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Biochimica I - Enzimi - Riassunto esame, prof. Camici Appunti scolastici Premium

Riassunto di Biochimica I sugli Enzimi. Nello specifico gli argomenti trattati sono i seguenti: Un estratto cellulare è un omogenato, la fermentazione alcolica, reazioni della glicolisi, reazione enzimatica, equazione di Arrhenius, La riduzione dell’energia... Vedi di più

Esame di Biochimica I docente Prof. G. Camici

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ESTRATTO DOCUMENTO

ENZIMI

La presenza degli enzimi era supposta già dal XIX secolo.

Fu un biochimico che scoprì che si poteva realizzare in vitro, con estratti

cellulari di lievito la trasformazione di glucosio in alcool etilico secondo la

reazione:

₆ ₆ ⇒ ₂ ₅ ₂

C H O 2C H OH + 2CO

12

Questa reazione è la fermentazione alcolica, la risultante delle 11 reazioni

della glicolisi.

Un estratto cellulare è un omogenato ottenuto estraendo il contenuto di una

cellula dopo la sua rottura.

Per questo motivo fu coniato il termine enzima dal greco: en= dentro, zyme=

lievito.

Si scoprì in seguito che gli enzimi erano proteine e che se l’estratto veniva

anche se blandamente riscaldato, perdeva la capacità di realizzare la

reazione. Quando l’estratto veniva lentamente raffreddato recuperava la sua

capacità.

Quasi tutte le reazioni sono catalizzate da enzimi.

Ipotizziamo una reazione:

 ⇒

S P

Dove il reagente S si trasforma nel suo prodotto P.

 In termini di velocità di reazione consideriamo v , la velocità iniziale.

0

 Va considerata la velocità iniziale perché la velocità di una reazione è

proporzionale alla concentrazione del reagente ([S]) e alla costante K:

v= K[S]

Quando la reazione procede S si consuma , modificando [S], e la

velocità sarà rappresentata dalla concentrazione in un dato momento

per la costante. 6 12

La presenza dell’enzima aumenta da 10 fino a 10 la velocità iniziale di

reazione, rispetto alla stessa non catalizzata.

La K , la costante di equilibrio, non viene modificata dalla presenza

eq

dell’enzima.

L’enzima fa raggiungere l’ equilibrio molto più rapidamente ma non

cambia le proprietà intrinseche della reazione. Le proprietà intrinseche

sono le proprietà termodinamiche: se una reazione è termodinamicamente

55

impossibile a determinarsi perché non avverrà mai indipendentemente

G>0,

dalla presenza dell’enzima. 6 12

Gli enzimi hanno alto potere catalitico, tra 10 e 10 , per potere catalitico

si intende il numero di volte che aumenta la velocità di reazione in presenza

dell’enzima.

Gli enzimi sono dotati di alta specificità.

Sono sottoposti a regolazione, che può essere più o meno sofisticata. Una

regolazione

regolazione fondamentale è la dipendenza da disponibilità di substrato. Infatti

gli enzimi sono sempre presenti quello che li fa attivare è la concentrazione di

substrato.

Per studiare una reazione enzimatica bisogna considerare il tipo di reazione,

ad es:

✗ Se è una reazione in cui i reagenti e i prodotti variano durante essa, si

possono utilizzare le proprietà ottiche (come la variazione

dell’assorbimento ottico), con lo spettrofotometro.

✗ Se è una reazione a cui si accompagna produzione di H+, si può

immergere un elettrodo a vetro nel cocktail dove avviene la reazione.

✗ Se è una reazione in cui si sviluppa una sostanza fosforescente, si usa il

fluorimetro.

