade quando la prima molecola di O si lega all’eme. Poiché i

 4 monomeri cooperano, si rompono anche i ponti salini degli altri

monomeri. 32

La progressiva perdita di ponti salini è accompagnata al processo di

 ossigenazione reso sempre più facile.

Alla fine otteniamo la proteina nella forma R dove non ci sono più ponti

 salini e ha acquisito la massima affinità all’O.

Quando a livello dei tessuti viene rilasciata la prima molecola di O, il Fe

torna ad alto spin, e si allontana dal centro dell’eme.

Il segmento F si ritira, si crea l’ansa, inizia la formazione dei ponti salini fino a

passare a bassa affinità per l’O.

In termini di cristallo è evidente l’allontanamento tra i due monomeri tra loro

di 7-8 A°, quando passa nella forma T.

Il cambio di conformazione oltre che la concentrazione dei reagenti permette

maggiore liberazione e acquisizione di O.

Modulazione del processo di ossigenazione e

deossigenazione

Un tessuto attivo metabolicamente consuma O e produce composti ultimi del

metabolismo. Se è un tessuto aerobio (cuore, cervello) un nutriente viene

bruciato con l’O , producendo H O e CO . Se un tessuto è occasionalmente

2 2 2

anaerobio (muscolare), produce anche acido lattico.

Un tessuto più lavora più produce composti acidi, CO , calore.

2

Nei tessuti dove l’Hb arriva si produce CO , abbassamento del pH,

2

innalzamento di temperatura.

Ci aspettiamo di vedere che questa situazione sposti l’equilibrio verso la

forma T. 33

PCO 2

Y 10mmHg

20mmHg

40mmHg

0,4

0,25 15 30 45 60 PO 2

L’Hb quando arriva nel capillare trova un pCO =20mmHg, Y=0,4, cioè il 60%

2

dei siti ha ceduto l’ O .

2

Nella curva con pCO =40 mmHg, Y=0,25, il 75% dei siti ha ceduto l’ O .

2 2

Se quindi la pCO =40 mmHg la curva si sposta a destra, mentre se la la

2

pCO =10mmHg si sposta a sx.

2

Maggiore è la produzione di CO maggiore è la tendenza a liberare O .

2 2

Con lo stesso schema sperimentale possiamo vedere l’influenza del pH.

Man mano che il pH diminuisce l a curva si sposta verso destra, facilitando il

rilascio di ossigeno, diminuisce il valore di Y.

L’effetto di CO e del pH va visto sempre in termini di equilibrio R—T.

2

La CO agisce in 2 modi:

2

1) La CO può reagire con gruppi amminici terminali non coinvolti nei ponti

salini: +

+

NH + CO N—COO- + H

3 2 I

H +

E’ una carbamminazione che provoca liberazione di H .

Quando la CO si lega all’Hb non si lega al gruppo eme ma ai gruppi

2

amminici terminali, formando una carboamminoHb.

Introduce così 2 cariche negative nell’Hb realizzando ulteriori ponti

salini.

Ogni volta che la CO si lega all’Hb sposta l’equilibrio verso la forma T,

2 +

introducendo nuovi ponti salini, inoltre si libera H e si abbassa quindi il

pH. → →

2) CO + H O H CO H CO

2 2 2 3 3- 34


PAGINE

53

PESO

1.26 MB

AUTORE

Sara F

PUBBLICATO

+1 anno fa


DETTAGLI
Esame: Biochimica I
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in Biotecnologie mediche e farmaceutiche
SSD:
Università: Firenze - Unifi
A.A.: 2013-2014

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Sara F di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biochimica I e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Firenze - Unifi o del prof Camici Guido.

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