Biochimica e biologia molecolare - meccanismo della reazione enzimatica

SITO ATTIVO DELL'ENZIMA

Le parti sulla molecola dell'enzima su cui le specie reagenti si accentrano sono regioni ben delimitate che vengono definite siti attivi. Questi siti occupano sull'enzima una parte assai limitata rispetto alla superficie totale della molecola enzimatica e risultano dal concorso di aminoacidi, in particolare le loro catene laterali, che nella struttura primaria sono assai lontani fra di loro ma ravvicinati a seguito della struttura tridimensionale che l'enzima assume. Nel sito attivo per alcuni enzimi si distingue un sito di legame su cui viene ad ancorarsi il substrato ed un sito catalitico in cui si compie la reazione, entrambi i siti suscettibili di continua modificazione conformazionale nel corso della reazione.

Per comprendere la modalità di interazione enzima-substrato sono stati proposti alcuni modelli. Uno di questi è chiamato chiave-serratura, in cui la serratura è l'enzima e la chiave è il substrato.

edovviamente la chiave potrà inserirsi solo se la serratura avrà una forma confacente e viceversa. Un secondo modello è definito adattamento indotto. E' stato formulato dopo lo sviluppo della teoria del complesso enzima-substrato e prevede che il sito attivo si formi solo dopo che il substrato ha preso contatto con l'enzima e quest'ultimo di conseguenza si sia modificato strutturalmente. Con lo sviluppo degli elaboratori elettronici che permette di creare innumerevoli modelli molecolari ci si rende sempre più conto di quanto complessa sia la dinamica a cui va incontro la molecola dell'enzima durante la catalisi e quindi quanto ancora scarsa sia l'informazione al riguardo. FATTORI CHE INFLUENZANO L'ATTIVITÀ ENZIMATICA Li possiamo così suddividere: 1) concentrazione dell'enzima; 2) concentrazione del substrato; 3) concentrazione dei cofattori; 4) concentrazione idrogenionica del mezzo (pH); 5) temperatura; 6) effettori(attivatori ed inibitori). Nell'esaminare ciascuno di questi fattori si presuppone di mantenere costanti gli altri. La velocità della reazione è direttamente proporzionale alla concentrazione dell'enzima. La cinetica della reazione catalizzata in funzione della concentrazione dell'enzima sarà rappresentata da una retta. Il discostamento da questa cinetica sarà indice di fattori di disturbo, quali la presenza di inibitori o attivatori. Si definisce come attività specifica di un enzima la mole di substrato che scompaiono o di prodotto della reazione che si formano nell'unità di tempo per su intervento di una determinata quantità di proteina (di solito l'attività specifica è espressa come μmoli di prodotto della reazione formate in un secondo da mg di proteina). Nota la massa molecolare dell'enzima in questione, laddove l'enzima sia in forma pura le moli di prodotto di reazione per secondo eper mole di enzima defiscono il numero di turnover che sarà una misura della velocità di ricambio sulla proteina enzimatica delle molecole di substrato ed indirettamente della affinità delLa cinetica della reazione catalizzata in funzione della concentrazione del substrato è2) rappresentata da una retta solo per concentrazioni basse di substrato, espresso in moli, e si discosta sempre più da questo andamento quanto più elevata sarà questa concentrazione sino alla scomparsa di qualsiasi relazione. Nelaa totalità la curva della velocità di reazione sarà uniperbole rettangola in cui si definirà come velocità massimale (V ) la velocità a cui la reazionemaxsi rende indipedente da [S], che si configura con quella concentrazione di substrato in grado di saturare completamente tutti i siti attivi presenti sull'enzima e per la quale la concentrazione dell'enzima e la concentrazione del complesso ES

si eguagliano. Questa velocità è chiamata anche velocità di saturazione. Dalla curva è possibile ricavare la velocità semimassimale (1/2V) a cui corrisponde un definito valore di [S]. Questo valore sarà specifico per ogni enzima emax per ogni substrato su esso agisce ed è definito come costante di Michaelis o Km, numericamente uguale a quella concentrazione di S a cui l'enzima è saturato per metà dal suo substrato. La relazione matematica che lega che la velocità all'istante con [S] e (V) è la seguente:

maxV = V [S]/ Km + [S]0 max

Se poniamo V uguale a 1/2 V, l'equazione diventa:

0 maxKm + [S] = 2 [S] da cui Km = [S]

La Km è misura dell'attrazione che l'enzima ha per il suo substrato e quindi con approssimazione della sua affinità per il substrato. Valori elevati di Km sono indice di scarsa attrazione, l'opposto vale-1 -6 per valori piccoli. I valori di Km sono

