Esame biochimica

Emoproteine e biochimica del ferro

Emoglobina e mioglobina sono definite cromoproteine o emoproteine per la presenza dell’eme come gruppo prostetico, il quale conferisce la caratteristica colorazione rosso sangue.

Mioglobina

• Monomerica (max. struttura terziaria)
• Lega reversibilmente l’O₂ per cederlo alla citocromo ossidasi mitocondriale
• 153 amminoacidi
• Per le sue dimensioni non passa il filtro renale, permettendo il recupero del Fe

Emoglobina

• Multimerica (max. struttura quaternaria)
• Lega reversibilmente l’O₂ per trasferirlo a tutti i distretti
• Catena α 141 amminoacidi
• Catena β 146 amminoacidi
• Presente nei globuli rossi in una concentrazione di 12-13g/100ml di volume

Analogie

• Proteine globulari con configurazione molto simile date le somiglianze nelle proprietà chimiche delle catene laterali degli amminoacidi
• Porzione nobile gruppo prostetico che permette di legare reversibilmente l’O₂
• Componente proteica finalizzata a rendere ottimale la funzionalità della componente prostetica nella sua interazione con l’O₂
• La mioglobina e ogni subunità dell’emoglobina sono costituite da 8 domini ad alfa elica (da A a H), all’interno delle quali alcuni amminoacidi occupano sempre la stessa posizione (Istidina F8 Prossimale; Istidina E7 Distale)
• Il gruppo prostetico (eme) si trova in una tasca idrofobica costituita dalle catene laterali degli amminoacidi apolari della componente proteica perché il ferro deve essere mantenuto in forma ridotta (ferroso); se ferrico -> metaemoglobina e metamioglobina non in grado di legare O₂ eventualmente ripristinate dalla metaemo/mioglobina reduttasi
• Nei citocromi, anch’essi proteine a ferro eminico, il ferro deve invece poter ridursi/ossidarsi per permettere il trasferimento di equivalenti di riduzione

Struttura dell’eme di tipo B

• Porfina: quattro anelli pirrolici legati da ponti metinici (doppi legami)
• Protoporfirina IX: sostituenti metilici nelle posizioni 1, 3, 5, 8; vinilici in 2 e 4; propionici in 6 e 7
• Eme: Ferro chelato al centro dell’anello tetrapirrolico, stabilisce 4 legami di coordinazione planari con gli azoti degli anelli e due perpendicolari al piano: il quinto con l’istidina F8 prossimale, il sesto libero nella deossiemo/mioglobina o con l’O₂
• In prossimità dell’O₂ è presente un altro residuo di istidina E7 distale che lo costringe a legarsi al ferro con un determinato angolo di legame (120°), oltre a garantirne la reversibilità

Mentre il CO₂ lega la componente proteica, il CO compete con il sito di legame dell’O₂ (affinità 200 volte maggiore), ma quello proveniente dal catabolismo dell’eme, grazie alla presenza dell’istidina distale, (eme-ossigenasi) impegna solo l’1% dei siti ed in ogni caso il gradiente è sempre favorevole alla sua eliminazione.

Ontogenesi dell’emoglobina

• Prime settimane di vita: embrionale, fetale
• A1 (70-90%)
• A2 (2-3%)

Presente soprattutto nel globulo rosso, una piccola quota libera nel plasma derivata dall’emolisi intravasale può trovarsi nel plasma.

Fisiologicamente non oltre l’8% è emoglobina glicata, espressione della glicemia: il gradiente che permette l’ingresso del glucosio all’interno della cellula (ad eccezione della cellula della mucosa intestinale in condizioni post prandiali e del tubulo renale deputato al riassorbimento del glucosio) è sempre favorevole, ma trattandosi di una molecola osmoticamente attiva, se nonostante la sua attivazione e metabolizzazione è ancora presente glucosio in eccesso, affinché non vengano alterati gli equilibri osmotici della cellula questo viene legato all’epsilon-amminogruppo dei residui di lisina (base di schiff).

Funzioni dell’emoglobina

• Trasporto O₂ a tutti i tessuti, al muscolo ossigena la mioglobina (affinità maggiore) che trasferisce l’O₂ a livello mitocondriale dove lo trasferirà alla citocromo ossidasi (affinità massima). La quantità di O₂ rilasciato a livello tissutale è proporzionale all’attività metabolica della cellula.
• Trasporto CO₂
• Sistema tampone più potente (Emoglobina/Emoglobinati di potassio)

Curva di dissociazione dell’emoglobina

A livello del mare vi è una pressione parziale di O₂ pari a 20% di 760 mmHg = circa 150 mmHg, ma a livello degli alveoli polmonari questa si abbassa per la presenza di una quota di vapore e per il suo mescolarsi con l’aria che sarà espirata, quindi sarà di 100 mmHg, pressione alla quale la molecola di emoglobina è satura, ossia legata a quattro molecole di ossigeno.

