Biochimica funzionale

Biochimica funzionale

Biochimica cellulare

Introduzione

Ogni cellula possiede meccanismi molecolari che le consentono di interagire con l’ambiente esterno e ciò avviene grazie ai processi di trasduzione dei segnali. La membrana cellulare è la parte di cellula in contatto con l’ambiente esterno e agenti extracellulari che entrano in contatto con la membrana possono modificarne le funzioni: questi sono le molecole segnale, che possono essere di natura chimica o di natura fisica.

Affinché la cellula sia in grado di rispondere a questi agenti è necessario che sia provvista del recettore specifico per l’agente in questione, che può essere localizzato sulla superficie cellulare o all’interno della cellula, nel citoplasma o nel nucleo.

Recettori cellulari

I ligandi esterni agiscono sui recettori per attivare un processo di trasduzione all’interno della cellula, spesso con produzione di un secondo messaggero, che a sua volta dà inizio a una serie di reazioni con produzione dell’effetto metabolico finale.

I recettori implicati nei processi di trasduzione sono di tre tipi fondamentali:

• Recettori a 7 segmenti transmembrana: sono caratterizzati da 7 segmenti ad elica che passano attraverso la membrana plasmatica, un sito di riconoscimento del ligando esposto verso lo spazio extracellulare e un sito di riconoscimento per la proteina G posto nel lato citosolico della membrana.
• Recettori ad un unico segmento transmembrana: possiedono due domini globulari esposti, uno sulla faccia esterna della membrana che contiene il sito di riconoscimento del ligando e uno sulla faccia interna della membrana che contiene il sito catalitico.
• Recettori operanti come canali ionici: sono formati da più subunità, ciascuna contenente diversi segmenti transmembrana e legano ligandi di natura fisica o neurotrasmettitori.

I ligandi con recettori citoplasmatici o nucleari devono penetrare nella cellula e il loro passaggio attraverso la membrana avviene generalmente per trasporto facilitato; una cellula diventa quindi il bersaglio di questi ligandi se nella membrana plasmatica è presente il carrier che consente al ligando di penetrare nella cellula.

I recettori citoplasmatici e nucleari sono usati soprattutto dagli ormoni idrofobici, come ormoni tiroidei, ormoni steroidei e derivati ormonali della vitamina A.

Trasduzione attraverso la membrana con secondi messaggeri

AMP ciclico (cAMP)

Il cAMP si forma a partire dall’ATP per azione dell’adenilato ciclasi, un enzima di membrana la cui attività è dipendente dalla formazione del complesso ligando-recettore; fra i ligandi che stimolano la formazione di cAMP si ritrovano adrenalina, glucagone e farmaci i quali legano in modo specifico i recettori b-adrenergici.

Quando la concentrazione del ligando esterno diminuisce, i recettori si svuotano e il meccanismo di attivazione dell’adenilato ciclasi si disinnesca, mentre il cAMP presente nella cellula viene inattivato per rottura del legame ciclico dalla cAMP fosfodiesterasi. L’attività di quest’ultimo enzima è inibita dalle metilxantine che prevengono l’idrolisi del cAMP e potenziano l’azione dei ligandi che usano il cAMP come secondo messaggero.

Regolazione dell’adenilato ciclasi

I recettori che agiscono tramite cAMP non hanno contatti diretti con l’adenilato ciclasi, ma la trasmissione del segnale dal recettore all’enzima è mediata da particolari proteine G trimeriche (αβγ) inserite nel foglietto interno della membrana e formate da 3 subunità: una subunità che possiede attività GTP-asica ed è in grado di legare GDP o GTP, una subunità β e una subunità γ. La subunità α può avere effetto stimolatorio (α_s) o inibitorio (α_i) a seconda del recettore a cui le proteine G sono funzionalmente collegate.

A riposo, il recettore è associato con la sua porzione citosolica alla proteina G trimerica, la cui subunità α è legata al GDP; a seguito del legame con il ligando, il recettore subisce una modifica che coinvolge la subunità α, la quale acquisisce una maggiore affinità per il GTP, che vi si lega scalzando il GDP. A seguito del legame con il GTP, la subunità α esercita la sua attività GTP-asica e trasforma il GTP in GDP, riformando la subunità α-GDP che si sgancia dall’adenilato ciclasi e si riaggrega alle subunità β e γ.

