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Biochimica e biologia molecolare - meccanismo della reazione enzimatica

Appunti di Biochimica e biologia molecolare per il corso del professor Ghigo. Nello specifico gli argomenti trattati sono i seguenti: gli enzimi, l'etimologia della parola enzima, la possibilità di modificazione dell'enzima nel corso della reazione, la classificazione, la specificità e la localizzazione.

Esame di Biochimica e biologia molecolare docente Prof. E. Ghigo

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complesso enzima-substrato in continua modificazione fino a fornire il prodotto finale che per

l’enzima avrà scarsa affinità e quindi da questo si separerà. In ognuno degli stadi intermedi l’enzima

assumerà forme conformazionali differenti e del pari sarà perle specie differenti fino a raggiungere

forme che per l’enzima non sono più idonee a legare la specie reagente e che per il substrato

saranno sempre più prossime al prodotto della reazione. Perognuno di questi stadi sarà richiesta una

certa energia di attivazione tuttavia molto inferiore a quella totale indispensabile per la formazione

del prodotto e raggiungibile in tampi infinitamenti inferiori. Ne consegue che per la reazione nella

sua completezza l’energia di attivazione non sarà di molto inferiore a quella richiesta se la reazione

avvenisse in assenza di catalizzatore ma il tempo richiesto sarà di migliaia di volte inferiore e quindi

la velocità di miglia di volte più elevata. In definitiva il ruolo svolto dall’enzima si traduce in un

aumento cospicuo del numero di urti efficaci per unità di tempo, aumento che è da rifersi ad un

aumento della concentrazione delle specie reattive in punti ben definiti che costituisce uno dei

requisiti per lo svolgimento di una reazione.

SITO ATTIVO DELL’ENZIMA

Le parti sulla molecola dell’enzima su cui le speci reagenti si accentrano sono regioni ben

delimitate che vengono definite siti attivi. Questi siti occupano sull’enzima una parte assai limitata

rispetto alla superficie totale della molecola enzimatica e risultano dal concorso di aminoacidi, in

particolare le loro catene laterali, che nella struttura primaria sono assai lontani fra di loro ma

ravvicinati a seguito della struttura tridimensionale che l’enzima assume. Nel sito attivo per alcuni

enzimi si distingue un sito di legame su cui viene ad ancorarsi il substrato ed in sito catalitico in cui

si compie la reazione, entrambi i siti suscettibili di continua modificazione conformazionale nel

corso della reazione.

Per comprendere la modalità di interazione enzima-substrato sono stati proposti alcuni modelli. Uno

di questi è chiamato chiave-serratura, in cui la serratura è l’enzima e la chiave è il substrato ed

ovviamente la chiave potrà inserirsi solo se la serratura avrà una forma confacente e viceversa. Un

secondo modello è definito adattamento indotto. E’stato formulato dopo lo sviluppo della teoria del

complesso enzima-substratoe prevede che il sito attivo si formi solo dopo che il substrato ha preso

contatto con l’enzima e quest’ultimo di conseguenza si sia modificato strutturalmente. Con lo

sviluppo degli elaboratori elettronici che permette di creare innumerevoli modelli molecolari ci si

rende sempre più conto di quanto complessa sia la dinamica a cui va incontro la molecola

dell’enzima durante la catalisi e quindi quanto ancora scarsa sia l’informazione al riguardo.

FATTORI CHE INFLUENZANO L’ATTIVITA’ ENZIMATICA

Li possiamo così suddividere:

1) concentrazione dell’enzima;

2) concentrazione del substrato;

3) concentrazione dei cofattori;

4) concentrazione idrogenionica del mezzo (pH);

5) temperatura;

6) effettori (attivatori ed inibitori).