A livello tissutale, dove la pressione parziale di O₂ si riduce a circa 20 mmHg, l’emoglobina avrà rilasciato il 75% di O₂ che aveva legato (l’Hb non perde mai tutto l’O₂ che aveva legato).

La curva di dissociazione dell’emoglobina ha un andamento sigmoidale (a S italica).

Curva di dissociazione della mioglobina

A tutti i valori di p.p. di O₂, la mioglobina è più satura di O₂ rispetto all’emoglobina, avendo per esso una maggior affinità: per questo può essere ossigenata dall’emoglobina e costituire una riserva di ossigeno per il muscolo senza cederlo agli altri tessuti. Quando l’attività muscolare sarà talmente intensa da esaurire la disponibilità di O₂ fornito dall’emoglobina, la p.p. di O₂% sarà talmente bassa da provocare il rilascio di O₂ da parte della mioglobina che così facendo impedirà, entro certi limiti, che esso lavori in condizioni di anaerobiosi.

La curva di dissociazione della mioglobina ha un andamento iperbolico.

Con p50 si indica la p.p. di O₂ alla quale il 50% dei siti totali sono legati all’ossigeno: per la mioglobina è di 1 mmHg, per l’emoglobina di 26 mmHg (26 volte meno affine).

Allosterismo dell’emoglobina

Mentre la mioglobina (non allosterica in quanto monomerica, il legame e il rilascio di O₂ dipendono esclusivamente dai livelli di p.p. di O₂) espone sempre al solvente acquoso le catene laterali degli amminoacidi polari, nell’emoglobina non sempre è così, in quanto si instaurano tra le catene α e β interazioni forti (dimeri α-β) soprattutto di tipo idrofobico, mentre tra i dimeri delle interazioni tra i residui polari e legami H molto deboli, la cui dinamica è alla base dell’allosterismo, ossia della variazione dei diametri della proteina quando ossigenata o deossigenata.

• Ossigenata: conformazione R rilasciata, più affine all’O₂, compatta
• Deossigenata: conformazione T tesa, meno affine all’O₂

L’azione cooperativa delle diverse subunità nelle loro modifiche conformazionali sarà fondamentale nel favorire l’acquisizione o il rilascio di O₂. Quando il ferro non lega l’O₂, avendo anche un raggio atomico maggiore, viene come trascinato al di sopra del piano dell’eme dall’interazione con l’istidina prossimale F8 che lo sposta di 0,6 Å. (Conf. T). Con il legame con l’O₂ a livello polmonare (dove la p.p. di O₂ è sufficientemente alta perché si leghi anche all’emoglobina in conf. T quindi poco affine) il ferro viene trasferito al centro e trascina con sé il residuo di istidina provocando una modifica nella conformazione dell’intera proteina (T → R) che ne aumenterà l’affinità nei confronti dello stesso O₂ che da ora in avanti potrà legarsi più facilmente.

Essendo la forma R più compatta rispetto alla T, ci si riferisce alle variazioni di diametro della emoglobina come il “polmone molecolare di Pauling” che, diversamente da quello anatomico, si riduce in volume all’atto dell’inspirazione.