A seconda del tipo di reazione si può tirare fuori un segnale che consente un

elaborazione di tipo cinetico.

cinetico

Il segnale ricavato viene portato su un oscilloscopio e poi su un registratore,

per ricavare una curva. Su questa curva abbiamo il tempo decorso della

reazione e la variazione di concentrazione del reagente.

con estratto enzimatico senza estratto enzimatico

[S] 0 t/2 t 56

Questa curva rappresenta una reazione enzimatica. Se facciamo avvenire la

stessa reazione alle stesse condizioni senza estratto enzimatico S si

trasforma a velocità ridotta, otteniamo una retta poco pendente.

Vogliamo calcolare la velocità iniziale:

v =d[S]

0 dt

Per ricavare la velocità abbiamo due modi:

✒ Tramite il t/2 della reazione e la costante cinetica.

Il t/2 è il tempo necessario affinché la reazione sia completata per metà.

Una volta determinato sperimentalmente il t/2, ci ricaviamo la costante

cinetica, K.

K è legato a t/2 da questa reazione:

K= ln2 = 0,693

t/2 t/2

Quindi v sarà uguale alla costante cinetica per la concentrazione iniziale:

0

v = K[S]

0 0

✒ L’altro metodo è sempre sperimentale. La v viene valutata

0

graficamente mandando la tangente alla curva nel punto iniziale.

[S] t

Tracciamo la tangente perché con essa simuliamo che la reazione

proceda sempre con lo stesso valore iniziale di velocità. Misuriamo

57

quindi nell’unità di tempo qual è stata la variazione di [S] secondo la

tangente. Tracciando la tangente quindi prendo il valore iniziale di

variazione di [S], sull’unità di tempo, cioè: d[S] / dt, che è la velocità

iniziale.

Il valore della velocità iniziale calcolata con la costante cinetica e quello

calcolato tramite la tangente di solito coincidono tranne che per errore

sperimentale, sono entrambi ottimi sistemi.

La costante di velocità, K, serve per capire dal punto di vista termodinamico

perché l’enzima aumenta la velocità di una reazione.

L’enzima aumenta la velocità di una reazione perché riduce l’energia di

attivazione del sistema.

Arrhenius scoprì che la temperatura influenza la costante di velocità K e che

esiste un rapporto tra K e l’energia di attivazione; egli quindi scoprì

un’equazione detta equazione di Arrhenius:

Arrhenius

– (Ea/Rt)

K = A∙ e

K è la costante di velocità specifica.

A Fattore di frequenza che ci fornisce una stima degli urti molecolari che

concorrono a far avvenire la reazione.

Ea è l’energia di attivazione.

R è la costante dei gas.

t è la temperatura a cui si opera.

Trasformiamo ora la reazione in modo da avere logaritmi con base naturale e

otteniamo: lnK = lnA – EA/RT

da questo capiamo che K aumenta se:

aumenta il fattore sterico A,

o diminuisce EA/RT,

o entrambe le cose.

o 58

Misuriamo EA in presenza e in assenza di enzima. Possiamo eseguire

diverse misure al variare della temperatura:

T 20°

25°

Di queste curve possiamo determinare il t/2 e quindi ricavare K. Possiamo

adesso costruire un grafico con le variabile 1/t (reciproco dell’unità di tempo)

e lnK.

lnK La pendenza della retta è uguale

ad EA/R. Essendo R una

A costante possiamo determinare il

1 EA/R valore dell’energia di attivazione.

reazione con enzima:

pendenza diminuita

A Se calcoliamo l’intersezione con

l’asse y troveremo il valore di A.

Perché se lnK= lnA-EA/RT,e se

EA/R reazione non catalizzata 1/t è uguale a 0, tutto il termine

EA/RT è uguale a 0.

1/t

La curva in rosa rappresenta la reazione con l’enzima e vediamo che la

pendenza è diminuita. Il valore si A è aumentato e di conseguenza anche K

aumenterà. Essendo su scala logaritmica una aumento di A di 2 equlvale ad

un aumento di velocità 100.