Sono note due situazioni patologiche, provocate da due tossine batteriche, in cui è alterato il controllo dell’adenilato ciclasi:

• Tossina colerica: è una proteina formata da una subunità A e 5 subunità B; la subunità A esercita la sua attività bloccando l’attività GTP-asica della subunità α della proteina G, con conseguente attivazione prolungata dell’adenilato ciclasi e aumento della concentrazione intracellulare di cAMP. Questo provoca abbondante secrezione di liquidi che vengono espulsi con continue scariche diarroiche.
• Tossina della pertosse: esercita un’azione simile azzerando il meccanismo di inibizione dell’adenilato ciclasi, con il risultato di prolungare lo stato di attivazione dell’enzima.

Azione del cAMP

L’azione principale del cAMP consiste nell’attivazione di proteine chinasi (PKA) che usano l’ATP per fosforilare determinate proteine e modularne l’attività; allo stato inattivo, una PKA è formata da 2 subunità catalitiche (C) e 2 subunità regolatorie (R). Il cAMP si lega alle subunità R, liberando le subunità C che possono essere quindi attivate.

Alcune PKA sono a sede nucleare e intervengono nei processi di trascrizione di specifici geni bersaglio che contengono una sequenza regolatoria CRE; quando la PKA attiva entra nel nucleo, fosforila il fattore di trascrizione CREB che lega la sequenza CRE e attiva la trascrizione del gene.

Il cAMP può anche interagire con i canali per il calcio della membrana plasmatica, determinandone l’apertura, con conseguente aumento della concentrazione citoplasmatica di calcio.

GMP ciclico (cGMP) e ossido nitrico (NO)

Analogamente al cAMP, il cGMP si forma per azione della guanilato ciclasi e viene trasformato in GMP dalla cGMP fosfodiesterasi. La guanilato ciclasi è presente nella cellula in diverse forme, con differenti sedi cellulari. La guanilato ciclasi della membrana plasmatica è un recettore ad attività enzimatica con un unico segmento transmembrana ed è stimolata dal peptide atriale natriuretico (ANP), dalle enterotossine di E. coli e dai peptidi prodotti dagli ovociti dei mammiferi.

Il legame di questi peptidi al recettore provoca una modifica conformazionale che attiva la porzione intracellulare dell’enzima con formazione del cGMP, il quale a sua volta determina l’attivazione delle proteine chinasi (PKG).

Il cGMP ha un ruolo nel processo di foto-trasduzione operato dai coni e dai bastoncelli della retina ed è quindi responsabile del meccanismo della visione. In queste cellule la guanilato ciclasi è costantemente attiva, determinando elevate concentrazioni cellulari di cGMP, che mantengono aperti i canali del sodio, con conseguente stato di ipopolarizzazione della membrana.

Lo stimolo luminoso provoca l’attivazione della cGMP fosfodiesterasi e la concentrazione di cGMP diminuisce, i canali del sodio di chiudono e si instaura uno stato di iperpolarizzazione della membrana che trasmette l’impulso nervoso.

Esiste anche una guanilato ciclasi citosolubile e inducibile, la quale funziona come recettore per l’ossido nitrico (NO); questa forma dell’enzima contiene un gruppo prostetico eme, il cui atomo di ferro (Fe²⁺) lega il NO che attiva l’enzima. Il cGMP così formato è coinvolto in numerosi processi cellulari, alcuni dei quali mediati da chinasi cGMP-dipendenti.

Il NO funziona anche come neurotrasmettitore o come secondo messaggero nelle cellule endoteliali, dove agisce provocando il rilasciamento della muscolatura liscia, ma anche nei macrofagi, dove promuove la loro funzione battericida e tumoricida.

Il NO viene prodotto a partire dall’arginina per azione della NO sintasi (NOS), un enzima che nelle cellule endoteliali è attivato dagli ioni calcio. Il NO si diffonde rapidamente e agisce quindi non solo sulla cellula che l’ha prodotto, ma anche sulle cellule adiacenti.

Inositolofosfati e diacilglicerolo

Metabolismo

Il fosfatidilinositolo-4,5-bifosfato (PIP₂) viene idrolizzato da una fosfolipasi C posta sul versante citoplasmatico della membrana in inositolo-1,4,5-trifosfato (IP₃) e diacilglicerolo (DAG), entrambi con funzione di secondi messaggeri: in seguito all’idrolisi, il DAG rimane ancorato al foglietto della membrana plasmatica e può essere riciclato, mentre il IP₃ si libera nel citosol.

IP₃ può andare incontro a due diversi destini: può essere fosforilato da una chinasi con formazione di inositolo-1,3,4,5-tetrafosfato (IP₄), sempre con azione di secondo messaggero, oppure può essere defosforilato da una fosfatasi con produzione di inositolo-bifosfato, inositolo-monofosfato e infine inositolo che viene riciclato. Le inositolo-fosfato fosfatasi sono inibite dal litio, con conseguente accumulo degli inositoli-fosforilati.

