Biochimica I - Enzimi - Riassunto esame, prof. Camici

Enzimi

La presenza degli enzimi era supposta già dal XIX secolo. Fu un biochimico che scoprì che si poteva realizzare in vitro, con estratti cellulari di lievito, la trasformazione di glucosio in alcool etilico secondo la reazione:

^{6 6} ⇒ ^{2 5 2} C H O 2C H OH + 2CO

Questa reazione è la fermentazione alcolica, la risultante delle 11 reazioni della glicolisi. Un estratto cellulare è un omogenato ottenuto estraendo il contenuto di una cellula dopo la sua rottura. Per questo motivo fu coniato il termine enzima dal greco: en= dentro, zyme= lievito.

Si scoprì in seguito che gli enzimi erano proteine e che se l’estratto veniva anche se blandamente riscaldato, perdeva la capacità di realizzare la reazione. Quando l’estratto veniva lentamente raffreddato recuperava la sua capacità. Quasi tutte le reazioni sono catalizzate da enzimi.

Reazione catalizzata

Ipotizziamo una reazione:

 ⇒ S P
Dove il reagente S si trasforma nel suo prodotto P.

 In termini di velocità di reazione consideriamo v₀, la velocità iniziale.

 Va considerata la velocità iniziale perché la velocità di una reazione è proporzionale alla concentrazione del reagente ([S]) e alla costante K:

v = K[S]

Quando la reazione procede S si consuma, modificando [S], e la velocità sarà rappresentata dalla concentrazione in un dato momento per la costante.

La presenza dell’enzima aumenta da 10⁶ fino a 10¹² la velocità iniziale di reazione, rispetto alla stessa non catalizzata. La K_eq, la costante di equilibrio, non viene modificata dalla presenza dell’enzima. L’enzima fa raggiungere l’equilibrio molto più rapidamente ma non cambia le proprietà intrinseche della reazione. Le proprietà intrinseche sono le proprietà termodinamiche: se una reazione è termodinamicamente impossibile a determinarsi perché non avverrà mai indipendentemente dalla presenza dell’enzima.

Gli enzimi hanno alto potere catalitico, tra 10⁶ e 10¹², per potere catalitico si intende il numero di volte che aumenta la velocità di reazione in presenza dell’enzima. Gli enzimi sono dotati di alta specificità. Sono sottoposti a regolazione, che può essere più o meno sofisticata. Una regolazione fondamentale è la dipendenza da disponibilità di substrato. Infatti gli enzimi sono sempre presenti, quello che li fa attivare è la concentrazione di substrato.

Studio di una reazione enzimatica

Per studiare una reazione enzimatica bisogna considerare il tipo di reazione, ad esempio:

• Se è una reazione in cui i reagenti e i prodotti variano durante essa, si possono utilizzare le proprietà ottiche (come la variazione dell’assorbimento ottico), con lo spettrofotometro.
• Se è una reazione a cui si accompagna produzione di H⁺, si può immergere un elettrodo a vetro nel cocktail dove avviene la reazione.
• Se è una reazione in cui si sviluppa una sostanza fosforescente, si usa il fluorimetro.

A seconda del tipo di reazione si può tirare fuori un segnale che consente un’elaborazione di tipo cinetico. Il segnale ricavato viene portato su un oscilloscopio e poi su un registratore, per ricavare una curva. Su questa curva abbiamo il tempo decorso della reazione e la variazione di concentrazione del reagente.

Questa curva rappresenta una reazione enzimatica. Se facciamo avvenire la stessa reazione alle stesse condizioni senza estratto enzimatico, S si trasforma a velocità ridotta, otteniamo una retta poco pendente.

Calcolo della velocità iniziale

Vogliamo calcolare la velocità iniziale:

v = d[S]₀ / dt

Per ricavare la velocità abbiamo due modi:

• Tramite il t/2 della reazione e la costante cinetica. Il t/2 è il tempo necessario affinché la reazione sia completata per metà. Una volta determinato sperimentalmente il t/2, ci ricaviamo la costante cinetica, K. K è legato a t/2 da questa reazione: K = ln2 / t/2 = 0,693/t/2. Quindi v₀ sarà uguale alla costante cinetica per la concentrazione iniziale: v₀ = K[S]₀
• L’altro metodo è sempre sperimentale. La v₀ viene valutata graficamente mandando la tangente alla curva nel punto iniziale. Tracciamo la tangente perché con essa simuliamo che la reazione proceda sempre con lo stesso valore iniziale di velocità. Misuriamo quindi nell’unità di tempo qual è stata la variazione di [S] secondo la tangente. Tracciando la tangente quindi prendo il valore iniziale di variazione di [S], sull’unità di tempo, cioè: d[S] / dt, che è la velocità iniziale.

