Biochimica generale e alimentare - prof. Bonomi e Iametti

CASEINE?

PER QUALI RAGINI MOLECOLARI ALCUNI GEL SONO REVERSIBILI E ALTRI NO?

COME POSSIAMO SOLUBILIZZARE LE PROTEINE IN UN UOVO SODO?

QUALI INTERAZIONI TRA SEIROPROTEINE SONO ALLA BASE DELLA RICOTTA?

COSA FAREMO IN ESERCITAZIONE:

Utilizzo di enzimi con finalità analitiche

Uso un enzima per determinare un composto presente in un alimento. Per esempio determinare quanto

lattosio è presente in un alimento. Due metodi:

1. Uso un enzima il quale si aggiunge nella matrice e trasforma il lattosio in un altro composto che io

misuro. L’enzima in una matrice con altri composti è specifico e va a trasformare solo il suo substrato.

2.

Sono tutte misure End-Point ovvero con la totale trasformazione del composto che mi interessa. Tutto il

substrato trasformato.

Devo allestire un saggio in cui io sono sicuro che l’enzima trasforma tutti i composti in qualcosa di

quantificabile. 15

Quaderno di Alessandro Magro

Reazione semplice:

Il composto A diventa B e il B è quantificabile. Tanto B si forma e tanto A era in partenza. Si quantifica

quando sono sicuro che tutto A è diventato B. Quantificabile vuol dire per esempio la formazione di un

composto colorato.

Reazione accoppiata:

L’enzima trasforma A in B ma B non è quantificabile. Si fa la reazione accoppiata, il composto B viene

trasformato in un composto C con un enzima ausiliario. Tale enzima trasforma tutto il B in un composto

colorato che posso quantificare. La seconda fase non è limitante, devo avere molto enzima ausiliario e tutto

B deve diventare subito C senza alcuna limitazione cinetica.

Fondamenti cinetici sui saggi:

A+B —> C+D

<—

La K eq= concentrazione dei prodotti

———————————

Concentrazione substrati

In tali saggi l’enzima scelto deve formare una specie che sia facilmente quantificabile, quindi che assorba la

luce nel visibile o nell’ultravioletto. La reazione deve arrivare completamente all’equilibrio. L’equilibrio

chimico deve essere spostato completamente verso i prodotti. Cio vuol dire che la quantità di substrato del

prodotto che deve quantificare deve essere trascurabile.

esempi:

Distinguiamo i vari saggi in determinazioni che misurano un solo composto oppure che contemporaneamente

più composti.

- Reazione semplice

- Reazioni accoppiate

Determinazione di più composti.

Più enzimi che lavorano in opportuna sequenza.

Caso 1: determinazione singolo composto con una reazione semplice

Determinare glutammato in un alimento (dado da brodo)

Si fa un saggio enzimatico, utilizza una reazione di de-amminazione con la glutammato deiidrogenasi che

trasforma glutammato in alfa chetoglutarato più ammoniaca. Se il glutammato si ossida è il NAD+ che si

riduce a NADH. Dunque NADH è NAD ridotto che fa parte dei prodotti, quanto? Quante sono le moli di

glutammato trasformate in alfa chetoglutarato.

Quando faccio il saggio dunque avrò:

• NAD ossidato in grande quantità

Enzima

• Aggiungo a tale miscela il dado diluito

• opportunamente

All’equilibrio avrò la K di equilibrio, devo essere sicuro che tutto il glutammato sia trasformato nei prodotti.

IL NAD RIDOTTO è IL COMPOSTO CHE POSSO QUANTIFICARE! Con il rapporto tra il prodotto

di concentrazione dei prodotti e dei reagenti. A equilibrio tutto il glutammato deve diventare alfa

chetoglutararto e NADH. Il NAD ridotto lo posso quantificare perche NAD ridotto e ossidato hanno diversa

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Quaderno di Alessandro Magro

assorbanza. Nad ridotto assorbe a 340 nano metri. Il NAD ossidato non assorbe. Stessa proprietà vale per

NADP e NADPH.

