Biochimica strutturale e funzionale

Lavoro pre-print

Le informazioni derivano solo dalle pubblicazioni sulle riviste scientifiche, e anche queste vanno osservate con pensiero critico. Anche le riviste scientifiche internazionali non sono tutte uguali: ognuna di esse ha un numerino "impact factor" che può andare da 0,01 a 9.0, proporzionali in base al numero di volte in cui sono stati citati e letti questi articoli sulla rivista da altri scienziati.

Impact factor

Se io ho una pubblicazione su una rivista ad alto impact factor, che significa? Leggi solo riviste con impact factor superiore a 1.5. Quanto più alto è, tanto più è stato selettivo il controllo scientifico.

Processo di revisione scientifica

Un lavoro scientifico si basa su dati sperimentali: devo avere un’ipotesi, un planning, fare esperimenti ed analizzare i dati. I dati devono avere una certa significabilità nel numero di repliche (statistica). Alla fine, un lavoro scientifico in una rivista internazionale si inseriscono prima i risultati, discussioni, materiali e metodi, introduzione (contestualizza il lavoro) e poi l’abstract (sommario del lavoro). A quel punto il responsabile del lavoro scientifico sa in qualche modo il "peso" scientifico di quel lavoro e invia il lavoro all’editor della rivista ad alto impact factor.

L’editor riceve il lavoro, lo legge e può approvarlo o meno (magari non lo prende in considerazione se sbagli il planning sperimentale; oppure il lavoro può piacere però alcuni revisori anonimi ("peer reviewers") devono revisionarlo). Revisione tra pari: per esempio, un lavoro sul vaccino deve essere letto da virologi che fanno lo stesso mestiere ma di cui io non conosco il nome e nemmeno il revisore conosce l’autore. Il revisore valuta il lavoro.

• Il revisore può dire "sì, hai spiegato quasi tutto ma manca questo esperimento x" e quindi devi fare esperimenti aggiuntivi.
• Può capitare poi invece che va rivisto nelle conclusioni o nella statistica senza rifare l’esperimento.

PubMed è utile per cercare i lavori online. Questo è un processo lento di accettazione del lavoro.

Scienza e disinformazione

Nella fase COVID, un gruppo di scienziati ha detto "per accelerare la conoscenza e diffusione dei dati creiamo delle riviste che lavorino in PRE PRINT: prima di quel processo di validazione". Da un lato ha velocizzato la diffusione della conoscenza di questo virus sconosciuto, ma dall’altro ha aumentato notevolmente il "rumore".

Se vi fermate alla valutazione dei lavori scientifici già vedrete che non è così semplice avere una visione completa del "nuovo coronavirus"; se invece ci basiamo sull’opinione di un clinico che parla con la D'Urso siamo proprio nella disinformazione.

L’informazione scientifica non può e non deve viaggiare su Internet, televisione o messaggistica. Se io consulto poi un sito Facebook del Ministero della Salute il discorso è diverso: ha già dei filtri, prende le informazioni da riviste scientifiche internazionali; poi però l’informazione scientifica dettagliata me la devo fare con gli articoli scientifici.

Le riviste pre-print non sono del tutto inaffidabili, ma quell’articolo pubblicato in pre-print può avere un successivo articolo che lo contraddice, non hanno avuto un vaglio lento dal punto di vista scientifico. L’analisi critica dei lavori è un aspetto fondamentale. Ricorda: una rondine non fa primavera, che vuol dire? Posso citare un articolo anche su Nature che è passato su tutti i filtri e quindi il lavoro era fatto bene, però poi altri laboratori indipendenti nel mondo non hanno mai confermato la stessa cosa. Ci sono tantissimi casi.

Conferma scientifica

Quindi bene quando invece tu pubblichi il lavoro e hai il tuo competitor americano che non solo conferma quello che dici tu, ma va avanti su quella direzione. Questo è l’aspetto fondamentale della scienza, ed è un processo molto lento.

Anche lo sviluppo dei vaccini ha avuto un processo di validazione: a prescindere dall’efficacia dei tre vaccini disponibili in termini di proteine, ma tutti e 3 proteggono dall’ospedalizzazione quindi dalla forma grave di patologia infiammatoria. Quindi ci sono dei processi in caso di emergenza che devono essere assolutamente velocizzati e pertanto, il pre-print ha sicuramente vantaggi.