Attivazione delle fosfolipasi C

La fosfolipasi Cβ è collegata funzionalmente ai recettori a 7 segmenti transmembrana associati a proteine G trimeriche particolari (dette proteine G_q), formate dalle subunità α, β e γ, di cui α e γ sono inserite nel foglietto citoplasmatico della membrana; quando il recettore è a riposo, le tre subunità della proteina G_q sono associate fra loro e la subunità α è legata al GDP. L’interazione con il ligando induce una modifica conformazionale del recettore che si trasmette alla proteina G_q, con conseguente aumento dell’affinità della subunità α per il GTP, che vi si lega scalzando il GDP.

Si forma quindi la subunità α-GTP, che si dissocia dal complesso G_q e va ad attivare la fosfolipasi Cβ. Allo stesso tempo però, la subunità α che possiede attività GTP-asica, idrolizza il GTP in GDP, riformando la subunità α-GDP che perde l’azione attivatoria nei confronti della fosfolipasi e si riassocia al complesso della proteina G_q.

La fosfolipasi Cγ è collegata a recettori ad attività catalitica di tipo tirosina-chinasico: in seguito al legame con specifici ligandi, il recettore si autofosforila in corrispondenza di residui di tirosina e poi fosforila la fosfolipasi Cγ, attivandola. L’interazione funzionale fra il recettore e la fosfolipasi Cγ è mediata da un dominio presente nella fosfolipasi stessa e detto SH2, che riconosce la tirosina fosforilata. Il ritorno allo stato inattivo è operato da una proteina-tirosina fosfatasi associata al recettore, che idrolizza il legame fosfoestereo.

Proteina chinasi C (PKC)

IP₃ agisce sui canali per il calcio posti sulla faccia citoplasmatica del reticolo endoplasmatico, provocandone l’apertura: di conseguenza la concentrazione di calcio all’interno della cellula aumenta e vengono attivati i sistemi calcio-dipendenti, uno dei quali è la proteina chinasi C.

La PKC contiene 4 domini distinti, leganti il diacilglicerolo (C1), il calcio (C2), l’ATP (C3) e la proteina substrato (C4). A bassi livelli di calcio e in assenza di DAG nella membrana plasmatica, la PCK è inattiva e si trova in soluzione nel citoplasma: in queste condizioni i domini C1 (legante il DAG) e C4 (legante il substrato) interagiscono fra loro e bloccano l’enzima.

Con la formazione invece di IP₃ e DAG, con conseguente aumento di calcio all’interno della cellula dovuto all’azione di IP₃, i domini C1 e C4 si staccano e la porzione idrofobica del dominio C1 si inserisce nella membrana, mentre il calcio facilita l’interazione del dominio C2 con le teste polari della fosfatidilserina e il C4 si lega alla proteina substrato. L’enzima diventa quindi attivo e fosforila le proteine bersaglio in corrispondenza dei residui di serina e treonina.

La chiusura dei canali per il calcio e il riciclo metabolico del DAG ripristinano le condizioni per il ritorno della PKC allo stato solubile inattivo.

Ioni Ca²⁺

Variazione della concentrazione di calcio

Numerose proteine intracellulari sono Ca²⁺-dipendenti, quindi esercitano la loro azione solo nella forma legata al Ca²⁺. In condizioni di riposo, la concentrazione di Ca²⁺ nel citoplasma è di 10^-7 M e il mantenimento di questi bassi livelli è assicurato dalle pompe per il Ca²⁺, la cui attività richiede energia:

• La pompa ATPasi-Ca²⁺ dipendente e l’antiporto Ca²⁺/H⁺, entrambi posti sulla membrana plasmatica, estrudono gli ioni Ca²⁺ all’esterno della cellula.
• La pompa Ca²⁺ del reticolo endoplasmatico, ATP-dipendente, accumula gli ioni Ca²⁺ all’interno del reticolo endoplasmatico o in particolari compartimenti detti calciosomi.
• L’antiporto Ca²⁺/H⁺ posto sulla membrana mitocondriale interna accentra Ca²⁺ nella matrice mitocondriale ed estrude H⁺, traendo l’energia per il funzionamento dal gradiente protonico prodotto dalla catena respiratoria.

Tutti questi sistemi di pompe operano in modo continuo e grazie a queste pompe si stabilisce un gradiente di concentrazione di Ca²⁺ molto elevato fra il citosol e l’ambiente extracellulare, intrareticolare e intramitocondriale.