Il valore della velocità iniziale calcolata con la costante cinetica e quello calcolato tramite la tangente di solito coincidono tranne che per errore sperimentale, sono entrambi ottimi sistemi.

La costante di velocità, K, serve per capire dal punto di vista termodinamico perché l’enzima aumenta la velocità di una reazione. L’enzima aumenta la velocità di una reazione perché riduce l’energia di attivazione del sistema.

Equazione di Arrhenius

Arrhenius scoprì che la temperatura influenza la costante di velocità K e che esiste un rapporto tra K e l’energia di attivazione; egli quindi scoprì un’equazione detta equazione di Arrhenius:

K = A∙e^–(Ea/Rt)

K è la costante di velocità specifica. A è il fattore di frequenza che ci fornisce una stima degli urti molecolari che concorrono a far avvenire la reazione. Ea è l’energia di attivazione. R è la costante dei gas. t è la temperatura a cui si opera.

Trasformiamo ora la reazione in modo da avere logaritmi con base naturale e otteniamo: lnK = lnA – EA/RT. Da questo capiamo che K aumenta se:

• Aumenta il fattore sterico A,
• O diminuisce EA/RT,
• O entrambe le cose.

Misuriamo EA in presenza e in assenza di enzima. Possiamo eseguire diverse misure al variare della temperatura:

T: 20° 25°

Di queste curve possiamo determinare il t/2 e quindi ricavare K. Possiamo adesso costruire un grafico con le variabili 1/t (reciproco dell’unità di tempo) e lnK.

La pendenza della retta è uguale ad EA/R. Essendo R una costante possiamo determinare il valore dell’energia di attivazione.

La curva in rosa rappresenta la reazione con l’enzima e vediamo che la pendenza è diminuita. Il valore si A è aumentato e di conseguenza anche K aumenterà. Essendo su scala logaritmica un aumento di A di 2 equivale ad un aumento di velocità di 100.

Ricapitolando, confrontando due reazioni uguali, alle stesse condizioni, la reazione con l’enzima avrà il valore di EA/R diminuito (< pendenza della retta), A aumentato e quindi K aumenterà.

Riduzione dell'energia di attivazione

La riduzione dell’energia di attivazione da parte di un enzima. L’enzima è una proteina globulare e quindi possiede una struttura terziaria (alcuni anche quaternaria). Questa struttura ha conferito loro due siti:

• Il sito attivo è un microambiente tridimensionale della struttura terziaria che dove si trovano i residui coinvolti nella reazione. Crea le condizioni affinché la reazione avvenga.
• Il sito catalitico è una porzione molto piccola del sito attivo formato da pochi residui amminoacidici (2-3) coinvolti direttamente nella reazione.

Nel sito attivo viene a essere ospitato il substrato, realizzando un complesso substrato—a due (o a tre nelle reazioni di tipo A+B—>C+D). Nel caso di una reazione non catalizzata, la possibilità che avvenga la reazione dipende dalla probabilità che le molecole si incontrino. La presenza dell’enzima a cui è legato il substrato fa sì che le molecole non debbano più incontrarsi per caso ma il loro incontro viene facilitato e si trovano già nella posizione ideale per lo svolgimento della reazione. Quando avviene questo legame enzima e substrato devono adattarsi. Gli atomi del substrato quando si trovano nel sito attivo possono essere legati da legami che dopo questo adattamento indotto vengono rafforzati o indeboliti, ma comunque resi più suscettibili alla reazione. Trovandosi in questa situazione il sistema non ha bisogno di energia extra.

Relazione tra velocità iniziale e concentrazione del substrato

Ricordiamo che è la concentrazione del substrato a regolare l’attività dell’enzima. Consideriamo una serie di curve a concentrazioni di substrato crescenti:

• [S] 5 10 15 20 25
• Velocità (n.moli/min) 0 10 18 23 29 32 45

Con questi valori costruiamo un grafico: otteniamo la curva di velocità di saturazione. L’enzima è saturo quando tutte le molecole enzimatiche saranno saturate dal substrato. Un sistema chimico non enzimatico non è saturabile e perciò otterremo una retta. La curva sembra un'iperbole.