Nell’esaminare ciascuno di questi fattori si presuppone di mantenere costanti gli altri.

la velocità della reazione è direttamente proporzionale alla concentrazione dell’enzima. La

1) cinetica della reazione catalizzata in funzione della concentrazione dell’enzima sarà

rappresentata da una retta. Il discostamento da questa cinetica sarà indice di fattori di disturbo,

quali la presenza di inibitori od attivatori. Si definisce come attività specifica di un enzima la

moli di substrato che scompaiono o di prodotto della reazione che si formano nell’unità di

tempo per su intervento di una determinata quantità di proteina ( di solipo la attività specifics è

moli

espressa come di prodotto della reazione formate in un secondo da mg di protide). Nota la

massa molecolare dell’enzima in questione, laddove l’enzima sia in forma pura le moli di

prodotto di reazione per secondo e per mole di enzima defiscono il numero di turnover che sarà

una misura della velocità di ricambio sulla proteina enzimatica delle molecole di substrato ed

indirettamente della affinità del

La cinetica della reazione catalizzata in funzione della concentrazione del substrato è

2) rappresentata da una retta solo per concentrazioni basse di substrato, espresso in moli, e si

discosta sempre più da questo andamento quanto più elevata sarà questa concentrazione sino

alla scomparsa di qualsiasi relazione. Nelaa totalità la curva della velocità di reazione sarà un

iperbole rettangola in cui si definirà come velocità massimale (V ) la velocità a cui la reazione

max

si rende indipedente da [S], che si configura con quella concentrazione di substrato in grado di

saturare completamente tutti i siti attivi presenti sull’enzima e per la quale la concentrazione

dell’enzima e la concentrazione del complesso ES si eguagliano. Questa velocità è chiamata

anche velocità di saturazione. Dalla curva è possibile ricavare la velocità semimassimale (1/2

V ) a cui corrisponde un definito valore di [S]. Questo valore sarà specifico per ogni enzima e

max

per ogni substrato su esso agisce ed è definito come costante di Michaelis o Km, numericamente

uguale a quella concentrazione di S a cui l’enzima è saturato per metà dal suo substrato. La

relazione matematica che lega che la velocità all’istante con [S] e (V ) è la seguente:

max

V = V [S]/ Km + [S]

0 max

Se poniamo V uguale a 1/2 V , l’equazione diventa:

0 max

Km + [S] = 2 [S] da cui Km = [S]

La Km è misura dell’attrazione che l’enzima ha per il suo substrato e quindi con approssimazione

della sua affintà per il substrato. Valori elevati di Km sono indice di scarsa attrazione,l’opposto vale

-1 -6

per valori piccoli. I valori di Km sono compresi fra 10 e 10 M. Esempio la glucoso cinasi del

fegato (Km 20 mM) e l’esosocinasi del cervello (Km 0.05 mM) e la concentrazione ematica del

glucoso a digiuno (5 mM). Altro esempio è il seguente: Bere metanolo può essere fatale. Il

metanolo di per sé non è tossico, ma nel fegato per azione dell’alcool deidrogenasi viene convertito

in formaldeide, altamente tossica perché derivatizza gruppi aminici presenti sulle proteine. L’alcool

deidrogenasi normalmente ossida l’etanolo ad acetaldeide utilizzando come accettore dell’idrogeno

+

rimosso il NAD che legandosi alla deidrogenasi funge da coenzima. L’antidoto contro

l’avvelenamento da metanolo è rappresentato dalla somministrazione di bevande alcooliche, in

quanto l’alcool deidrogenasi ha alta affinità per l’etanolo ma molto bassa per il metanolo; di

conseguenza in presenza di un eccesso di etanolo la deidrogenasi preferenzialmente ridurrà NAD

utilizzando l’idrogeno dell’etanolo anziché del metanolo che non potendo essere ossidato verrà

eliminato con le urine.

3) CONCENTRAZIONE DEI COFATTORI

E’ ovvio che una ridotta disponibilità di coenzimi o difficoltà dell’enzima a legarsi al proprio

gruppo prostetico si risolverà in una ridotta capacità catalitica dell’enzima. Il principale regolatore

della disponibilità di cofattori è la dieta in quanto l’uomo non è capace di sintesi delle vitamine o ne

forma i precursori ma non è in grado di convertire questi in vitamina (Provitamina D) oppure

necessita del precursore della vitamina che gli è fornito dall’esterno e quindi converte questo

precursore in vitamina (Provitamina A: alfa e beta carotene convertiti a livello intestinale ed epatico

in vitamina attiva). Ne consegue che una dieta carente di vitamine, in particolare del gruppo B, si

associa a deficit di attività dell’enzima in cui la vitamina è parte come componente del cofattore.