Ricapitolando confrontando due reazioni uguali, alle stesse condizioni, la

reazione con l’enzima avrà il valore di EA/R diminuisce (< pendenza della

retta), A aumenta e quindi K aumenterà. 59

La riduzione dell’energia di attivazione da parte di un enzima.

L’enzima è una proteina globulare e quindi possiede una struttura terziaria

(alcuni anche quaternaria). Questa struttura a conferito loro due siti:

✰ Il sito attivo è un microambiente tridimensionale della struttura terziaria

che dove si trovano i residui coinvolti nella reazione. Crea le condizione

affinché la reazione avvenga.

✰ Il sito catalitico è un porzione molto piccola del sito attivo formato da i

pochi residui amminoacidici (2-3) coinvolti direttamente nella reazione.

Nel sito attivo viene a essere ospitato il substrato, realizzando un complesso

substrato

a due (o a tre nelle reazione di tipo A+B C+D).

Nel caso di una reazione non catalizzata, la possibilità che avvenga la

reazione dipende dalla probabilità che che le molecole si incontrino.

La presenza dell’enzima a cui è legato il substrato fa sì che le molecole

non debbano più incontrarsi per caso ma il loro incontro viene facilitato

e si trovano già nella posizione ideale per lo svolgimento della reazione.

Quando avviene questo legame enzima e substrato devono adattarsi.

Gli atomi del substrato quando si trovano nel sito attivo possono essere legati

da legami che dopo questo adattamento indotto vengono rafforzati o

indeboliti, ma comunque resi più suscettibili alla reazione.

Trovandosi in questa situazione il sistema non ha bisogno di energia extra.

P ARLIAMO DELLA RELAZIONE CHE INTERCORRE TRA VELOCITÀ INIZIALE E

.

CONCENTRAZIONE DEL SUBSTRATO

Ricordiamo che è la concentrazione del substrato a regolare l’attività

dell’enzima.

Consideriamo una serie di curve a concentrazioni di substrato crescenti:

[S] v

[S] All’aumentare di

0

millimolare n.moli/min S avremo valori

5 10 crescenti di

10 18

5mM velocità.

15 23

20 29

10mM v =K[S]

0

25 32

15mM 50 45

20mM

t 60

Con questi valori costruiamo un grafico: Otteniamo la curva di

Velocità saturazione . L’enzima è

saturato quando tutte le

molecole enzimatiche saranno

saturate dal substrato.

osservata Un sistema chimico non

enzimatico non è saturabile e

perciò otterremo una retta.

La curva sembra un iperbole.

L’equazione che quindi

[S] legherà la velocità iniziale con

la concentrazione è:

A ∙ x

Y= B+ x

Per dimostrare questa equazione partiamo dal modello cinetico adottato da

Michaelis e Menten.

Secondo questo modello:

L’enzima con una serie di reazioni si lega al substrato, creando il

 complesso Enzima-Substrato. Questo risulta da un processo di

adattamento complementare ma anche indotto.

E + S ES

Questo complesso può dissociarsi in un equilibrio tra forma libera e forma

 impegnata, o decomporsi e liberare enzima e prodotto della reazione.

⇄ ⇒

E + S ES E + P 61

L’enzima non viene modificato nel corso della reazione, e proprio per

 questo può riproporsi in un secondo ciclo. Se dividiamo in due questa

serie di due reazioni: ⇒

E + S ES

ES E + P

(si può fare la somma di due reazioni se il prodotto della prima diventa

reagente della seconda) ⇒

E + S

E S E + P

S P

Semplificando otteniamo che il substrato si trasforma in prodotto, quindi la

reazione si svolge comunque senza l’enzima che serve solo ad amplificarne

la velocità.

In una reazione chimica possiamo avere più substrati, e prima che si liberi

 il prodotto deve legarsi al sito attivo.