"Ideale" dovrebbe essere disegnato per confutare l’ipotesi: assumo un’ipotesi, l’esperimento sperimentale e poi faccio esperimenti che gli vanno contro: e se tanti esperimenti non confutano l’ipotesi allora quest’ultima è molto forte. La cosa peggiore è affezionarsi all’ipotesi: poi trovi il revisore anonimo che ti fa crollare completamente la tua ipotesi con un esperimento per confutarlo.

Uno scienziato deve procedere serenipeditamente: serendipità = romanzi in cui un team cerca un tesoro e poi si imbattono in qualcosa di più interessante rispetto a ciò che si erano proposti di perseguire. È così che procede la scienza: tu fai un’ipotesi sperimentale, fai un esperimento e ti dà tutto un altro risultato.

Tantissime volte puoi arrivare a conoscere degli aspetti ancora più innovativi rispetto all’ipotesi che ti eri dato, in modo casuale ti sei imbattuto in un risultato scientifico che mai ti eri prefissato. Ecco che significa procedere serendipicamente e ciò implica il fatto che NON dobbiamo mai affezionarci all’ipotesi.

Ad esempio, studio la mioglobina di un organismo acquatico, la sequenzio e la confronto con una proteina umana e noto una grande somiglianza: scopro così una proteina che controlla nel cervello umano il quantitativo di ossigeno a livello cerebrale. Questo è ragionare serendipicamente.

Analisi e sviluppo di farmaci

Quando parleremo di analisi e sviluppo di farmaci, ci sono varie fasi e ovviamente c’è una fase che si chiama "ricerca di base" che fanno tutti gli enti no profit o enti universitari che, fatta questa ricerca, può decidere di entrare nella fase di sviluppo di farmaci brevettando alcune molecole, magari quelle che hanno dato più risultati nella fase di ricerca di base. Le fasi di sviluppo di un farmaco vengono messe in atto SOLO CON MOLECOLE BREVETTATE.

Parte di questo corso riguarda anche gli OGM: microrganismi geneticamente modificati, animali e una pianta. In particolare le piante OGM non verranno studiate in altri corsi quindi ci sarà un approfondimento perché di fatto sono i prodotti maggiormente commercializzati.

Il concetto di OGM è un concetto molto ampio che oggi ricomprende anche questi vaccini: oggi i vaccini a disposizione sono 3, due a RNA e uno usa un vettore adenovirus ed è un vaccino a DNA.

Quindi nei primi due casi uso il sistema di traduzione delle cellule per sintetizzare la SPIKE; nel terzo caso introduco un gene che trascrive un m^RNA che tradurrà una proteina. Quindi di fatto sto modificando geneticamente le mie cellule, soprattutto nel terzo caso. È la prima volta che sono stati commercializzati i vaccini adenovirus perché è il modo più rapido per sviluppare un vaccino.

Il metodo che prevede la somministrazione di una proteina spike ricombinante o anticorpi, è più lento e costoso e non posso tenere conto delle varianti in modo rapido. Quindi oggi è stata introdotta una nuova tecnologia commercializzata e per noi biotecnologi è un cambiamento epocale.

Inoltre adesso i no vax si stanno mettendo in risalto magari prima sconosciuti (es amici, parenti) quindi stiamo assistendo ad una divisione all’interno della popolazione. Oggi è fondamentale fare il punto su quello che è scienza e su quello che non lo è. Ciò non emerge solo con il COVID ma anche con gli OGM, per esempio il preconcetto che il cibo OGM fa male ed è più pericoloso del cibo naturale. Se non ci fosse questa convinzione non ci sarebbero le tre fasce di prezzo: cibo biologico, tradizionale e OGM (prezzo decrescente); ma non ci sono rilevanze scientifiche per confermare ciò! È frutto di disinformazione.

Esistono controlli in Europa sugli OGM che sono proprio appartenenti all’ambito biotecnologico. Dai geni alle proteine abbiamo la possibilità di avere sintesi proteica a livello dei ribosomi: quando un polipeptide esce dal ribosoma, sperimenta una soluzione acquosa (citosol) e assume la sua struttura 3D quindi comincia a ripiegarsi.

Bioinformatica e machine learning

Gli studi della bioinformatica sono importanti oggi: noi abbiamo a disposizione un’enorme quantità di dati, dati che derivano dai genomi di tutti gli organismi viventi che abbiamo sequenziato, abbiamo info sull’epigenetica e sulle sequenze proteiche.