Es: la malattia beri-beri per deficit di vit. B1, la pellagra per deficit di niacina, la scorbuto per

deficit di vit. C.

4) CONCENTRAZIONE IDROGENIONICA

L’effetto del pH sulla velocità della reazione enzimatica è strettamente correlato con la natura

protidica dell’enzima ed in particolare alla presenza sulla proteina enzimatica di cariche elettriche

portate dalle catene laterali degli aminoacidi a loro volta responsabili della struttura terziaria della

proteina e spesso anche di quella quaternaria. Come conseguenza vi sarà per ogni enzima un

particolare valore di pH al quale l’enzima raggiunge la conformazione più idonea ad interagire con

il substrato. Inoltre, laddove il substrato sia ionizzabile, il suo grado di ionizzazione potrà renderlo

più o meno idoneo ad interagire con l’enzima.

La curva della velocità della reazione in funzione del pH è normalmente una curva a campana in cui

il picco segnalerà il valore di pH a cui l’attività dell’enzima è massima; questo valore viene definito

pH ottimale dell’enzima nei riguardi di un determinato substrato. Per gli enzimi dei tessuti animali

il pH ottimale è intorno alla neutralità e coincide da vicino con il pH fisiologico intracellulare ed

extracellulare; fanno eccezione alcuni enzimi in particolare la pepsina, proteasi presente nel lume

gastrico che è attiva ottimalmente intorno a pH 1.2-2, pH caratteristico del succo gastrico; la

tripsina anche questa presente nel canale digerente in particolare attiva nel duodeno, che ha un pH

ottimale intorno ad 8. Queste differenze sono preordinate ad avere enzimi che lavorano

elettivamente in definiti e differenti segmenti del canale digerente. Di solito il pH ottimale copre un

range ristretto di valori di pH, a destra ed a sinistra del quale l’attività va rapidamente a zero. Una

eccezione è rappresentata dalla amilasi salivare che agisce in modo pressocchè ottimale fra pH 4.5 e

9, ambito che permette di resistere al progressivo inacidimento del bolo alimentare nello stomaco.

Gli enzimi dei tessuti vegetali hanno sovente un pH ottimale più acido di quello dei tessuti animali e

questo vale anche per i funghi.

5) EFFETTO DELLA TEMPERATURA

La temperatura è un fattore dirimente per una reazione chimica;: un suo aumento o diminuzione

somporta accelerazione o rallentamento della velocità della reazione. Tuttavia gli enzimi sono delle

proteine ed il fattore termico influenza moltissimo la loro conformazione potendo modificarla fino

al punto da distruggere irreversibilmente le caratteristiche naturali (denaturazione). Di conseguenza

la curva della cinetica della reazione enzimatica sarà asimmetrica, in quanto ci sarà un aumento

progressivo fino ad un valore in gradi centigradi intorno a 30-37 con una rapida caduta oltre i 40

gradi ed annullamento totale intorno ai 60 gradi. Di solito un aumento di 1 grado porta au un

aumento della velocità della reazione del 10% ed un aumento di 10 gradi un raddoppio. Esistono

tuttavia enzimi attivi ancora a 100 gradi localizzati nei batteri termofili; inoltre in generale gli

enzimi dei tessuti vegetali sono maggiormente resistenti alle temperature elevate rispetto agli

enzimi dei tessuti animali. La denaturazione degli enzimi con il calore ha trovato largo impiego nei

 o

processi tecnologici di conservazione degli alimenti. La pastorizzazione (T 70-80 C) ha lo scopo

 o

di inattivare gli enzimi dei microrganismi patogeni; la sterilizzazione (T <120 C) ha lo scopo di

distruggere ogni forma vivente compresi i batteri termofili esporigeni. La surgelazione ha uno scopo

simile rallentando tutte le reazioni enzimatiche di eventuali microorganismi patogeni e allo stesso

tempo di preservare le qualità organolettiche dei cibi stessi.

6) EFFETTORI: effetto degli inibitori sulla attività dell’enzima

Una delle funzioni dei farmaci è quella di rallentare od annullare una patologia in corso ricorrendo a

molecole naturali o di sintesi (chemioterapia). Spesso il ruolo primario di queste molecole è quello

di andare a colpire la causa primaria della patologia andando ad interagire con la funzionalità di

determinati enzimi ora sminuendola ora esaltandola. Individuare in qual modo il farmaco agisce

sull’enzima è quindi di notevole interesse nel campo farmacologico e clinico.