Se una reazione enzimatica è reversibile, quindi dobbiamo porre la freccia

inversa anche all’ultima reazione. Consideriamo le tre reazioni:

1. E + S ES con una velocità determinata dalla costante K

1

-1

2. ES E + S con la costante K

3. ES E + P con la costante K cat

La terza reazione è la tappa limitante ed è la reazione che regola l’intero

processo.

C’è una reazione che porta da E+S a ES, e due reazioni che rimuovono

 ES, dalla combinazione di queste reazioni noi abbiamo una

concentrazione di ES all’equilibrio.

V = K [E] [S]

f 1

All’equilibrio la velocità con cui si forma (in una singola reazione) ES, è

 uguale al prodotto della costate cinetica per la concentrazione dei

reagenti.

Le reazioni che portano alla scomparsa di ES sia per dissociazione che

 per decomposizione, quindi la velocità di scomparsa è il risultato di due

reazioni ognuna con la propria costante.

-1

V = (K + K ) [ES]

s cat 62

All’equilibrio V e V sono uguali e per questo possiamo uguagliare i

 f s

secondi membri: -1

(K + K ) = [E] [S]

cat

K [ES]

1

Essendo il primo membro un rapporto di costanti può essere riassunto da

 un’unica costante detta K M K = [E] [S]

M [ES]

Ricordiamo che la velocità iniziale dipende dalla tappa limitante perciò:

V = K [ES]

0 cat

Il valore massimo della velocità si ottiene quando tutte le molecole

dell’enzima sono saturate: V = K [E ]

max cat t

E = concentrazione dell’enzima totale

t

Ritornando alla reazione: K = [E] [S]

M [ES]

al numeratore abbiamo una data concentrazione dell’enzima, mentre al

denominatore una concentrazione dell’enzima legato al subtrato.

Quindi al numeratore c’è la quota di enzima libero, possiamo

 scrivere: K = ([E ] - [E ]) [S]

M t s

[ES]

Dove E è dato dalla differenza tra l’enzima totale con la quota che ha

 reagito col substrato. Risolviamo:

K = [E ] [S] - [ES] [S] ;

 M t [ES]

K = [E ] [S] - [ES] [S] ;

 M t

[ES] [ES] 63

K + S = [E ] [S] ;

 M t

[ES]

[ES] = [E ] [S]

 t

K + S

M

Dalla reazione V = K [ES] possiamo ricavare che [ES] = V

 0 cat 0 ,

K cat

Sostituiamo questo valore: V = [E ] [S]

0 , t

K K + S

cat M

Portiamo K al secondo membro:

 cat V = K [ES] [S]

0 cat

K + S

M

Dalla reazione V = K [E ] ricaviamo che:

 max cat t V = V [S]

0 max

K + S

M

Questa equazione ottenuta è quella di un iperbole equilatera.

Abbiamo dimostrato il modello cinetico minimo.

La curva iperbolica ha un asindoto e raggiunge il valore max all’infinito, quindi

il valore della velocità max è un valore tendenziale e si raggiunge a

concentrazioni infinite di substrato.

K è un valore cinetico, e un’indicazione del grado di affinità tra enzima e

M

substrato. L’affinità va interpretata come concentrazione di substrato in grado

di attivare l’enzima, più bassa è la concentrazione del substrato più alta è

l’affinità.

K è la determinata concentrazione a cui si ottiene la velocità semimassimale

M

della reazione.

Questo lo possiamo dedurre dalla formula di Michaelis e Menten, quando

V = V

0 max

2

K sarà uguale a [S]:

M V = V [S]

0 max 64

K + S

M

V = V [S]

max max

2 K + [S]

M

K + [S] = 2 V [S]

M max

V max

K + [S] = 2 [S]

M K = [S]

M

Torniamo alla curva trovata sperimentalmente e troviamo il valore di K .

M

V V

0 MAX

V MAX

2 K [S]

M

Le condizioni sperimentali non consentono di avere una curva che va

visibilmente a saturazione e bisogna approssimare l’asindoto. In questa curva

non è possibile aumentare [S] fino a quando la velocità raggiunge il max

perché ci può essere una sovraconcentrazione di reagenti.