Apertura controllata dei canali del calcio

L’apertura dei canali per il calcio localizzati sulla membrana del reticolo endoplasmatico e dei calciosomi è mediata da IP₃ prodotto dall’idrolisi dei fosfoinositidi; IP₃ si lega ai recettori inducendo una modifica conformazionale che viene trasmessa al canale adiacente, che si apre e permette il passaggio degli ioni Ca²⁺. IP₃ viene poi fosforilato a IP₄ che si lega ai canali presenti sulla membrana plasmatica, provocandone l’apertura; i canali posti sulla membrana plasmatica possono essere aperti anche per azione di cAMP. Sia cAMP, che IP₃ e IP₄ hanno un’emivita molto breve, per cui i canali si richiudono rapidamente e le pompe provvedono a riportare il calcio al di fuori della cellula o all’interno dei calciosomi e la concentrazione citoplasmatica di calcio torna ai livelli basali.

Nelle cellule che possiedono membrane eccitabili sono presenti canali per il Ca²⁺ potenziale-dipendenti che si aprono in seguito all’eccitamento della membrana.

Azione degli ioni calcio

L’azione degli ioni Ca²⁺ consiste nell’attivazione di numerose proteine funzionali, come la PKC e la troponina; alcune proteine inoltre, nella forma legata al calcio, attivano a loro volta proteine funzionali.

Un gruppo di proteine modulate da Ca²⁺ comprende la parvalbumina, la calmodulina e la troponina C: queste hanno in comune la presenza di due segmenti ad elica collegati fra loro da un’ansa e questa struttura prende il nome di EF-mano destra.

Questa struttura EF-mano destra si modifica in seguito al legame con gli ioni Ca²⁺ e assume la conformazione idonea per il legame con le proteine bersaglio che possiedono un segmento ad elica (detto Baa) che interagisce con la struttura EF-mano destra.

Fra le proteine leganti il Ca²⁺, con altissima affinità, si ritrova la calmodulina (CaM); il legame del Ca²⁺ alla CaM accentua la percentuale di α-elicizzazione della molecola e questa modifica conformazionale conferisce alla calmodulina una maggiore affinità per gli enzimi o le proteine con cui interagisce; la calmodulina non legata al calcio è invece priva della capacità di attivare enzimi o proteine. La CaM si comporta quindi come subunità regolatoria.

Le proteine CaM-dipendenti sono numerose e fra queste si ritrova la ATP-asi Ca²⁺-dipendente della membrana plasmatica e la glicogeno-fosforilasi b chinasi del muscolo.

Secondi messaggeri derivanti da idrolisi di fosfatidilcolina

La fosfatidilcolina, per azione delle fosfolipasi di membrana A₂, C e D, genera composti con funzione di secondi messaggeri o precursori dei secondi messaggeri:

• L’acido arachidonico viene liberato per azione della fosfolipasi A₂ ed è il precursore delle prostaglandine, delle prostacicline e dei leucotrieni.
• Il diacilglicerolo viene liberato per azione della fosfolipasi C, diversa da quella che opera sui fosfatidilinositoli.
• L’acido fosfatidico viene liberato per azione della fosfolipasi D ed ha diverse azioni, fra cui l’attivazione dei canali per il Ca²⁺ della membrana plasmatica, l’inibizione dell’adenilato ciclasi e l’attivazione della fosfolipasi C attiva sui fosfoinositidi.

Secondi messaggeri derivanti da idrolisi di sfingolipidi

La degradazione degli sfingolipidi può essere innescata da ligandi come citochine, fattori di crescita e ormoni, con produzione di composti di natura sfingoide che agiscono come secondi messaggeri, fra cui ceramide, ceramide-1-fosfato, sfingosina e sfingosina-1-fosfato.

In particolare la sfingosina-1-fosfato può anche funzionare come messaggero extracellulare, interagendo con i recettori di membrana a 7 eliche transmembrana accoppiati a proteine G. Attraverso questi recettori, la sfingosina-1-P stimola la migrazione delle cellule endoteliali e delle cellule muscolari lisce dei vasi sanguigni, producendo un effetto angiogenico.

Su stimolazione di ligandi bioattivi, come vitamina D₃, IL-1 o TNF, nelle cellule bersaglio viene attivata la sfingomielinasi di membrana con produzione del ceramide che a sua volta attiva una specifica proteina chinasi o proteina fosfatasi. Questi enzimi innescano a loro volta una catena di reazioni di fosforilazione/defosforilazione che coinvolgono anche proteine nucleari: si ha quindi il blocco della proliferazione cellulare e l’innesco del processo di differenziazione o di morte programmata.

Trasduzione di segnali non mediata da secondi messaggeri

Recettori con attività tirosina-chinasica

In alcuni processi di trasduzione, la