Compresi fra 10 e 10 M. Esempio la glucoso cinasi delfegato (Km 20 mM) e l'esorcinasi del cervello (Km 0.05 mM) e la concentrazione ematica del glucoso a digiuno (5 mM). Altro esempio è il seguente: Bere metanolo può essere fatale. Il metanolo di per sé non è tossico, ma nel fegato per azione dell'alcool deidrogenasi viene convertito in formaldeide, altamente tossica perché derivatizza gruppi aminici presenti sulle proteine. L'alcool deidrogenasi normalmente ossida l'etanolo ad acetaldeide utilizzando come accettore dell'idrogeno+ rimosso il NAD che legandosi alla deidrogenasi funge da coenzima. L'antidoto contro l'avvelenamento da metanolo è rappresentato dalla somministrazione di bevande alcooliche, in quanto l'alcool deidrogenasi ha alta affinità per l'etanolo ma molto bassa per il metanolo; di conseguenza in presenza di un eccesso di etanolo la deidrogenasi preferenzialmente

ridurrà NAD utilizzando l'idrogeno dell'etanolo anziché del metanolo che non potendo essere ossidato verrà eliminato con le urine. 3) CONCENTRAZIONE DEI COFATTORI È ovvio che una ridotta disponibilità di coenzimi o difficoltà dell'enzima a legarsi al proprio gruppo prostetico si risolverà in una ridotta capacità catalitica dell'enzima. Il principale regolatore della disponibilità di cofattori è la dieta in quanto l'uomo non è capace di sintesi delle vitamine o ne forma i precursori ma non è in grado di convertire questi in vitamina (Provitamina D) oppure necessita del precursore della vitamina che gli è fornito dall'esterno e quindi converte questo precursore in vitamina (Provitamina A: alfa e beta carotene convertiti a livello intestinale ed epatico in vitamina attiva). Ne consegue che una dieta carente di vitamine, in particolare del gruppo B, si associa a deficit di.

attività dell'enzima in cui la vitamina è parte come componente del cofattore. Es: la malattia beri-beri per deficit di vit. B1, la pellagra per deficit di niacina, la scorbuto per deficit di vit. C.

4) CONCENTRAZIONE IDROGENIONICA: l'effetto del pH sulla velocità della reazione enzimatica è strettamente correlato con la natura protidica dell'enzima ed in particolare alla presenza sulla proteina enzimatica di cariche elettriche portate dalle catene laterali degli aminoacidi a loro volta responsabili della struttura terziaria della proteina e spesso anche di quella quaternaria. Come conseguenza vi sarà per ogni enzima un particolare valore di pH al quale l'enzima raggiunge la conformazione più idonea ad interagire con il substrato. Inoltre, laddove il substrato sia ionizzabile, il suo grado di ionizzazione potrà renderlo più o meno idoneo ad interagire con l'enzima. La curva della velocità della reazione

inizia a diminuire l'attività dell'enzima. Questo è dovuto al fatto che il pH influisce sulla struttura tridimensionale dell'enzima, che a sua volta determina la sua capacità di legare il substrato e catalizzare la reazione chimica. Per esempio, se il pH è troppo acido o troppo basico rispetto al pH ottimale dell'enzima, le cariche elettriche presenti nella sua struttura possono essere alterate, compromettendo la sua funzionalità. Di conseguenza, l'attività dell'enzima diminuisce. È importante notare che ogni enzima ha il suo pH ottimale specifico, che dipende dalla sua struttura e dalla natura del substrato con cui interagisce. Questa specificità del pH ottimale consente agli organismi di regolare l'attività degli enzimi in base alle condizioni ambientali e alle esigenze metaboliche. In conclusione, il pH ottimale dell'enzima è il valore di pH in cui l'attività dell'enzima è massima. Questo valore varia a seconda dell'enzima e del substrato coinvolto, ma di solito si trova intorno alla neutralità per gli enzimi dei tessuti animali. Tuttavia, ci sono eccezioni come la pepsina e la tripsina, che hanno pH ottimali diversi per adattarsi ai loro specifici ambienti di lavoro nel sistema digestivo.

l'attività va rapidamente a zero. Un'eccezione è rappresentata dalla amilasi salivare che agisce in modo pressoché ottimale fra pH 4.5 e 9, ambito che permette di resistere al progressivo inacidimento del bolo alimentare nello stomaco. Gli enzimi dei tessuti vegetali hanno sovente un pH ottimale più acido di quello dei tessuti animali e questo vale anche per i funghi.

5) EFFETTO DELLA TEMPERATURA

La temperatura è un fattore dirimente per una reazione chimica: un suo aumento o diminuzione comporta accelerazione o rallentamento della velocità della reazione. Tuttavia gli enzimi sono delle proteine ed il fattore termico influenza moltissimo la loro conformazione potendo modificarla fino al punto da distruggere irreversibilmente le caratteristiche naturali (denaturazione). Di conseguenza la curva della cinetica della reazione enzimatica sarà asimmetrica, in quanto ci sarà un aumento progressivo fino ad un valore in gradi centigradi.

intorno a 30-37°C con una rapida caduta oltre i 40°C ed annullamento totale intorno ai 60°C. Di solito un aumento di 1 grado porta ad un aumento della velocità della reazione del 10% ed un aumento di 10 gradi un raddoppio. Esistono tuttavia enzimi attivi ancora a 100°C localizzati nei batteri termofili; inoltre in generale gli enzimi dei tessuti vegetali sono maggiormente resistenti alle temperature elevate rispetto agli enzimi dei tessuti animali. La denaturazione degli enzimi con il calore ha trovato largo impiego nei processi tecnologici di conservazione degli alimenti. La pastorizzazione (T 70-80°C) ha lo scopo di inattivare gli enzimi dei microrganismi patogeni; la sterilizzazione (T <120°C) ha lo scopo di distruggere ogni forma vivente compresi i batteri termofili esporogeni. La surgelazione ha uno scopo simile rallentando tutte le reazioni enzimatiche di eventuali microorganismi patogeni e allo stesso tempo di preservare le qualità organolettiche dei.cibi stessi. 6) EFFETTORI: effetto degli inibitori sulla attività dell'enzima Una delle funzioni dei farmaci è quella di rallentare od