Calcolarci il V su questa curva è arbitrario per questo è necessario

max

ricorrere ad un artificio matematico detto di Darkon su Darkon.

Questo consiste nel fare il reciproco dell’equazione dell’iperbole ottenendo

l’equazione di una retta. 1 = K + [S]

M 65

V V [S]

0 max

1 = K + [S]

M

V V [S] V [S]

0 max max

Otteniamo la relazione di Lineweaever- Burk

1 = K 1 + 1

M

V V [S] V

0 max max

Questa è l’equazione di una retta del tipo y= ax + b dove a è la pendenza e

b l’intercetta sull’asse delle ordinate.

Costruiamo il nostro grafico secondo quest’equazione quindi avremo in

ascisse il reciproco delle concentrazioni e in ordinate il reciproco delle

velocità iniziali.

1 0,1

V 0 0,05 1 = 0,014

V max

- 0,033 0,06 0,16

1 1

V [S]

0

0,1 0,2

0,052 0,1

0,043 0,067

0,034 0,05

0,031 0,04

0,022 0,02 66

Estrapoliamo la retta fino a quando non incontra l’asse delle ordinate e delle

ascisse e le due intercette ci danno il valore di K e V .

M max

L’intercetta dell’asse delle ordinate è il reciproco di V , 1/V = 0,014,

max max

quindi V = 71MMmin,

max

L’enzima ha una velocità di 71 MMmin e trasporta nell’unità di tempo 71

micromoli di substrato in condizioni di saturazione.

Il prodotto K / V 1/[S], quando siamo sull’intercetta delle ordinate, e 1/

M max

[S]=0 è zero e quindi 1/V = 1/V .

0 max

L’intercetta sulle ascisse è 0 quindi 1/V = 0

0

0 = K 1 + 1

M

V [S] V

max max

K 1 = - 1

M

V [S] V

max max

1 = - 1 V max

[S] V K

max M

1 = - 1

[S] K

M

K è la concentrazione di S a cui si dà la velocità massimale. L’enzima

M

comincia a trasformare il substrato solo quando la concentrazione raggiunge

valori nell’ordine di grandezza di K .

M

La velocità semimassimale si ottiene quando il 50% dei siti è occupato dal

substrato.

La K è la concentrazione del substrato necessaria per occupare metà dei

M

siti, se il K è basso c’è alta affinità tra enzima e substrato.

M

INIBIZIONE ENZIMATICA

Gli inibitori modificano in una reazione o il K o il V .

M max

L’enzima può essere modificato in diversi modi, ad es. una modificazione

chimica. Quando la modificazione chimica è di tipo irreversibile porta

all’inattivazione dell’enzima. Esistono inattivazioni irreversibili destinate ad

eliminare una popolazione enzimatica che poi vengono distrutte dalla cell.

riutilizzando gli amminoacidi.

Un enzima in vivo può essere inattivato, inibito da elevata temperatura,

attraverso un processo reversibile dove la rinaturazione è possibile. Esistono

numerose situazioni che portano inibizioni reversibili ad es. l’avvelenamento

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flaviael

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DESCRIZIONE APPUNTO

Riassunto di Biochimica I sugli Enzimi. Nello specifico gli argomenti trattati sono i seguenti: Un estratto cellulare è un omogenato, la fermentazione alcolica, reazioni della glicolisi, reazione enzimatica, equazione di Arrhenius, La riduzione dell’energia di attivazione da parte di un enzima, ecc.


DETTAGLI
Esame: Biochimica I
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in Biotecnologie mediche e farmaceutiche
SSD:
Università: Firenze - Unifi
A.A.: 2013-2014

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher flaviael di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biochimica I e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Firenze - Unifi o del prof Camici Guido.

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