Applicazioni bioinformatica:

• Allineamenti e multiallineamenti;
• Ricerca di similarità;
• Evoluzione molecolare, filogenesi;
• Genomica comparata;
• Predizione di elementi regolatori (promoter, enhancer, ecc);
• Predizione di geni;
• Predizione di strutture di RNA;
• Predizione e analisi di strutture proteiche.

Abbiamo un gene: conoscendo la struttura del gene possiamo supporre la struttura della proteina che può essere prodotta ma in realtà possono essere tradotte diverse proteine in base allo splicing o modificazioni post-traduzionali: ecco perché il database delle sequenze proteiche è diverso da quello del genoma.

Machine learning serve a desumere una serie di informazioni significative da dati sperimentali estremamente "rumorosi" o da un numero di dati sperimentali talmente elevato che io non sono in grado di discernere. Per esempio, faccio analisi spettroscopica di una miscela di composti: dando ad un software tutti gli spettri delle singole componenti purificate, in qualche modo si riesce ad avere un’analisi o indicazione se la cellula sta sintetizzando più proteine piuttosto che lipidi ecc.

Il machine learning è una sorta di black box: vedono lo spettro come una serie di numeri, non ha di fatto significato biologico; quindi deve essere sempre avere a fianco un biochimico ad esempio che ti dice se quel dato lo devi considerare o meno, se ha un determinato peso o altro.

Cos’è il machine learning?

"Il Machine Learning permette ai computer di imparare dall’esperienza; c’è apprendimento quando le prestazioni del programma migliorano dopo lo svolgimento di un compito o il completamento di un’azione." Questo accade anche quando l’esperienza è negativa o l’azione è sbagliata: come gli esseri umani, anche le macchine diventano capaci di imparare dai propri errori.

Per comprendere che cos’è il Machine Learning e a che cosa serve è utile sottolineare le differenze tra intelligenza artificiale, Machine Learning e Deep Learning:

• L’Intelligenza Artificiale (AI) ha l’obiettivo di costruire macchine capaci di compiere compiti caratteristici dell’intelligenza umana, simulandone quindi le capacità cognitive;
• Il Machine Learning (ML) realizza programmi di intelligenza artificiale che possono autonomamente scrivere altri programmi per interpretare i dati e prevedere risultati;
• Il Deep Learning (DL) è l’apprendimento "profondo" che utilizza le reti neurali artificiali multistrato: sono algoritmi che imitano le strutture e il funzionamento del cervello e sono in grado di elaborare un dato iniziale in numerosi passaggi collegati tra loro, simulando il modo in cui gli esseri umani tendono a suddividere un compito complesso in diverse fasi.

Il Machine Learning fa già parte della nostra vita quotidiana. Lo utilizzano, per esempio, i motori di ricerca su Internet: i risultati che otteniamo derivano da algoritmi che elaborano modelli e schemi di utilizzo delle chiavi di ricerca, così come anche per i suggerimenti che ci vengono offerti.

Teoria di Darwin e genomica

La teoria di Darwin in realtà è scorretto definirla come "teoria" poiché oggi è stata dimostrata dal punto di vista genomico attraverso la genomica comparata. Ciò che abbiamo aggiunto, però, è il concetto di epigenetica (qualcosa al di sopra del gene).

Ricorda che l’RNA può assumere strutture 3D molto più complesse della semplice doppia elica del DNA: la prima molecola che è nata dal brodo primordiale è proprio l’RNA, in grado di fare sintesi di proteine ed è una attività ancora presente oggi (ribozima). Le strutture proteiche sono costituite da 20 AA diversi, ma le strutture delle proteine sono quanto mai diverse, specifiche e versatili. Ogni proteina è un "individuo" che va conosciuto, bisogna comprenderne tutti i dettagli dal punto di vista funzionale e molecolare.

La maggior parte dei farmaci ha come target le proteine. Quindi l’analisi delle strutture proteiche aiuta tanto nel processo di comprensione della funzione della proteina, o del meccanismo molecolare (riconoscimento proteina – recettore) e chiaramente aiuta tantissimo nel processo di drug design: disegno dei farmaci. Già in un semplice microrganismo poiché tutto funzioni nulla è lasciato al caso: ogni elemento, ogni macromolecola deve agire in modo armonico.

Omeostasi e sviluppo di farmaci

Ogni interazione che avviene all’interno delle nostre cellule è specifica (proteina-proteina; recettore-proteina) e queste interazioni sono alla base dell’omeostasi cellulare. Le proteine determinano la forma e la struttura delle cellule e sono i principali strumenti del riconoscimento molecolare e della catalisi.