Alcuni enzimi funzionano con NAD e altri con NADP, anabolismo e catabolismo.

Con questo sistema posso dosare il glutammato.

La stessa reazione posso usarla per determinare l’ammoniaca.

Voglio trovare l’ammoniaca, parametro per freschezza delle uova o del pesce.

Uso la stessa reazione ma in condizioni diverse, alfa-

cheto+ammoniaca —> glutammato

Misuro la scomparsa di Nad ridotto (NADH).

Prima misuravo la formazione e ora misuro la scomparsa. In tal caso ho un decremento di assorbanza.

Nella maggior parte delle reazioni non è sempre possibile avere qualcosa che si forma subito, ma devo usare

l’enzima ausiliario che trasforma il primo prodotto in qualcosa che può essere misurato.

In questo caso ho un decremento di assorbanza.

Come sposto l’equilibrio? Aggiungo un enzima ausiliario che trasforma B in C e sposto l’equilibrio. In

questo modo ho due aspetti.

1. Si trasforma subito B in C

2. Usato perche il composto C è l’unico colorato.

Nella scelta di enzima ausiliario devo fare in modo che abbia la seconda reazione spostato equilibrio tutto

verso formazione di C (B—>C).

Mi interessa A, un enzima trasforma A in B ma non in condizioni fattibili a trasformarlo tutto allora uso

l’ausiliario in cui la conversione di B in C sia spostata tutta verso la conversione di B in C e cosi facilito la

conversione A—>B perche ho spinto equilibrio.

Il dosaggio di etanolo negli alimenti è importante:

Lo si dosa nei prodotti da forno in cui si passa sulla pellicola o su di essi l’etanolo. Delle fasce di

popolazione per alcuni motivi non vogliono etanolo! È un problema serio, perche la tendenza a formare una

muffa superficiale è elevata.

Per dosare l’etanolo uso un saggio enzimatico di tipo accoppiato.

Trasformo etanolo in acetaldeide con alcool deiidrogenasi riducendo NAD in NADH. Questo enzima ha

reazione spostata verso destra soltanto a pH alcalino o con trasformazione ulteriore dell’acetaldeide

(sottrazione del prodotto).

Accoppio la reazione precedente a quella che è ossidazione di acetaldeide che viene ossidata in acido acetico

con enzima aldeide de-idrogenasi, reazione di ossidazione ed enzima usa come imposto riducente il NAD

che diventa NADH.

Questa reazione è fortemente spostata verso destra, non è limitante. L’acetaldeide viene dunque convertita

subito in acido acetico.

Le moli di NADH che determino alla fine sono il doppio di quelle di etanolo quindi per avere il dato

dell’etanolo devo dividere a meta le moli di NADH che misuro alla fine delle reazioni. 17

Quaderno di Alessandro Magro

DETERMINAZIONE DEL GLUCOSIO

Per esempio nei succhi senza zuccheri aggiunti è un analisi applicata. Utilizzo un saggio accoppiato. Il

glucosio può essere convertito in qualcosa che misuro (NADH).

Glucosio si ossida a 6-fosfo-gluconato solo se è fosforilato.

Con l’enzima esochinasi prendo glucosio e lo fosforilo a

Glucosio6P e poi la G6Pdeiidrogenasi lo trasforma in 6-

fosfo-gluconato.

Si produce NADH nella seconda reazione che si va a

misurare e avviene l’idrolisi di una molecola di ATP nella

prima reazione.

Se si vuole effettuare una misurazione mediante colorimetro

e non spettrofotometro si usa un terzo enzima che prende il

NADH per ridurre un composto che una volta ridotto cambia

colore.