Gli effettori degli enzimi possono essere attivatori od inibitori. La attenzione dei ricercatori si è

appuntata soprattutto sui secondi, perché di più facile individuazione; tuttavia le conoscenze sul

meccanismo d’azione di questi sono alla base delle conoscenze sui primi poiché le leggi che

governano gli uni valgono anche per gli altri.

L’inibizione può essere fondamentalmente di due tipi (e di conseguenza gli inibitori si possono

raggruppare in due classi): reversibile ed irreversibile. Quest’ultima prevede che l’enzima rimanga

permanentemente inibito anche dopo allontanamento dell’effettore; è di solito indipendente dalla

concentrazione del substrato e si instaura in tempi relativamente lunghi; inoltre dà luogo alla

generazione di una nuova molecola che avrà proprietà sue del tutto differenti dall’enzima nativo.

Nel caso dell’inibizione reversibile, che è il più frequente in vivo, l’allontanamento dell’inibitore

comporta il ricupero pieno dell’attività; inoltre il fenomeno di inibizione si instaura assai

rapidamente Nell’ambito della inibizione reversibile l’inibitore può lavorare in competizione con il

substrato od indipendentemente da questo. Pertanto possiamo formulare la seguente classificazione:

inbitori irreversibili. Esempi di inibitori irreversibili sono il cianuro nei riguardi di enzimi che

1) portano um metallo pesante al centro di una struttura ciclica (citocromo ossidasi ed emoglobina

per quanto concerne il legame con l’ossigeno) oppure come metallo singolo legato direttamente

alla proteina (es. la xantinaossidasi che è un metallo protide legante ferro e molibdeno); in ogni

caso tuttavia il cianuro si lega al ferro solo se trivalente. Tuttavia il cianuro non è specifico per

questo tipo di legame potendo derivatizzare gruppi tiolici ed aldeidici presenti sui cofattori

legati all’enzima o sul substrato per formare la cianidrina corrispondente. Esempi di inibitore

irreversibile sono ancora: l’acido monoiodocetico, la monoiodoacetamide che derivatizzano in

modo irreversibile ed abbastanza selettivo gruppi tiolici (difiniamo così enzimi tiolici quelli che

portano gruppi SH reattivi riferibili alla presenza di uno o più residui di cisteina; alchilfosfati,

tra cui diisopropilfluorofosfato, fenilmetil solfonilfluoruro (PMSF), che derivatizzano gruppi

alcoolici in particolare quelli portati da serina (definiamo questi enzimi serina enzimi; esempi

sono la acetilcolinesterasi responsabile della degradazione del neurotrasmettitore acetilcolina, la

colinesterasi, molte proteasi del canale digerente, tripsina, chimotripsina, elastasi, e le proteasi

coinvolte nella coagulazione del sangue, tra cui si possono ricordare trombina, fattore X attivo,

fattore VII attivo ed altri.

inibitori reversibili di tipo competitivo e non competitivo, dove per competizione si intende

2) quella svolta dall’inibitore sul substrato nei riguardi del legame con l’enzima. Nel primo caso

inibitore non competitivo, l’inibitore ed il substrato non possono coesistere sull’enzima ed in

particolare sul suo sito catalitico; inoltre a concentrazioni crescenti di substrato l’inibizione

progressivamente verrà rimossa e tanto più quanto più elevata è l’affinità dell’enzima per il suo

substrato e quindi quanto più piccola è la Km dell’enzima per quel substrato. Nel secondo caso

questa coesistenza è possibile ma le proprietà catalitiche dell’enzima sono tuttavia

compromesse. Ne consegue che la presenza dell’inibitore sull’enzima, pur in mancanza di un a


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DETTAGLI
Corso di laurea: medicina e chirurgia
SSD:
Docente: Ghigo Ezio
Università: Torino - Unito
A.A.: 2013-2014

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher cecilialll di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biochimica e biologia molecolare e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Torino - Unito o del prof Ghigo Ezio.

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