Omeostasi è il mantenimento di qualsiasi molecola inorganica, molecola organica o macromolecola biologica entro determinate concentrazioni ben definite. Es. omeostasi dello zucchero, del ferro, emoglobina (macromolecola biologica) che deve entrare in un range di concentrazione. Ci sono tutti parametri che possiamo notare in un’analisi biochimica e fisica.

Omeostasi deriva da uno stato stazionario dinamico: quell’emoglobina che è in quel momento presente nel sangue è in uno stato stazionario dinamico, non è in equilibrio: tutte le proteine quando vengono degradate poi vengono nuovamente sintetizzate. Quindi questo stato porta ad una concentrazione apparentemente fissa, ma in realtà si parla di stato stazionario dinamico. Idem per il glucosio: tanto ne consumo e tanto ne assumo con l’alimentazione.

Anche il numero di cellule deve mantenersi costante: un qualsiasi organo è composto da un numero di cellule che deve mantenersi in qualche modo tale. Il C.elegans mantiene un intero numero di cellule che danno costanza al suo corpo grazie a questo organismo si è scoperto che le nostre cellule hanno un ciclo di vita preciso: il processo apoptotico si attiva a livello genico quando necessario. Abbiamo cellule che invecchiano, e in queste cellule si attivano dei geni che portano all’apoptosi e al contempo ci deve essere una cellula staminale che si sta differenziando e che va a sostituire la cellula morta.

Quindi anche per le cellule il concetto di omeostasi è importante. Quando la cellula perde la capacità di apoptosi e cresce in modo incontrollato allora otteniamo una cellula tumorale: in molti tumori le cellule perdono la capacità di morte programmata oltre che la compromissione della funzionalità cellulare, compromettendo pertanto la funzione dell’organo che invadono.

Drug design

Le categorie di sviluppo del farmaco si dividono: ligand-base drug design (disegno del farmaco basato sullo studio del ligando, il ligando è una molecola in grado di legare una biomolecola e formare un complesso in grado di svolgere una funzione biologica) di solito si usa una molecola (farmacofaro) che si è scoperto, in natura, avere un effetto (acido acetilsalicico), quindi quando ho la struttura di questa molecola posso modificare i suoi gruppi funzionali e faccio una library di potenziali farmaci che derivano da quel farmacofaro iniziale (ovvero il mio ligando).

La progettazione di farmaci basata su leganti (o progettazione di farmaci indiretti) dipende dalle informazioni di diverse molecole che si legano al bersaglio biologico di interesse. Queste diverse molecole potrebbero essere utilizzate anche per ottenere un modello di farmacoforo che definisca le caratteristiche strutturali minime necessarie, che una molecola dovrebbe avere in modo da legarsi al bersaglio. In altre parole, un modello del bersaglio biologico potrebbe anche essere ingegnerizzato sulla base delle informazioni di ciò che si lega ad esso, e questo modello consecutivamente potrebbe anche fornire la base per lo sviluppo di nuove molecole che interagiscono con il bersaglio.

Attraverso la library che ottengo, posso vedere se ho migliorato le caratteristiche di inibizione di un enzima, ad esempio. Per esempio l’ibuprofene è stato disegnato come inibitore della cicloossigenasi. Ho il ligando ma non conosco il target del ligando: allora modifico il ligando e faccio il ligand base e vado a vedere su colture cellulari.

Se ho invece la struttura 3D del target e conosco il sito attivo o il ligand bind pocket (dove si va a legare il ligando) allora faccio un target-base drug design disegno il farmaco sulla base della struttura del target. In questo caso parlo sempre di farmacoforo ma non deriva da alcun modello naturale, è completamente sintetizzato.

Attraverso la conoscenza tridimensionale dell’obiettivo (target) del farmaco (un recettore su una cellula, un enzima col quale il farmaco deve interferire), si possono selezionare le molecole che, sulla base della loro struttura, hanno elevata probabilità di legarvisi. Talvolta è possibile disegnare la molecola al computer se si conoscono bene le caratteristiche che dovrebbe avere. Drug design.

Il drug design è un approccio molto utile per la creazione di un farmaco, che viene disegnato sulla base del target biologico col quale vuole interferire, in genere una molecola chiave del processo che bisogna fermare o regolare all’interno dell’organismo oppure, nel caso di una malattia infettiva, un elemento fondamentale per la replicazione del batterio o virus. Il farmaco viene in