Effettori allosterici

• Omotropici: ligandi che con la loro interazione modificano l’affinità della proteina nei propri confronti -> O₂
• Eterotropici: modificano l’affinità nei confronti di un altro ligando:
  • Acido 2-3 bifosfoglicerico: accolto, a livello tissutale, negli spazi presenti solo nell’Hb in conf. T, interagisce con le cariche positive delle catene laterali o con le code ammino-terminali degli amminoacidi delle subunità beta stabilizzando l’Hb nella conformazione T, favorendo il rilascio di O₂. Quando, a livello polmonare, viene legato l’O₂, l’acido viene rilasciato.
  • PH: a livello tissutale si sposta verso valori acidi per effetto del metabolismo cellulare che porta alla produzione di acido lattico, se in anaerobiosi, o CO₂ e H₂O, se in aerobiosi (la CO₂ passa dal tessuto al plasma e da questo al globulo rosso, ove per azione dell’anidrasi carbonica reagisce con l’H₂O formando acido carbonico H₂CO₃; questo, essendo un acido debole, si dissocia in H⁺ e ioni bicarbonato HCO₃^- che lascia il globulo rosso tramite lo scambiatore con il Cl^-): gli ioni H⁺ si legano ai residui di istidina dell’Hb che diventa Hb acida ridotta, stabilizzata nella forma T, in cui è favorito il rilascio di O₂. Una quota minore di CO₂ viene trasportata dall’Hb legandosi a gruppi -NH₂ della componente proteica (carboaminoemoglobina) e rendendola meno affine all’O₂. A livello polmonare il legame con l’O₂ provoca la liberazione degli ioni H⁺ legati alle istidine che all’interno del globulo rosso reagiscono con gli ioni carbonato (che vengono mano a mano richiamati dal plasma) riformando acido carbonico, che qui per azione della anidrasi carbonica formerà CO₂ (liberata con l’espirazione, così come la piccola quota legata alla componente proteica) e H₂O.
  • Temperatura: a livello tissutale, il rilascio di calore è proporzionale all’intensità del metabolismo cellulare: temperature più alte facilitano il rilascio di ossigeno.

Compensazione nell’emoglobina fetale

L’Hb fetale (alfa₂-gamma₂) è più affine di quella adulta (da cui del resto viene ossigenata) per l’assenza di subunità beta a cui l’acido 2-3 bifosfoglicerico possa legarsi. Il meccanismo di compensazione che garantisce al feto la disponibilità di O₂ è dato da un aumento delle emazie. Per questo motivo alla nascita è presente un ittero fisiologico dovuto all’emolisi (dalla degradazione dell’Hb si forma la bilirubina) nel contesto della graduale sostituzione dell’Hb fetale con quella adulta.

Compensazioni nell’adulto

In condizioni di ipossia tissutale, come ad alta quota, l’organismo può reagire incrementando la produzione di emazie (attivando una maggiore produzione di eritropoietina, ormone che attiva la produzione dei precursori emoblastici) e aumentando la sintesi di acido 2-3 bifosfoglicerico.

Alcuni bioelementi presenti in tracce

• Selenio: rientra nella struttura della glutatione perossidasi
• Iodio: partecipa alla sintesi degli ormoni tiroidei (Tri e tetra-iodotironina), che presentano dei residui di tirosina (di cui alcuni sostituiti con lo iodio, iodotirosina) modificati post-traduzionalmente in tionina (alcuni iodotionina), composta da due anelli benzenici che derivano dalla condensazione di due residui di tirosina
• Rame: prende parte alla struttura di alcuni complessi coinvolti della catena respiratoria

Micro-bioelementi

• Zinco
• Ferro: 3-5 g, molto reattivo (tende a legarsi ad atomi fortemente elettronegativi), presente nei due stati di ossidazione di ione ferroso (2+) e ferrico (3+). In alcune proteine a ferro eminico (come mioglobina e emoglobina) sistemi riduttivi garantiscono che sia mantenuto nella forma ferrosa così da poter legare O₂; in altre invece (citocromi coinvolti nella catena respiratoria) deve poter oscillare così da permettere il trasferimento di un equivalente di riduzione per volta tra i vari complessi e in ultimo sull’O₂, riducendolo nella cosiddetta “acqua metabolica”. Nel numero delle proteine a ferro non eminico può trovarsi legato a degli atomi di zolfo (nelle proteine Fe-S), all’O o all’N nelle proteine coinvolte nel trasporto o nella riserva di ferro
• Ossigeno: alcune reazioni che lo vedono coinvolto sono l’idrossilazione post-sintetica di alcuni amminoacidi (idrossilisina, idrossiprolina), l’idrossilazione di fenilalanina in tirosina o la rottura del legame ad es. tra due atomi di carbonio (come la triptofano pirrolasi) grazie ad enzimi che contengono ferro nella loro struttura (rispettivamente monossigenasi a funz. mista NADPH dip e diossigenasi)

Biochimica del ferro

È rappresentata da un ciclo chiuso in cui viene recuperato quasi tutto il ferro che deriva dalla degradazione delle proteine che lo contengono (piccola quantità persa per via della desquamazione delle cellule epiteliali: maschio 1 mg/die; donna 2-2,5 mg/die, da reintegrare con l’alimentazione). Dopo aver attraversato le membrane cellulari nella forma ferrosa, per la sua elevata reattività e la sua importanza si trova, nella forma ossidata di ione ferrico, legato a molecole ad elevato PM, cosicché non superi il filtro renale:

• Transferrina (Tf): responsabile del trasporto di Fe (fino a un max di 2 ioni ferrici: apoTf nessuno, Tf monoferrica, Tf diferrica), per il cui legame necessita dell’interazione dello ione bicarbonato HCO₃^-. Tutte le cellule, ad eccezione dei globuli rossi maturi, ne presentano recettori (in numero proporzionale alle esigenze) a maggiore affinità per quella biferrica e la internalizzano mediante endocitosi mediata da recettore; raggiunto l’ambiente acido lisosomiale, esso provocherà la riduzione e il distacco del ferro nella forma ferrosa che sarà o conservato nella molecola della ferritina (se presente) o reso disponibile per i processi di sintesi;
• Ferritina, (o apo- quando non lega ferro) proteina di riserva, presente solo a livello di determinati citotipi (fegato, milza, midollo) ma che può ritrovarsi in piccole quantità nel plasma come espressione del loro rinnovo; è costituita da 24 subunità di tipo L e di tipo H variamente combinate a dare diverse isoforme, tutte con la funzione di costituire un guscio proteico all’interno del quale possono essere conservati 4.000-4.500 ioni ferrici sotto forma di cristalli di ferroidrossidofosfato;
• Aptoglobina, di norma presente all’interno dei globuli rossi ma in piccole quantità può trovarsi nel plasma come espressione dell’emolisi intravasale fisiologica o meno (anemie emolitiche enzimopeniche): si lega agli amminoacidi presenti all’interfaccia di due dimeri alfa-beta derivati dalla scissione della molecola dell’Hb ossigenata quando questa si trova libera nel plasma impedendo loro di oltrepassare il filtro renale e trasferendoli nei distretti eritrocateretici ove il ferro recuperato potrà essere conservato o immesso in circolo previo legame con la transferrina.

Il ferro introdotto con gli alimenti può essere ferro non biodisponibile, legato cioè a molecole da cui non può staccarsi: pertanto non può essere assorbito e viene eliminato attraverso l’emuntorio intestinale. Quello contenuto in proteine a ferro eminico è biodisponibile: l’eme viene catabolizzato all’interno delle cellule della mucosa intestinale e il ferro viene liberato. La biodisponibilità del ferro non eminico è invece relativa e dipende dalle strutture alle quali è ancorato. L’assorbimento può essere impedito dalla presenza di ferrochelanti (che è possibile utilizzare a scopo terapeutico in presenza di emocromatosi o emosiderosi) o favorito dalla presenza di agenti riducenti (pH acido). L’ambiente acido dello stomaco favorisce la dissociazione degli ioni nella forma ferrosa che nel primo tratto del duodeno potranno attraversare la membrana luminale delle cellule della mucosa intestinale (attraverso un canale idrofilico per i cationi bivalenti): all’interno delle cellule è presente la molecola di ferritina (o apo-) a cui si legano fino a 4.500 ioni ferrici che resteranno “catturati” (“blocco della mucosa”) fino a quando sarà richiesta la quantità di ferro necessaria alle esigenze di ciascun tipo cellulare, allo scopo di rimpiazzare la quota persa attraverso gli emuntori. Considerando che il ferro assorbito fisiologicamente equivale al 10% (in condizioni di anemie, emolisi importanti o emorragie può arrivare a 20-30%) di quello introdotto, occorre reintrodurre 10 (uomo) o 20 (donna) mg di ferro al giorno. L’emivita delle cellule della mucosa intestinale è di 8-10 giorni, quindi una percentuale di ferritina quasi satura verrà eliminata attraverso l’emuntorio intestinale; in presenza di una buona disponibilità di ferro viene incrementata la sintesi di ferritina e inibita la sintesi e l’esternalizzazione di recettori per la transferrina, mentre in carenza di ferro viene inibita la sintesi di ferritina e incrementata la sintesi e l’esternalizzazione dei recettori per la transferrina. Il passaggio attraverso la membrana contro-luminale della cellula della mucosa intestinale e delle cellule che presentano una riserva di ferro è mediato dalla proteina ferroportina a cui è legata la efestina ad attività ferrossidasica; nel plasma la stessa funzione è svolta dalla proteina ceruloplasmina, contenente rame, che ossidando il ferro consente il suo legame alla molecola di transferrina. La disponibilità di riserve di ferro è segnalata dal fegato che, in tal caso, elabora l’ormone epcidina: questa raggiunge il distretto intestinale e legandosi alla ferroportina determina l’internalizzazione del complesso, cosicché altro ferro non oltrepassi.