In alcuni alimenti vogliamo determinare tutti gli zuccheri

semplici come glucosio e fruttosio senza fare due saggi. È possibile farlo modificando leggermente le

operazioni, si fa il dosaggio contemporaneo di glucosio e fruttosio usando gli stessi reattivi. Questo saggio

utilizza tre enzimi.

Prima si utilizza l’esochinasi e la glucosio 6 fosfo-deidrogenasi e si aspetta finche il NADH che si forma,

quindi l’assorbanza a 340 nm raggiunge la stabilità. In queste condizioni l’esochinasi trasforma tutto il

glucosio in G6P e poi in 6Pgluconato e NADH. L’esochinasi è in grado anche di fosforilare il fruttosio,

fosforila il glucosio e anche il fruttosio.

L’enzima che utilizza il NAD usa solo il G6P, formato da esochinasi.

Quando ho raggiunto equilibrio di NADH aggiungo una fosfato isomerasi che converte il fruttosio 6 fosfato

in glucosio 6 fosfato e riparte la riduzione del NAD. Il salto di assorbanza è le moli di fruttosio presente.

Se faccio la reazione e non ho aumento di NADH, assorbanza a 340, vuol dire che nel mio prodotto non

avevo fruttosio. Il saggio usa quindi gli stessi reattivi giocando sull’aggiunta dell’isomerasi dopo che è stato

quantificato il glucosio.

Se voglio cercare il saccarosio?

Se aggiungo zuccheri aggiungo il saccarosio che costa di meno.

In questo saggio ho un pretrattamento con l’enzima che scinde il saccarosio in glucosio e fruttosio tramite

l’invertasi. A questo punto ho sempre l’esochinasi che fosforila il glucosio e il fruttosio, ma in questo caso

non avrò l’enzima isomerasi e di conseguenza la mia attenzione sarà sul glucosio 6 fosfato. Tante moli di

glucosio e tanti moli di saccarosio.

Siccome tale saggio si basa sul glucosio 6 fosfato, devo sapere se ce del glucosio di partenza che potrebbe

determinare ulteriore formazione di G6P. 18

Quaderno di Alessandro Magro

DOSAGGIO DEL LATTOSIO:

Il lattosio è un disaccaride formato da

glucosio e galattosio. Per prima cosa

metto la glattosidasi che scinde il

lattosio nelle sue due componenti.

Il glucosio liberato viene fosforilato e

dopodiché ossidato con riduzione del

NADP, le moli di NADPH sono le moli

di glucosio e quindi le moli di lattosio.

Il vantaggio è che non ci interessa nulla

di tutti gli altri composti presenti in un

composto lattiero-caseario.

Biochimica alimentare lezione 5 12/03

Quali son i tipi di interazioni che possono stabilizzare un gel formato da caseine

Interazione di proteine con aromi e polifenoli

Vediamo come possiamo sfruttare alcune proprietà delle proteine per interagire con altri alimenti:

Come la struttura di una proteina può regolare in una matrice complessa l’interazione tra composti piccoli

non di natura proteica come gli aromi o i polifenoli.

Con questi composti abbiamo interazioni principalmente di tipo idrofobico e avvengono sulla superficie. Le

proteine in base alla loro struttura hanno delle zone idrofobiche esposte al solvente e su queste regioni

idrofobiche si possono associare e possono interagire molecole idrofobiche come gli aromi.

Si usa una proteine per stabilizzare un aroma, che di per se è una sostanza volatile, che non permane a lungo

nella conservazione dell’alimenti. Le proteine mi permettono di trattenerli il più possibile.

Devo fare in modo che la perdita sia il più contenuta possibile. L’aroma definisce importanti caratteristiche

del gusto. Per tale motivo ci sono spesso proteine aggiunte in piccola quantità per permettere la permanenza

degli aromi.

Le proteine vengono aggiunte perche si sfrutta la loro organizzazione strutturale facendo in modo che sia

compatibile con trattenere certi aromi. Non vanno bene tutte le proteine.

Le proteine che vanno meglio sono quelle che hann